Name: protein crystallization for x-ray crystallography
Uploaded: 2011-01-16T16:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Crystallization for X-ray Crystallography at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז החוקר ברוכים הבאים י&quot;מ ועל ידי עמיתי בראון-Coxe דוקטורים מאוניברסיטת ייל MD.

חומרים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם חלבון - ליזוזים (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תליית 24 גם מגש ירידה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישיבה ירידה של 24 היטב מגש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microbatch התגבשות 96 מגש טוב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התגבשות פתרונות (או מסחרי זמין או תוצרת בית) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון גריז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל במזרק ללא Luer נעילת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות שקופיות Siliconized </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איטום אופטי קלטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרפין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-2 micropipette μL עם השמירה נמוכה טיפים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Professional מגבונים </li></ul> 1. תלוי / יושב נוהל Drop: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מסך ראשוני אפשר להשתמש מסכי זמין מסחרית כי לנצל את מטריצה ​​דלילה שלם שיטה העצרת של תנאי הניסוי. מטריצה ​​דלילה שלם שיטה עצרת מוטה על ידי נבחרים מן התנאים התגבשות ידוע מקרומולקולות (קרטר קרטר, 1979; Cudney et al, 1994;. Jancarik וקים, 1991;. Jancarik et al, 1991). אם התנאי התגבשות כבר ידוע, מסך צר ניתן להרכיב, משנים את ריכוז ה-pH נמהר סביב פגע המקורי. נמהר הכי מוצלח הוא בדרך כלל פוליאתילן גליקול (PEG), ואחריו אמוניום סולפט. ביחד, שני אלה מזרזים להסביר כ -60% מכלל מזרזים macromolecular רשמה המשמש התגבשות (Gilliland et al, 1994;. Kimber et al, 2003;.. Page et al, 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות התגבשות שלך. בדרך כלל בתנאים אלה משולבים של סוכן מזרז, מלח מסוג כלשהו ו חיץ כדי להגדיר את ה-pH. במקרים מסוימים ניתן להוסיף תוספי במיוחד עבור החלבון של עניין. פתרון כל המניות צריך להיות מסונן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. חלק מהפתרון המניה עשוי להיות צמיגה מאוד (50% יתדות, גליצרול, PEG-MME, וכו &#39;). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.5 מ&quot;ל של 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 M NaCl כל אחד 0.1 M NaOAc pH 4.0, 4.3, 4.6 ו - 4.9 (סך של 24 פתרונות) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי מדגם חלבון שלך ולשמור על הקרח. מניות חלבון צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C, אלא אם כן חלבון עניין רגיש להקפיא / מחזורי ההפשרה (ואם כן, בחנות ב 4 ° C). ריכוז החלבון אופייניות הן בטווח של 5-50 מ&quot;ג / מ&quot;ל, עם ריכוזים גבוהים יותר בדרך כלל נותן תוצאות טובות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם 15min/18, 000xg / 4 ° C - חלבונים מסוימים נוטים לצבור חלקית לזרז צעד אחרי ההפשרה. אגרגטים אלה יכולים לקדם משקעים אמורפי של שאר מולקולות חלבון ולכן ספין מטה יסודית יבטיחו לך רק מולקולות מסיסים במדגם שלך. שמור חלבון על הקרח עד הקמת מגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון מן ספיגת שלה ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV. ריכוז החלבון ניתן לחשב מקריאת ספיגת מקדם הכחדה של החלבון. מקדם הכחדה יכול להיות מחושב באמצעות כלי ProtParam באתר Expasy: <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בארות של 24 גם תלוי / יושב מגש עם ירידה של 500 μL פתרון נמהר על פי התוכנית מגש ההתקנה (תרשים 2B). צור גריז סיליקון טבעת מסביב לקצה של הבאר. הטבעת צריכה להיות פער קטן כדי למנוע הצטברות לחץ אוויר כמו כן נחרץ. בשנת טיפות ישיבה, אין צורך לשמן היטב מאז הוא חתום עם הקלטת (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שקופיות מכסים לנקות אותו עם תרסיס אוויר מרוכז, או מקצועי לנגב - אבק הימנעות יקל את הפרשנות של ירידה התגבשות ולמנוע זיהומים. עבור ישיבה טיפות, שקופיות לכסות לא רגילים. במקום זאת, גם מכיל מדף שעליו חלבון מזרז מעורבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כרכים שווה המדגם חלבון פתרון מאגר בשקופית לכסות. כמויות שונות של חלבון נמהר אולי ניסה כחלק מתהליך הייעול. שימוש יותר חלבון מאשר תוצאות נמהר בריכוז נטו של החלבון לירידה לאחר איזון, אשר יכול להיות רצוי לדלל דגימות חלבון, ו להאט נוקלאציה קריסטל או צמיחה. כל חומר נדיף אחר פתרון הירידה יהיה גם מרוכז בידי גורם אחד. כאשר pipetting החלבון פתרונות מאגר לשקופית לכסות, להיות זהיר מאוד כדי למנוע היווצרות בועה. זה בדרך כלל מתרחשת כאשר האוויר פוצצו מתוך פיפטה. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תליית ירידה: 2 טען μL של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ליזוזים ב-pH 0.02 NaOAc M 4.9 למרכז והחלק את הכיסוי ולהוסיף לו 2 μL הפתרון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יושב טיפה: טען 2 μL של פתרון ליזוזים 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​למרכז המדף ולהוסיף לו 2 μL של פתרון המאגר. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהפכו את השקופית לכסות בעדינות ולהניח אותה על הטבעת גריז על גבי הבאר. לחץ כלפי מטה בעדינות כך שהאוויר יכול להימלט מן הבאר דרך החריץ של שומן כדי יח&quot;צהאירוע אוויר בלחץ הצטברות היטב ולשמור אטום היטב. הצטברות לחץ האוויר בתוך הבאר יכול להעלות את השקופית לכסות, להתפשר על החותם היטב. בשיטה ירידה ישיבה, סרט שקוף ברור אופטית משמש כדי לכסות את הבארות. לפיכך, איטום בשיטה זו תתקיים כל שורה / עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל היטב הבא עד מגש שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המגש על ההתקנה - ביטול חלקיקי אבק זיהומים אחרים יכולים להפחית את זיהוי חיובי כוזב של גבישי חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גיליון הניקוד לתעד את הניסוי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המגש בטמפרטורת הדגירה הרצויה, בדרך כלל בין 4 טמפרטורת החדר C ו-מעלות. 20 ° C הוא הכי מוצלח כלל. תשמרי על עצמך כדי להתמודד עם מגש בעדינות למנוע לרעוד. היזהר בעת פתיחת וסגירת הדלת חממה. תנודות או שינויי טמפרטורה במהלך ההעברה או הדגירה יכול למנוע הצמיחה קריסטל או להשפיע לרעה על איכות קריסטל. הלם קליטת החומר (קצף אריזה למשל) יכול לשמש ריפוד תחת מגשי קריסטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מגש עבור גבישים למחרת, ואחר כך כל כמה ימים, תמיד הטיפול מגשים עם טיפול. כל מסמך הממצאים מורפולוגיות ירידה גיליון ניקוד מסוים מגש. קריסטלים בדרך כלל לוקח 2-5 ימים להופיע, אם כי לעתים גבישים מופיעים הרבה יותר מהר (כמעט מיד) או מאוחר יותר (עד כמה חודשים!). לאחר התגבשות התנאים זוהו קצב הגידול של הגבישים ידוע, עדיף להשאיר את המגשים באין מפריע עד גבישים הופיעו גדל