עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז החוקר ברוכים הבאים י&quot;מ ועל ידי עמיתי בראון-Coxe דוקטורים מאוניברסיטת ייל MD.

חומרים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם חלבון - ליזוזים (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תליית 24 גם מגש ירידה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישיבה ירידה של 24 היטב מגש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microbatch התגבשות 96 מגש טוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגבשות פתרונות (או מסחרי זמין או תוצרת בית) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון גריז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל במזרק ללא Luer נעילת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות שקופיות Siliconized </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איטום אופטי קלטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרפין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-2 micropipette μL עם השמירה נמוכה טיפים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Professional מגבונים </li></ul> 1. תלוי / יושב נוהל Drop: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מסך ראשוני אפשר להשתמש מסכי זמין מסחרית כי לנצל את מטריצה ​​דלילה שלם שיטה העצרת של תנאי הניסוי. מטריצה ​​דלילה שלם שיטה עצרת מוטה על ידי נבחרים מן התנאים התגבשות ידוע מקרומולקולות (קרטר קרטר, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik וקים, 1991;. Jancarik et al, 1991). אם התנאי התגבשות כבר ידוע, מסך צר ניתן להרכיב, משנים את ריכוז ה-pH נמהר סביב פגע המקורי. נמהר הכי מוצלח הוא בדרך כלל פוליאתילן גליקול (PEG), ואחריו אמוניום סולפט. ביחד, שני אלה מזרזים להסביר כ -60% מכלל מזרזים macromolecular רשמה המשמש התגבשות (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות התגבשות שלך. בדרך כלל בתנאים אלה משולבים של סוכן מזרז, מלח מסוג כלשהו ו חיץ כדי להגדיר את ה-pH. במקרים מסוימים ניתן להוסיף תוספי במיוחד עבור החלבון של עניין. פתרון כל המניות צריך להיות מסונן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. חלק מהפתרון המניה עשוי להיות צמיגה מאוד (50% יתדות, גליצרול, PEG-MME, וכו &#39;). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.5 מ&quot;ל של 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 M NaCl כל אחד 0.1 M NaOAc pH 4.0, 4.3, 4.6 ו - 4.9 (סך של 24 פתרונות) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי מדגם חלבון שלך ולשמור על הקרח. מניות חלבון צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C, אלא אם כן חלבון עניין רגיש להקפיא / מחזורי ההפשרה (ואם כן, בחנות ב 4 ° C). ריכוז החלבון אופייניות הן בטווח של 5-50 מ&quot;ג / מ&quot;ל, עם ריכוזים גבוהים יותר בדרך כלל נותן תוצאות טובות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם 15min/18, 000xg / 4 ° C - חלבונים מסוימים נוטים לצבור חלקית לזרז צעד אחרי ההפשרה. אגרגטים אלה יכולים לקדם משקעים אמורפי של שאר מולקולות חלבון ולכן ספין מטה יסודית יבטיחו לך רק מולקולות מסיסים במדגם שלך. שמור חלבון על הקרח עד הקמת מגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון מן ספיגת שלה ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV. ריכוז החלבון ניתן לחשב מקריאת ספיגת מקדם הכחדה של החלבון. מקדם הכחדה יכול להיות מחושב באמצעות כלי ProtParam באתר Expasy: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בארות של 24 גם תלוי / יושב מגש עם ירידה של 500 μL פתרון