אנו מודים לצליל רוזנבלט, אלכסנדרה בלו וקרל Spuhler לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מכללת סאר מחקר מכון הקיץ לתואר הראשון (URSI), קרן מחקר סלמון מיינרד וסי ונאס&quot;א הפרס # NX09AU90A, קרן מדע המרכז הלאומי למחקר מצוינות במדע והטכנולוגיה (NSF-CREST) ​​פרס # 0630388 וNSF הפרס # 1058385.

1. ג הכנה לניתוח elegans וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10-20 נמטודות מבוגרים הרות לצלחות NGM טריות אגר מלאות פטרי באמצעות נקר דק, שטוח פלטינת תיל. את צלחות פטרי מלא באגר NGM מכילות כתם עגול קטן של א &#39; coli (זן צמיחה מוגבל, OP50, נותן את התוצאות הטובות ביותר) לנמטודות לאכול. לאפשר לנמטודות להטיל ביצים במשך 3-5 שעות ולאחר מכן להסיר את המבוגרים, ובכך לבסס תרבות קטנה, מסונכרנת-התפתחותית של 50-150 נמטודות. לאפשר לנמטודות לגדול לבגרות המוקדמת של צלחות פטרי דוגר על 20 מעלות צלזיוס במשך 4-5 ימים. שיטות התרבות אלה מבוססים על נהלים שנקבעו (Stiernagle 2006). 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של ניתוח וידאו, שטוף את צלחת של נמטודות הצעירה המבוגרת עם 1 מיליליטר מי deionized, מזוקקים, ובכך לאסוף 50-150 תולעים מהתרבות המסונכרנת. פתרון חיץ כמו M9 או PBS יכול לשמש גם. השתמש microcentrifuge להסתובב worms לתחתית של תחתית, או לאפשר להם להתיישב על ידי הכח הכביד לכ 15 דקות. הסר את רוב המים מהצינור ולהחליף אותו עם 1 מיליליטר מי deionized, מזוקקים כדי לשטוף את כל חיידקים דבקים מנמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נמטודות במים או חיץ לקוורץ קובט באמצעות micropipette. חשוב לעבוד עם מספר קטן, על נמטודות 5-10 בסך הכל בפעם אחת או אפילו פחות, כך שנמטודות אחד בכל פעם עשויות להיות מואר על ידי הליזר. אם מספר נמטודות על צלחות התרבות הוא גדול מדי, לדלל את התולעים במים או חיץ עד צפיפות רצויה הוא הגיע. כמו כן ניתן לאסוף נמטודות הבודדה לטיפה של מים או בולם בצלחת אגרה טריה לשטוף אותם ולהעביר את התולעים בודדים לקובט. במחקר שלנו, בשימוש 1 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ ו 5 גדלי קובט מ&quot;מ כדי לבחון את ההשפעות של מגבלות פיסיות על חי התנהגות. </li></ol> 2. התקנה אופטית לווידאו Analysiשל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע התקנה כפי שמוצגת באיור 1 שמשתמשת ב543 ננומטר (ירוק) הליום ניאון (HeNe) בליזר, שתי מראות קדמי משטח אלומיניום, בעל קובט, מסך הקרנה, ומצלמה במהירות גבוהה (Casio Exilim מהירות הגבוהה) המסוגלים בצילום ב~ 240 תמונות בשניות. שתי המראות משמשות לנווט את קרן הליזר באמצעות קובט. גדלים שונים של cuvettes ניתן להשתמש בהתאם לאופי של המחקר. כדוגמה, השתמשתי cuvettes כי הם 5 מ&quot;מ עבה כדי להראות את ההשפעות של אילוצים המרחביים על תדרים שחייה. קרן הליזר חייבת למלא את הדרישות לoversampling;. כלומר, האורגניזם צריך להפריע לא יותר משליש מקרן הליזר. לג elegans, קרן הליזר צריך להיות על 2 מ&quot;מ בקוטר כאשר הוא מקיים אינטראקציה עם נמטודות. קרן הליזר לא צריכה להיות גדולה יותר מ 5 מ&quot;מ בקוטר מאז הדפוס העקיף יהיה קשה לאתר. המרחק בין האורגניזם לdiffracting המסך צריך להיות הרבה יותר גדול מאשרהאורגניזם עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום parafilm מעל קובט ולהפוך אותו כדי לערבב את נמטודות בעמודת המים. הנח את קובט בבעל קובט כך שתולעים הם בתחילה בחלק העליון של קובט. שימוש במראות, לכוון את קרן הליזר דרך מרכז קובט. בגלל נמטודות צפופה יותר מים, הם נופלים לאט לתחתית קובט, בעוד באותו הזמן חיו בתוך עמודת המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הקרנת המסך, צבע במקום המתאים לקרן הליזר מועבר השחורה כדי לצמצם פיזור כקורה מועבר פוגש מסך הקרנה (איור 2). לחלופין לשים פתיחה במסך הקרנה כדי לאפשר את הקורה מועבר לעבור מסך. ביטול או צמצום פיזור מהקורה מועבר ישמור CCD המערך של מצלמה מלהרוות בשל הקרן המשודרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד את מדד לגודל של התבנית העקיפה, לצייר קוכ 5 סנטימטרים ממסך ההקרנה ליד נקודת קרן הליזר המשודר בלי להתערב בתמונת האור מתפזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט עם המצלמה בעת שהאור בחדר הוא בכך ששורת 5 הסנטימטר היא באותה המד כמו את התמונות העקיפות. כבה