לפחות מחצית גודלו הסופי. השארת מגשי באין מפריע יכול להפחית את מספר האירועים נוקלאציה גביש, ומכאן לייצר מספר קטן של גבישים גדולים יותר. </li></ol> 2. Microbatch נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם חלבון והכנת נמהר הם כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס האוויר מגש microbatch חדש כדי למנוע אבק וחלקיקים גדולים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במגש microbatch, למלא שמן פרפין עד 3 מ&quot;מ גבוה (מספיק כדי לכסות את הבארות). הסר גישה של שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 1 μL של פתרון חלבון (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ליזוזים) לתוך השמן מראש מילא היטב - לוודא פיפטה את הפתרון ישירות לתחתית הבאר (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 1 μL של פתרון נמהר לבאר על פי התוכנית מגש ההתקנה (תרשים 2B) - לוודא טיפה שוקעת לתחתית הבאר נתיכים עם טיפה את החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר היטב הבא עד מגש שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלבים 11-14 של התלייה / יושב הליך ירידה. </li></ol> 3. נציג תוצאות: התגבשות נקרא בדרך כלל כמו צוואר הבקבוק של קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן. מטריצה ​​דלילה שלמה מסך העצרת של התנאים מזרז בדרך כלל מייצרת סוגים שונים של צבירת משקעים של חלבונים, ביניהם אחד גבישים גדולים. אם חלבון או בריכוזים גבוהים מדי נמהר אפשר לראות חומר חום עם צורה וגודל לא ברורים (משקעים אמורפי). כאשר הפתרון הוא undersaturated, הירידה לעתים קרובות יהיה ברור לחלוטין ונטול כל סוג של משקעים. איור 3 מציג מספר דוגמאות לתופעות משקעים וקריסטלים (דסאו et al. 2006). תופעות המשקעים יותר עם ​​פרשנות מפורטת יותר ניתן למצוא בכתובת <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. עקרון התגבשות החלבון. עקרון התגבשות החלבון. בניסוי דיפוזיה אדי (א) כמויות שוות של נמהר וחלבונים נמצאים הירידה. מים יהיה מפוזר החוצה הן נמהר ריכוז חלבון יוכפל עד שיווי משקל יושג בין ירידה לבין פתרון המאגר. ב התגבשות אצווה (ב) נמהר ריכוז החלבון אינם משנים במהלך הניסוי. פוינט - חלבון נשאר undersaturated לא יכול להיווצר גבישים, B Point - נוקלאציה חלבון להתרחש, קריסטלים החלה להיווצר ואת הריכוז של חלבון בתמיסה טיפות הרוויה. C פוינט - חלבון משקעים, אבל עדיין עשוי לצמוח גבישים. (ג) התגבשות דיאליזה באמצעות ג&#39;ל פקוק נימי. קריסטלים להופיע מפזרת מלח מתוך המדגם חלבון (ו / או מפזרת נמהר לתוך המדגם חלבון) על פני תקע את הג&#39;ל. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תמציתי של ניסויים התגבשות טיפוסי חלבון. (א) נוהלי תלוי דיפוזיה אדי ירידה, יושב דיפוזיה אדי ירידה, וחלבון התגבשות microbatch. בכל מקרה, נפח קטן של מדגם חלבון מרוכז מעורב עם נפח שווה או קטן יותר של precipitanלא פתרון מותר לאזן. (ב) התגבשות של עוף ליזוזים, מגש 24 גם מוגדר עם ריכוזים שונים של נתרן כלורי (נמהר) עם 0.1 נתרן אצטט M כמו למאגר ב PHS שונים (4.0-4.9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תוצאות אופייניות של ניסוי התגבשות החלבון. (א) כמות המשקעים אמורפיים. כאשר חלבון או נמהר (או שניהם) נמצאים בריכוז גבוה. (ב) הפרדת פאזות. חלבון או אבקת רשאי להפריד לשלב שונה כאשר מעורבב עם מזרזים מסוימים בריכוז גבוה. (ג) גבישים רוד חלבון בצורת AtCSN7 שהושגו פוליאתילן גליקול 8000 ו אצטט מגנזיום (דסאו et al. 2006). (ד) גבישים ליזוזים שהושגו 1.0 M NaCl נתרן אצטט ו pH 4.9. (ה) תחת טיפות רווי בדרך כלל נשארים ברורים. צילום של משה דסאו.