נמהר על פי התוכנית מגש ההתקנה (תרשים 2B). צור גריז סיליקון טבעת מסביב לקצה של הבאר. הטבעת צריכה להיות פער קטן כדי למנוע הצטברות לחץ אוויר כמו כן נחרץ. בשנת טיפות ישיבה, אין צורך לשמן היטב מאז הוא חתום עם הקלטת (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שקופיות מכסים לנקות אותו עם תרסיס אוויר מרוכז, או מקצועי לנגב - אבק הימנעות יקל את הפרשנות של ירידה התגבשות ולמנוע זיהומים. עבור ישיבה טיפות, שקופיות לכסות לא רגילים. במקום זאת, גם מכיל מדף שעליו חלבון מזרז מעורבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כרכים שווה המדגם חלבון פתרון מאגר בשקופית לכסות. כמויות שונות של חלבון נמהר אולי ניסה כחלק מתהליך הייעול. שימוש יותר חלבון מאשר תוצאות נמהר בריכוז נטו של החלבון לירידה לאחר איזון, אשר יכול להיות רצוי לדלל דגימות חלבון, ו להאט נוקלאציה קריסטל או צמיחה. כל חומר נדיף אחר פתרון הירידה יהיה גם מרוכז בידי גורם אחד. כאשר pipetting החלבון פתרונות מאגר לשקופית לכסות, להיות זהיר מאוד כדי למנוע היווצרות בועה. זה בדרך כלל מתרחשת כאשר האוויר פוצצו מתוך פיפטה. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תליית ירידה: 2 טען μL של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ליזוזים ב-pH 0.02 NaOAc M 4.9 למרכז והחלק את הכיסוי ולהוסיף לו 2 μL הפתרון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יושב טיפה: טען 2 μL של פתרון ליזוזים 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​למרכז המדף ולהוסיף לו 2 μL של פתרון המאגר. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהפכו את השקופית לכסות בעדינות ולהניח אותה על הטבעת גריז על גבי הבאר. לחץ כלפי מטה בעדינות כך שהאוויר יכול להימלט מן הבאר דרך החריץ של שומן כדי יח&quot;צהאירוע אוויר בלחץ הצטברות היטב ולשמור אטום היטב. הצטברות לחץ האוויר בתוך הבאר יכול להעלות את השקופית לכסות, להתפשר על החותם היטב. בשיטה ירידה ישיבה, סרט שקוף ברור אופטית משמש כדי לכסות את הבארות. לפיכך, איטום בשיטה זו תתקיים כל שורה / עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל היטב הבא עד מגש שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המגש על ההתקנה - ביטול חלקיקי אבק זיהומים אחרים יכולים להפחית את זיהוי חיובי כוזב של גבישי חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גיליון הניקוד לתעד את הניסוי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגש בטמפרטורת הדגירה הרצויה, בדרך כלל בין 4 טמפרטורת החדר C ו-מעלות. 20 ° C הוא הכי מוצלח כלל. תשמרי על עצמך כדי להתמודד עם מגש בעדינות למנוע לרעוד. היזהר בעת פתיחת וסגירת הדלת חממה. תנודות או שינויי טמפרטורה במהלך ההעברה או הדגירה יכול למנוע הצמיחה קריסטל או להשפיע לרעה על איכות קריסטל. הלם קליטת החומר (קצף אריזה למשל) יכול לשמש ריפוד תחת מגשי קריסטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מגש עבור גבישים למחרת, ואחר כך כל כמה ימים, תמיד הטיפול מגשים עם טיפול. כל מסמך הממצאים מורפולוגיות ירידה גיליון ניקוד מסוים מגש. קריסטלים בדרך כלל לוקח 2-5 ימים להופיע, אם כי לעתים גבישים מופיעים הרבה יותר מהר (כמעט מיד) או מאוחר יותר (עד כמה חודשים!). לאחר התגבשות התנאים זוהו קצב הגידול של הגבישים ידוע, עדיף להשאיר את המגשים באין מפריע עד גבישים הופיעו גדל לפחות מחצית גודלו הסופי. השארת מגשי באין מפריע יכול להפחית את מספר האירועים נוקלאציה גביש, ומכאן לייצר מספר קטן של גבישים גדולים יותר. </li></ol> 2. Microbatch נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם חלבון והכנת נמהר הם כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס האוויר מגש microbatch חדש כדי למנוע אבק וחלקיקים גדולים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במגש microbatch, למלא שמן פרפין עד 3 מ&quot;מ גבוה (מספיק כדי לכסות את הבארות). הסר גישה של שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 1 μL של פתרון חלבון (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ליזוזים) לתוך השמן מראש מילא היטב - לוודא פיפטה את הפתרון ישירות לתחתית הבאר (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 1 μL של פתרון נמהר לבאר על פי התוכנית מגש ההתקנה (תרשים 2B) - לוודא טיפה שוקעת לתחתית הבאר נתיכים עם טיפה את החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר היטב הבא עד מגש שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלבים 11-14 של התלייה / יושב הליך ירידה. </li></ol> 3. נציג תוצאות: התגבשות נקרא בדרך כלל כמו צוואר הבקבוק של קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. מטריצה ​​דלילה שלמה מסך העצרת של התנאים מזרז בדרך כלל מייצרת סוגים שונים של צבירת משקעים של חלבונים, ביניהם אחד גבישים גדולים. אם חלבון או בריכוזים גבוהים מדי נמהר אפשר לראות חומר חום עם צורה וגודל לא ברורים (משקעים אמורפי). כאשר הפתרון הוא undersaturated, הירידה לעתים קרובות יהיה ברור לחלוטין ונטול כל סוג של משקעים. איור 3 מציג מספר דוגמאות לתופעות משקעים וקריסטלים (דסאו et al. 2006). תופעות המשקעים יותר עם ​​פרשנות מפורטת יותר ניתן למצוא בכתובת <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. עקרון התגבשות החלבון. עקרון התגבשות החלבון. בניסוי דיפוזיה אדי (א) כמויות שוות של נמהר וחלבונים נמצאים הירידה. מים יהיה מפוזר החוצה הן נמהר ריכוז חלבון יוכפל עד שיווי משקל יושג בין ירידה לבין פתרון המאגר. ב התגבשות אצווה (ב) נמהר ריכוז החלבון אינם משנים במהלך הניסוי. פוינט - חלבון נשאר undersaturated לא יכול להיווצר גבישים, B Point - נוקלאציה חלבון להתרחש, קריסטלים החלה להיווצר ואת הריכוז של חלבון בתמיסה טיפות הרוויה. C פוינט - חלבון משקעים, אבל עדיין עשוי לצמוח גבישים. (ג) התגבשות דיאליזה באמצעות ג&#39;ל פקוק נימי. קריסטלים להופיע מפזרת מלח מתוך המדגם חלבון (ו / או מפזרת נמהר לתוך המדגם חלבון) על פני תקע את הג&#39;ל. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תמציתי של ניסויים התגבשות טיפוסי חלבון. (א) נוהלי תלוי דיפוזיה אדי ירידה, יושב דיפוזיה אדי ירידה, וחלבון התגבשות microbatch. בכל מקרה, נפח קטן של מדגם חלבון מרוכז מעורב עם נפח שווה או קטן יותר של precipitanלא פתרון מותר לאזן. (ב) התגבשות של עוף ליזוזים, מגש 24 גם מוגדר עם ריכוזים שונים של נתרן כלורי (נמהר) עם 0.1 נתרן אצטט M כמו למאגר ב PHS שונים (4.0-4.9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תוצאות אופייניות של ניסוי התגבשות החלבון. (א) כמות המשקעים אמורפיים. כאשר חלבון או נמהר (או שניהם) נמצאים בריכוז גבוה. (ב) הפרדת פאזות. חלבון או אבקת רשאי להפריד לשלב שונה כאשר מעורבב עם מזרזים מסוימים בריכוז גבוה. (ג) גבישים רוד חלבון בצורת AtCSN7 שהושגו פוליאתילן גליקול 8000 ו אצטט מגנזיום (דסאו et al. 2006). (ד) גבישים ליזוזים שהושגו 1.0 M NaCl נתרן אצטט ו pH 4.9. (ה) תחת טיפות רווי בדרך כלל נשארים ברורים. צילום של משה דסאו.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במאמר זה אנו מתארים ולהפגין פרוטוקולים הנוכחי כללית התגבשות החלבון. מאז אותו הליך רב שלבי יש כמה שיקולים אחד צריך להיות מודע. כאשר עובדים עם כמויות קטנות מאוד (0.5-2 μL), ייבוש הירידה עקב התאדות הוא החשש העיקרי. לפיכך, מומלץ לעבוד בסביבה מבוקר היטב (עם זרימת אוויר נמוכה, ל?...