את האור בחדר. תמונות שיא התאבכות על המסך עם המצלמה כתולעים עוברים קרן הליזר. </li></ol> 3. הכנת נתוני וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן תוכנת ניתוח וידאו (וגר Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/)</a> במחשב. יבוא הווידאו לתוך תכנית ניתוח וידאו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המקור יעלה בקנה אחד עם כתם הליזר המשודר. הגדר את היקף שימוש בקו 5 סנטימטרים על מסך הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר העקירה הזוויתי של תמונת ההתאבכות נוצרת על ידי כל נמטודות באמצעות תוכנת ניתוח וידאו (איור 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למצוא את angulaעקירת r על ידי לקיחת arctan (y / x), להעתיק ולהדביק נתונים לגיליון אלקטרוני (Excel) ולהוסיף 180 מעלות או π לכל הזוויות השליליות לייצר גרף רציף (Figure. 4). </li></ol> 4. רכישת נתוני זמן אמת לתצפית מיידית של תדרים שחייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אותה ההגדרה כלניתוח וידאו, הנח photodiode (DET10A מThorLabs) עם שטח קטן (~ מ&quot;מ 1 2) מחוץ למרכז בתבנית העקיפה ממש מול מסך הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר photodiode לאוסצילוסקופ הדיגיטלי (PicoScope נעשה על ידי טכנולוגית פיקו) המתחבר למחשב דרך יציאת USB. לבחון את הדפוסים נמרצות על מסך מחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור ערכות נתונים שנרכשו בפורמט ASCII או טקסט. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הנתונים שנרכשו באמצעות וידאו או photodiode לתכנית לניתוח נתונים מסוגלים גל הולם באמצעות מזעור צ&#39;י מרובע. התכנית ששמשה כאן היא מוצא <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">(http://www.originlab.com/).</a> Fit עקום סינוסי לקבוע תדירות חבטות (איורים 4 ו 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע תדרי שחייה מדגימות שונות וקובעים את השונות. לצורך המחקר, נתונים סטטיסטיים נותחו באמצעות ANOVA-גורם אחד ואחריו במבחן ההשוואות המרובה Bonferroni. P-value של &lt;0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. </li></ol> 6. דפוסי התאבכות מודל באמצעות Mathematica כדוגמה הערה: דפוסי התאבכות יכולים להיות מודל שימוש בכלים חישוביים רבים ושונים. הליך זה יהיה שונה לכלים שונים כגון Matlab חישוביים, Excel, מוצא וכו &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמונה: קח תמונות של נמטודות בשקופית מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ מסורתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Binarize תמונה: ייבא &quot;התולעת&quot; דימוי תולעתיn בMathematica ידי גרירת התמונה לתוך Mathematica. המר את התמונה לתמונה בשחור לבן (binarize). זו יכולה להיות מושגת עם הפקודה &#39;Binarize&#39; בMathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [תולעת]. התמונה לאחר מכן ניתן לראות בתמונה בשחור לבן. לחלופין, השתמש בפקודה &#39;EdgeDetect&#39; כדי ליצור BlackandWhiteImage: EdgeDetect [תולעת, 6.0,0.035], שבו שני מספרים עוקבים לשלוט בגסות של הקצוות שהתקבלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונה למטריצה ​​של אפסים ואחדים: זו יכולה להיות מושגת עם הפקודה &#39;ImageData&#39; בMathematica: מטריקס = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתמרה מטריקס: השתמש בפקודה &#39;הפורה&#39; בMathematica להתמרה פורה המטריצה ​​באמצעות FourierParameters המצוין: FTransform = הפורה [מטריקס, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מודולוס כיכר של מטריצה ​​כדי לקבל את המטריצה ​​העקיפה ולשפר את ניגוד תמונה: כיכר המוחלטתערך של המטריצה ​​ולהציג התמונה שתתקבל, שהוא הדפוס העקיף המקביל לתמונה המקורית. כמו כן, נעשה שימוש בפונקציה &#39;התחבר&#39; לקנה מידת החדות של התמונה: ImageContrast = תמונה [התחבר [1 + (שרירי בטן [FTransform]) ^ 2] / 0.5]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי גודל תמונה לצפייה קלה: יבול הדפוס העקיף המרכזי ולשנות את הגודל כרצון: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את דפוסי התאבכות הדמיית המחשב עם דפוסי התאבכות המתקבלים מתולעים בחופשיות שחייה. (איור 6) </li></ol>