<ol>
	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במאמר זה אנו מתארים ולהפגין פרוטוקולים הנוכחי כללית התגבשות החלבון. מאז אותו הליך רב שלבי יש כמה שיקולים אחד צריך להיות מודע. כאשר עובדים עם כמויות קטנות מאוד (0.5-2 μL), ייבוש הירידה עקב התאדות הוא החשש העיקרי. לפיכך, מומלץ לעבוד בסביבה מבוקר היטב (עם זרימת אוויר נמוכה, ל?...

<table><tbody><tr><td>Lysozyme</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24 well VDX Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24 well Cryschem Plate</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Dow Corning Vacuum Grease</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>Siliconized glass circle coverslides</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% paraffin oil</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

protein crystallization for x-ray crystallography

באמצעות מבנה תלת ממדי של מקרומולקולות ביולוגיות להסיק כיצד הם פועלים היא אחד התחומים החשובים ביותר של הביולוגיה המודרנית. הזמינות של מבנים ברזולוציה אטומית מספק הבנה עמוקה וייחודית של תפקוד החלבון, ומסייע לפענח את אופן פעולתו של התא החי. נכון להיום, 86% חלבון נתוני הבנק (rcsb-PDB) הערכים הם מבנים macromolecular שנקבעו באמצעות קרני רנטגן קריסטלוגרפיה. כדי לקבל גבישים מתאימים ללימודי קריסטלוגרפיים, מקרומולקולה (למשל חלבון, חומצות גרעין, חלבונים מורכבים או חלבונים מורכבים חומצת גרעין) חייבים להיות מטוהרים הומוגניות, או קרוב ככל האפשר אל ההומוגניות. ההומוגניות של התכשיר הוא גורם מפתח בהשגת גבישים כי diffract ל ברזולוציה גבוהה (Bergfors, 1999; מקפרסון, 1999). התגבשות דורש להביא את מקרומולקולה כדי רוויה. המדגם ולכן צריך להיות מרוכזים כדי הריכוז הגבוהה ביותר האפשרית מבלי לגרום להצטברות משקעים או של מקרומולקולה (בדרך כלל 2-50 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הצגת המדגם לסוכן מזרז יכול לקדם את נוקלאציה של גבישי חלבון בתמיסה, אשר עלולה לגרום תלת ממדי גבישים גדולים גדל מפתרון. ישנן שתי שיטות עיקריות להשיג גבישים: דיפוזיה אדי התגבשות אצווה. ב אדי דיפוזיה, ירידה המכיל תערובת של פתרונות נמהר וחלבון אטום בתא עם נמהר טהור. אדי מים ואז מפזרת את הירידה עד osmolarity הירידה ואת נמהר שווים (איור 1 א). התייבשות גורמת לירידה של ריכוז של חלבון איטי וגם מזרז עד שיווי המשקל מושגת, אידיאלי באזור נוקלאציה קריסטל של הדיאגרמה שלב. השיטה מסתמכת על אצווה להביא את החלבון ישירות לתוך אזור נוקלאציה על ידי ערבוב חלבון עם כמות מתאימה של נמהר (איור 1B). שיטה זו מבוצעת בדרך כלל תחת פרפין / שמן תערובת מינרלים כדי למנוע דיפוזיה של מים מתוך הירידה. להלן נדגים שני סוגים של התקנה ניסיונית דיפוזיה אדי, תלוי ירידה ושחרר ישיבה, בנוסף התגבשות אצווה תחת שמן.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Crystallization for X-ray Crystallography at JoVE.com

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

63.3K Views.  Yale University. מבנה 3-D של מולקולה מספק הבנה ייחודית של כמה פונקציות מולקולה. השיטה העיקרית לקביעת המבנה ברזולוציה כמעט אטומי הוא רנטגן קריסטלוגרפיה. כאן, אנו להדגים את השיטות הקיימות לקבלת גבישים תלת ממדי של מקרומולקולה נתון זה מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה בקרני רנטג...

