טכניקה זו משמשת כשיטה בסיסית לניסויים שנועדו להתוות את ההתפתחות העוברית או הזחלית של הקריקט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא גמישה ותתמוך במספר סוגים של גישות ניסיוניות, כגון אלה המנצלות הפרעות RNA או מניפולציה גנומית. הדגימה להליך תהיה האדלי וילסון הורץ', החוקרת הראשית במעבדה.
כדי להתחיל בהליך זה הרטיב את מישור המטחנה המסתובב של השבל עם מים נוטפים. מניחים את המחט שנמשכה לתוך המשפר ומסובבים אותה לזווית של 20 מעלות. מנמיך את המחט עד שהיא נוגעת בצלחת השחזה ומקסים אותה לשתיים עד שלוש דקות.
להעריך את שיפוע על ידי הנחת המחט משופע על קלטת מקל כפול כי כבר דבק שקופית מיקרוסקופ זכוכית. מקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ מורכב המצויד במצלמה ובתוכנות לרכישת תמונות. לרכוש תמונה של המחט באמצעות מטרה 20x.
השתמש בתוכנת ההדמיה כדי למדוד את קוטר לומן הפנים של המחט רק קרוב לפתיחה משופעת. השלך מחטים עם פתח קטן משמונה מיקרומטר או גדול מ-12 מיקרומטר. ראשית, להכין 40 מיליליטר של 1% agarose במים ויוצקים אותו לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ.
מניחים חותמת ביצה היטב על פני השטח של agarose לפני שהוא מתגבש. לאחר התעוררות הוא התגבש, להסיר את החותמת כדי לחשוף את בארות. לאחר מכן, מלאו את צלחת הבאר עם HBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין.
מניחים את המכסה על המנה, עוטפים אותה בפרפילם ומאחסנים אותה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, למלא צלחת פטרי 35 מילימטר עם חול מגרש משחקים לבן כדי להפוך את צלחת איסוף ביצים עבור הצרצרים להטיל ביצים. מכסים את צלחת הביצה עם ריבוע מגבת נייר חתוך כ 18 על 18 ס"מ.
מלאו במי ברז דרך מגבת הנייר. לאחר מכן, להטות את צלחת פטרי בעדינות לסחוט את החלק העליון כדי להסיר מים עודפים. מניחים את הפינות של ריבוע מגבת הנייר מתחת לצלחת ומניחים את צלחת הביצה במכסה הפוך אשר יסייע לשמור על מגבת הנייר במקום.
מניחים את צלחת הביצים לתוך פח הקריקט ומאפשרים לנקבות הבוגרות לביצת את הביציות במשך שעה עד שעתיים. בינתיים, לאפשר את צלחת אגרוז להתחמם לטמפרטורת החדר לקראת החזקת הביצים להזרקה. כאשר מוכן, להסיר את צלחת איסוף הביצים, עכשיו המכיל ביצים טריות, מפח הקריקט.
מוציאים את מגבת הנייר ומניחים מסננת בגודל נקבובית בין 0.5 למילימטר אחד מעל מקור. שוטפים את תכולת צלחת הטלת הביצים לתוך מסננת תחת מי ברז זורמים בעדינות. גרגרי החול ייפלו דרך רשת מסננת לתוך המק מתחת בעוד ביצי קריקט להישאר בסל מסננת.
ממלאים מיכל במים הפוכים של אוסמוזה וממקמים אותו במגש. הפוך את מסננת מעל המיכל והקש אותו על המנה כדי לנתק את הביצים למים. הביצים ישקעו לתחתית המיכל.
לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את הקצה את קצה פיפטה P1000 כדי להפוך את הפתיחה כשלושה מילימטרים קוטר. מניחים את הטיפ הזה על צינור P1000, ולהשתמש בו כדי להעביר את הביצים מן המיכל לצלחת תבניות ביצה אגרוז. בעזרת פינצטה מפלסטיק, מרווים את הביצים בארות אגרוז.
כל ביצה תשקע לתחתית באר בודדת. מכסים את צלחת פטרי עם מכסה עד מוכן להזריק. כדי להתחיל, מניחים את צלחת הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתח ולבחור הגדלה נמוכה של סביב 10x.
צייר 1.5 microliters של פתרון הזרקה באמצעות 20 טיפים טעינה microliter ו פיפטה P10 ולהכניס את קצה הטעינה לתוך הקצה הרחב של מחט ההזרקה. לגרש את פתרון ההזרקה לתוך מחט ההזרקה. הכנס את המחט לתוך דיור ההזרקה ולהדק, לוודא כי המחט מוכנס כראוי בחוזקה לתוך הדיור.