<table border="1">
		<tbody>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>L6876-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well VDX Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-142</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well Cryschem Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-158</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dow Corning Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Siliconized glass circle coverslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-231</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>100% paraffin oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-411</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-511</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-098</td>
<td>&nbsp;</td>	</tr>	</tbody>
		</table>

protein crystallization for x-ray crystallography

באמצעות מבנה תלת ממדי של מקרומולקולות ביולוגיות להסיק כיצד הם פועלים היא אחד התחומים החשובים ביותר של הביולוגיה המודרנית. הזמינות של מבנים ברזולוציה אטומית מספק הבנה עמוקה וייחודית של תפקוד החלבון, ומסייע לפענח את אופן פעולתו של התא החי. נכון להיום, 86% חלבון נתוני הבנק (rcsb-PDB) הערכים הם מבנים macromolecular שנקבעו באמצעות קרני רנטגן קריסטלוגרפיה. כדי לקבל גבישים מתאימים ללימודי קריסטלוגרפיים, מקרומולקולה (למשל חלבון, חומצות גרעין, חלבונים מורכבים או חלבונים מורכבים חומצת גרעין) חייבים להיות מטוהרים הומוגניות, או קרוב ככל האפשר אל ההומוגניות. ההומוגניות של התכשיר הוא גורם מפתח בהשגת גבישים כי diffract ל ברזולוציה גבוהה (Bergfors, 1999; מקפרסון, 1999). התגבשות דורש להביא את מקרומולקולה כדי רוויה. המדגם ולכן צריך להיות מרוכזים כדי הריכוז הגבוהה ביותר האפשרית מבלי לגרום להצטברות משקעים או של מקרומולקולה (בדרך כלל 2-50 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הצגת המדגם לסוכן מזרז יכול לקדם את נוקלאציה של גבישי חלבון בתמיסה, אשר עלולה לגרום תלת ממדי גבישים גדולים גדל מפתרון. ישנן שתי שיטות עיקריות להשיג גבישים: דיפוזיה אדי התגבשות אצווה. ב אדי דיפוזיה, ירידה המכיל תערובת של פתרונות נמהר וחלבון אטום בתא עם נמהר טהור. אדי מים ואז מפזרת את הירידה עד osmolarity הירידה ואת נמהר שווים (איור 1 א). התייבשות גורמת לירידה של ריכוז של חלבון איטי וגם מזרז עד שיווי המשקל מושגת, אידיאלי באזור נוקלאציה קריסטל של הדיאגרמה שלב. השיטה מסתמכת על אצווה להביא את החלבון ישירות לתוך אזור נוקלאציה על ידי ערבוב חלבון עם כמות מתאימה של נמהר (איור 1B). שיטה זו מבוצעת בדרך כלל תחת פרפין / שמן תערובת מינרלים כדי למנוע דיפוזיה של מים מתוך הירידה. להלן נדגים שני סוגים של התקנה ניסיונית דיפוזיה אדי, תלוי ירידה ושחרר ישיבה, בנוסף התגבשות אצווה תחת שמן.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Crystallization for X-ray Crystallography at JoVE.com

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

62.8K Views.  Yale University. מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטג...

Video: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

לא פולשני-3D ויזואליזציה עם תת מיקרון החלטה שימוש Synchrotron-X-ray-טומוגרפיה

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

הדפסת 3D של Preclinical רנטגן הממוחשבים טומוגרפית נתוני סטים

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...