Video: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in their largest dimension, which used to represent a challenge. We present two alternative workflows for the structure determination of protein microcrystals by X-ray crystallography with a particular focus on crystals grown in vivo. The microcrystals are either extracted from cells by sonication and purified by differential centrifugation, or analyzed in cellulo after cell sorting by flow cytometry of crystal-containing cells. Optionally, purified crystals or crystal-containing cells are soaked in heavy atom solutions for experimental phasing. These samples are then prepared for diffraction experiments in a similar way by application onto a micromesh support and flash cooling in liquid nitrogen. We briefly describe and compare serial diffraction experiments of isolated microcrystals and crystal-containing cells using a microfocus synchrotron beamline to produce datasets suitable for phasing, model building and refinement.
These workflows are exemplified with crystals of the Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produced by infection of insect cells with a recombinant baculovirus. In this case study, in cellulo analysis is more efficient than analysis of purified crystals and yields a structure in ~8 days from expression to refinement.

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

A protocol is presented for X-ray crystallography using protein microcrystals. Two examples analyzing in vivo-grown microcrystals after purification or in cellulo are compared.

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

התגבשות חלבונים על שבב על ידי מיקרודיאליזה עבור In Situ רנטגן עקיפה מחקרים

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Chemistry

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

התגבשות על השבב ודיפרקציה טורית בקנה מידה גדול בטמפרטורת החדר

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug discovery. To date, X-ray crystallography remains the most successful method for solving three-dimensional protein structures at atomic resolution. With recent advances in serial crystallography, either using X-ray free electron lasers (XFELs) or synchrotron light sources, protein crystallography has progressed to the next frontier, where the ability to acquire time-resolved data provides important mechanistic insights into the behavior of biological molecules at room temperature. This protocol describes a straightforward high-throughput (HTP) workflow for screening crystallization conditions through the use of a 96-well dialysis plate. These plates follow the Society for Biomolecular Screening (SBS) standard and can be easily set up using any standard crystallization laboratory. Once optimal conditions are identified, large quantities of crystals (hundreds of microcrystals) can be produced using the dialyzer. To validate the robustness and versatility of this approach, four different proteins were crystallized, including two membrane proteins.

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

The presented protocol describes a straightforward approach for screening protein crystallization conditions and crystal growth using a 96-well high-throughput dialysis plate. The use of dialyzer tubes for the large-scale growth of microcrystals is also demonstrated for serial crystallography and MicroED applications.

התגבשות חלבון בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרודיאליזה

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...

סינון בתפוקה גבוהה להתגבשות חלבונים

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

מחבר זרקור: סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות גבישים לקריסטלוגרפיה של חלבונים  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

התגבשות אוטומטית של חלבונים ואיסוף נתונים בזמן אמת

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from crystallization plates at Diamond Light Source beamline VMXi are described. This approach enables high-quality room-temperature crystal structures to be determined from multiple crystals in a straightforward manner and provides very rapid feedback on the results of crystallization trials as well as enabling serial crystallography. The value of room temperature structures in understanding protein structure, ligand binding, and dynamics is becoming increasingly recognized in the structural biology community. This pipeline is accessible to users from all over the world with several available modes of access. Crystallization experiments that are set up can be imaged and viewed remotely with crystals identified automatically using a machine learning tool. Data are measured in a queue-based system with up to 60&#176; rotation datasets from user-selected crystals in a plate. Data from all the crystals within a particular well or sample group are automatically merged using xia2.multiplex with the outputs straightforwardly accessed via a web browser interface.

מחבר זרקור: קידום ניתוח מבנה חלבונים לפיתוח תרופות 

We present a protocol for the crystallization of proteins using the crystallization facility in the Research Complex at Harwell and subsequent in situ X-ray crystallographic data collection from crystals within the plates at Diamond&#39;s Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We describe sample requirements, crystallization protocols, and data collection guidelines.

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אוטומטית פרוטוקולים עבור התגבשות Macromolecular במעבדה MRC של הביולוגיה המולקולרית

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

התגבשות חלבונים על שבב על ידי מיקרודיאליזה עבור In Situ רנטגן עקיפה מחקרים

התגבשות על השבב ודיפרקציה טורית בקנה מידה גדול בטמפרטורת החדר

התגבשות חלבון בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרודיאליזה

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source