<ol>
	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פתחנו גישה חדשנית למדידה בזמן אמת של תנועה והתנהגויות locomotory פשוטות באורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שאינו דורש שימוש במיקרוסקופים. 8 גישה המתודולוגית זה גם יכולה להיות מנוצלת ללימוד אורגניזמים מיקרוסקופים רבים כמו הפרוטיסטים. שיטה זו מוגבלת רק על ידי אורך הגל של אור המשמש. האורגניזם לא צריך להיות קטן יותר מאורך הגל של האור. בנוסף לחיסכון והניידות של כל הציוד הדרוש, יתרון מרכזי אחד של גישה זו היא היכולת למדוד התנהגות בזמן אמת ובשלושה ממדים, ללא אילוצים הצרים של מטוסי תמונה תחת המיקרוסקופ. אפשר גם עם טכניקה זו כדי לבחון את ההשפעות של כוח משיכה או תנאים רבים אחרים בהתנהגות שלא ניתן ללמוד באמצעות גישות המיקרוסקופ מבוססים. 9 לפיכך, אנו יכולים להגיע להבנה טובה יותר של מיקרואורגניזם הטבעי locomotory Behaviors המשוחרר מגבולות שקופיות מיקרוסקופ טיפין או בתאי microfluidic מיוחדים (הפרק et al, 2008). 10 חוסר המידע בשלב דפוס עקיף אינו מאפשר שהליפה הישירה של התמונה המקבילה לאובייקט diffracting מאז הדפוס העקיף השדה רחוק הוא פרופורציונלי לריבוע הערך המוחלט של ההתמרה. לכן אנחנו חישוב דפוסי התאבכות מתמונות תולעת, כך שהם יכולים להיות מתאימים עם את דפוסי ההתאבכות של נמטודות חופשיות חייה (איור 6). שיטה זו הניבה תוצאות עבור באמת שוחה בחופשיות ג elegans ויכול להיות מיושם על כל מין מיקרוסקופי שתמרונים בסביבה שקופה אופטית כמו מים או פתרונות רבים יוניים שונים. מיקרוסקופים קונבנציונליים רק לאפשר לימודים עם עומק מוקד על סדר מיקרומטרים. 11 זאת בשל מוגבלעומק השדה כאשר התמקדות אור: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> שם מספר F N יש יחסי גומלין עם המעגל של בלבול (ג) כך שאורך מוקד קצר קשור בג גדול. 12,13 אמנם השיטה העקיפה הזה היא בהחלט לא תחליף למיקרוסקופיה הקונבנציונלית, הוא מסוגל כדי לספק תוצאות כמותיות במהירות, כך שמינים יכולים אפילו לטפל בזמן אמת בעלות נמוכה. את דפוסי ההתאבכות ניתן לקבל עם כל מצביע ליזר. את דפוסי ההתאבכות ניתן צולם ברזולוציה של זמן מופחתת שימוש במצלמה דיגיטלית רגילה. בזמן שהמשתמש לא יכול להיות מיקרוסקופ או photodiode זמין, חלקים מרכזיים של ניסוי זה כגון מדידת תדרי חבטות והערכת דפוסי התאבכות יכולים להסתיים בעלות הנמוכה ביותר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 543 ננומטר HeNe ליזר </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> כל ליזר בטווח הנראה לעין עם פחות מ 5 mW ניתן להשתמש. </td></tr><tr><td> 2 מראות אלומיניום משטח קדמיות </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמת Exilim מהירות גבוהה </td><td> קאסיו </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קוורץ קובט </td><td> תאי Starna </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (תוכנה) </td><td> רניה </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> וולפרם </td><td></td><tד&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