ואז בזהירות להכניס את דיור ההזרקה לתוך micromanipulator, נזהר לא לשבור או להיפגע על ידי המחט. תוך כדי התבוננות הן בביצים והן במחט דרך המיקרוסקופ, הזז את המחט ליד ה- X בפינה השמאלית העליונה של רשת הכלים. מנמיכים את המחט עד שהטיפ נכנס ל- HBS בתוספת פתרון אגירת פניצילין סטרפטומיצין בצלחת.
מרכזים את המחט בשדה הראייה ומזיזים את צלחת הביצה כך המחט היא כמה מילימטרים קרוב יותר לקצה המנה מאשר הביצים. לאחר מכן, הגדר את המיקרוסקופ למסנן המתאים לרודאמין כדי לבחון את הפלואורסצנטיות במחט ולהתמקד בקצה שלה. על microinjector לאט להפוך את ידית האיזון בכיוון השעון עד פתרון ההזרקה מתחיל לדלוף מתוך המחט לתוך פתרון ההשעיה.
ואז להפוך את הידית לאחור נגד כיוון השעון מעט עד הצבע פשוט מפסיק לדלוף מתוך המחט. עם המחט עדיין מרוכז בשדה הנוף, להזיז את צלחת הביצה, כך המחט מכוונת הביצה להיות מוזרק הראשון. התאימו את ההגדלה ל-50x כדי שבצה אחת תמלא את רוב שדה המבט.
השתמש הן micromanipulator ואת היד של אחד על צלחת הביצה כדי להזיז את המחט למקומו להזרקה. השתמש micromanipulator כדי לקדם את המחט ולהכניס את הקצה לתוך הביצה הראשונה להיות מוזרק, הקפד להכניס את המחט ב 20 עד 30% של אורך הביצה מהקצה האחורית של הביצה בניצב לציר הארוך של הביצה. להזריק את הפתרון עם דוושת רגל ההזרקה או כפתור ההזרקה על microinjector.
בולוס קטן של חומר פלואורסצנטי בתוך הביצה יצביע על זריקה מוצלחת. לאחר מכן, לסגת המחט מהביצה. אם הביצה מורמת שלא במתכוון מה בארה שלה עם נסיגת המחט, השתמש במטליות קטנות כדי לדחוף את הביצה בחזרה לתוך באר תוך נסיגת המחט.
במחקר זה, ביצי קריקט מוזרקות באמצעות טכניקה המשמשת כשיטה בסיסית בניסויים רבים, כולל אך לא מוגבל, הפרעות RNA ומניפולציה גנומית. שיעור ההישרדות הוא פרמטר חשוב אחד להערכת ההצלחה של ניסוי זה. רוב הביצים המתות ניתן לזהות בקלות על ידי ראייה כמו חלמון רקמה עוברית בתוך הביצה מתחילים להצמיע בצורה לא אחידה, ובסופו של דבר רוב החלמון ינדדו לצד אחד של הביצה.
כאשר העריכו לאחר ארבעה עד שישה ימים, יותר מ 85% של ביצים uninjected שרדו, בעוד ביצים מוזרק עם רייגנטים ניסיוניים בדרך כלל היה שיעור הישרדות נמוך יותר. שליטה על כל ההיבטים של הזריקה עצמה, כולל ניקור מחט, כניסתה של צבע חיץ, או נוכחות של רכב או RNA תקוע כפול, נדרש כדי להבין את ההשפעות האמיתיות של ניסיון המניפולציה הניסיונית. האופן שבו אדם מעריך את התוצאות הפנוטיפיות של ההזרקה תלוי במה שהוזרק.
לדוגמה, שינויים פנוטיפיים כתוצאה מנפילות mRNA ספציפיות עשויים להיות ברורים ברמת האנטומיה הגולמית. אם מצד שני cDNA קידוד EGFP מתויג histone 2B גן תחת שליטתו של מקדם ACTIN G.bimaculatus מוכנס לתוך הגנום קריקט באמצעות טרנספוזאז חזירון, ניתן לדמיין כל גרעין בביצה באמצעות פלואורסצנטיות כדי לרגש את EGFP מתויג היס 2B חלבון. התאמת האיזון כך המחטים לא לסתום הוא צעד קריטי בהליך זה.
ייתכן שיהיה עליך לבצע מספר התאמות לאחר זריקות עוקבות מאז חלמון לפעמים סותם את קצה המחט. הצרצר הוא חרק hemimetabolous כי ענפים בזלת חרקים holometabolous למד היטב כגון Drosophila. לימוד התפתחות קריקט יעזור לנו להבין יותר על האבולוציה וההתפתחות ברחבי ממלכת החי.
טכניקה זו דורשת תרגול מסוים. אנו ממליצים לתרגל זריקות בקרה עד שיעור ההישרדות ארבעה או חמישה ימים לאחר ההזרקה הוא לפחות 80%