קרקע ואורגניזמים מיקרוסקופים חיים במים לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. רוב המחקרים של התנהגות אורגניזם מיקרוסקופית, בניגוד לכך, נערכו תוך שימוש בגישות המיקרוסקופ מבוסס, אשר מגבילות את התנועה והתנהגות לשדה צר, כמעט דו ממדי מוקד. 1 אנו מציגים גישה אנליטית רומן המספקת ניתוח בזמן אמת של חופשיות חי ג elegans בקובט ללא תלות בציוד המיקרוסקופ מבוסס. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית אור ליזר דרך קובט. אנו מודדים את תדרי תנודה לנמטודות חופשיות שחייה. ניתוח של דפוסי התאבכות השדה רחוק מגלה רמזים על הגל של נמטודות. עקיפה היא התהליך של כיפוף אור מסביב לאובייקט. במקרה זה הוא אור מתפזר על ידי אורגניזמים. גלי האור מפריעים ויכולים ליצור מודעהדפוס iffraction. שדה רחוק, או Fraunhofer, דפוס עקיף נוצר אם מרחק מסך לאובייקט הוא הרבה יותר גדול מאובייקט diffracting. במקרה זה, הדפוס העקיף ניתן לחשב (הדמיית מחשב) באמצעות התמרה פורה. 2 סי אלגנס הן נמטודות קרקע המתגוררת בבני חיות שמנווטות בשלושה ממדים. הם עוברים גם על מטריצה ​​מוצקה כמו אדמה או אגר בדפוס locomotory סינוסי נקרא זחילה ובנוזל בדפוס שונה נקרא שחייה. 3 התפקידים שמלאו מידע חושי המסופק על ידי mechanosensory, chemosensory, ותאי thermosensory ששולטים שינויים פלסטיים בlocomotory דפוסים ומתגים בדפוסים רק מתחילים הובהרו. 4 אנו מתארים גישה אופטית למדידת תנועת נמטודות בשלושה ממדים שאינו דורשים מיקרוסקופ וייאפשרו לנו להתחיל לחקור את המורכבות של תנועת נמטודות תחת שיתוף שונהnditions.

<html> כדוגמה, למדו ג elegans ב1 סנטימטר קוורץ קובט רחב, 5 מ&quot;מ ועובי 4 הסנטימטר קובט הגבוה. דגימת תולעת אחת באמצעות ניתוח וידאו, תדר החייה הממוצעת המתקבל מניתוח וידאו בקובט עבה 5 מ&quot;מ הוא כ -2.5 הרץ (איור 4). כמו כן, דגימת תולעת אחת בשיטת רכישת נתונים בזמן האמת, תקבלו תדירות שחייה של כ -2.7 הרץ (איור 5), באמצעות אוסצילוסקופ הדיגיטלי (PicoScope). הליך זה ניתן לחזור לתולעים רבים. מחקר מפורט של תולעי חופשיות חייה חשף תדירות חייה ממוצעת של 2.37 הרץ בקובט 5 מ&quot;מ. 6, כצפוי, את תדירות שהחייה גבוהה יותר מזה של תולעת זוחלת (~ 0.8 הרץ). 3 השימוש בשיטה עקיפה זו, תדרי שחייה ממוצע של ג elegans, שמוגבל לשקופית מיקרוסקופ, כבר מצא כדי להתאים את הערך שפורסם בעבר של 2 הרץ. 1,7 ve_content &quot;&gt; הנהלים הבאים 3.) ולאחר מכן 6.) מאפשר לדוגמנות של שחי דפוסי התאבכות בעזרת תמונות תולעת שהושגו עם מיקרוסקופ קונבנציונלי. את דפוסי התאבכות הדגם משמשים כדי לדמות מחזור שחייה של סי אלגנס ( איור 6). מודל מוצלח מורכב מדפוסי חייה רצופים אפשריים פיזי התואמים את תדרי שהחייה. התולעת צריכה להיות באותה הצורה בסוף מחזור חייה כפי שהיה בתחילתו של מעגל לשחות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> איור 1. ירוק HeNe ליזר נעשה שימוש כדי ליצור תבנית עקיפה דינמית באמצעות חי ג elegans. דפוס עקיף זה צולם ב240 תמונות בשניות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> איור 2. DRA<html> כנף נקודה שחורה מגבירה את הספיגה של הקרן המשודרת. רוויה של המצלמה בגלל אור מפוזר מצטמצמת והתבנית העקיפה הופכת לגלויה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> איור 3. צילום מסך של תוכנת ניתוח וידאו (וגר Pro) עם תבנית עקיפת תולעת שהוא במעקב. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> איור 4. נתוני וידאו מתאימים למעגל השחייה של נמטודות בקובט 5 מ&quot;מ. נכון העקומה חושפת תדירות חייה של ~ 2.5 הרץ. &quot;/&gt; איור 5. נתונים בזמן אמת מתאים למעגל השחייה של נמטודות בקובט 5 מ&quot;מ. נכון העקומה חושפת תדירות חייה של ~ 2.7 הרץ. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> איור 6. השורה העליונה מייצג את דפוסי התאבכות בפועל ומותאמת לדפוסי התאבכות המודל בשורה התחתונה. את דפוסי התאבכות הדגם הופקו באמצעות תולעים בשקופית מיקרוסקופ (שורה אמצעית).

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction at JoVE.com

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

אורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שוחים החופשיים<em&gt; ג elegans</em&gt;, לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. אנו מדווחים על גישה חדשנית המספקת ניתוח של<em&gt; ג elegans</em&gt; באמצעות דפוסי התאבכות. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית אור ליזר דרך קובט.

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K Views.  Vassar College. אורגניזמים מיקרוסקופים כמו נמטודות שוחים החופשיים ג elegans, לחיות ולהתנהג בסביבה מורכבת בתלת ממד. אנו מדווחים על גישה חדשנית המספקת ניתוח של ג elegans באמצעות דפוסי התאבכות. גישה זו כוללת מעקב המחזוריות הזמנית של דפוסי התאבכות נוצרים על ידי הפניית או?...

Video: Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

בניית מערכת בתקציב נמוך לייזר Axotomy לחקר התחדשות אקסון ב ג elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In vivo כמותי הערכת מבנה שריר הלב, תפקוד, זלוף ואת הכדאיות שימוש טומוגרפיה לב מיקרו שחושב

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

פרוטוקול לשחזור ויעיל עבור הארכת במודל חולדה המוביל אל עצם הירך Regenerated פונקציונלי

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

צילום כפול של בעלי חיים קטנים פוטואקוסטיים לסריקת רסטר לפריטים חזותיים של כלי דם

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...