אנו מודים למליסה Klocke לסיוע הכנת האיור 1 ואנה רטליף להוכחה בפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי חברת המחקר לקידום מדע.

1. פתרוני microtubule דאיית Assay מניות להכין מראש assay דאייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלמר 0.5 microtubules מ&quot;ג כותרת דלילות עם 22 fluorophore האורגני הבהיר. ריכוז תווית היעד הוא fluorophore 1 לכל מיקרומטר של microtubule, או צפיפות תיוג של כ 1 fluorophore ל1500 הדימרים טובולין. אחסן בטמפרטורת חדר, אור שמוגן באלומיניום, נייר כסף לתקופה של עד שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר 21 ביוטין-kinesin בכ 1 מיקרומטר. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב5 aliquots μl לשימוש בניסויים נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ assay (א.ב.) של imidiazole 50 מ&quot;מימ, אשלגן כלורי mM 50 (KCl), 4 מגנזיום כלוריד מ&quot;מ (MgCl 2), אתילן גליקול 2 מ&quot;מ tetraacetic החומצה (EGTA), 6.7 pH. מסנן וסטרילי חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס biotinylated שור אלבומין (ביוטין-BSA) עד 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בא&quot;ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2.חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס streptavidin (SA) עד 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בא&quot;ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב20 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס α-קזאין עד 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בא&quot;ב. סנן עם מסנן מזרק מיקרומטר 0.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס ב100 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס dithiothreitol (DTT) במי deionized ב 200 מ&quot;מ. חנות ב -20 ° C ב100 aliquots μl, השתמש בשעות 8 הפשרה. יכול להיות refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס פקליטקסל (PT) בsulfoxide דימתיל HPLC כיתה (DMSO) בשעת 4 מ&quot;מ. חנות ב 10 aliquots μl ב -80 ° C לטווח ארוך, -20 ° C לטווח קצר. יש להשתמש תוך 8 שעות של הפשרה. יכול להיות refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר סוכר במי deionized במינון 120 מ&quot;ג / מ&quot;ל. חנות ב100 aliquots μl ב -20 ° C. יכול להיות refrozen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסלפתור אדנוזין טריפוספט (ATP) במי deionized ב150 מ&quot;מ, 7.0 pH. חנות ב 5 aliquots μl ב -80 ° C, השתמש בשעות 8 הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100x מניות חמצן הדחת 25 על ידי המסת 10000 גלוקוז אוקסידאז יחידות ויחידות 156.000 catalase לחיץ assay סך μl 600. צנטריפוגה בקצרה בmicrocentrifuge לגלולה מוצקה; supernatant סינון עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. חנות ב -80 ° C ב 10 aliquots μl לתקופות ארוכות, ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li></ol> 2. Microtubule הרחיפה Assay, הכנת פתרון באותו יום הכן את הפתרונים ב2.1-2.6 ביום של הניסוי. בעזרת תרגול, פתרונות 2.2-2.6 יכולים להיות מוכנים בזמן שטיפת זרימת תאים. אלא אם נאמר אחרת, לשמור פתרוני מניות על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן AB, 1 מ&quot;ל של חיץ assay עם 10 μl של DTT המניות (AB עם 2 המ&quot;מ DTT). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יו BSA חיץ, 40 &amp; mu; מערבל תערובת ביחס 1:1 של ביוטין-BSA המניות וא.ב.. שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ BSA, ערבוב 645 μl של AB עם 5.5 BSA μl (1 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA בא&quot;ב). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ SA, ערבוב 57 μl של AB עם מלאי streptavidin μl 3 (0.5 מ&quot;ג / המ&quot;ל streptavidin בא&quot;ב). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ α-קזאין, ערבוב 200 μl של BSA חיץ, מניית קזאין 50 μl, ו -0.8 μl של 15 מיקרומטר ATP (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​α-קזאין, 0.8 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA, 50 ננומטר-ATP בא&quot;ב). שמור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה, ערבוב 95 חיץ μl α-קזאין, מניית גלוקוז 2.5 μl, לערבב 1 μl 100x חמצן הדחה, מניית פקליטקסל 1 μl, μl 1 2-mercaptoethanol (βME). הוסף βME תחת מנדף. השתמש במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה בתוך 1 שעה של הכנת זהירות:. ΒME הוא רעיל מאוד וריח נורא. הקפד לפתוח רק במנדף. בקבוק בחנותהיעדר האור, אור מדרדר βME ויכולתו להפחית photobleaching. </li></ol> 3. Assay microtubule הרחיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות על ארבעה נתיבי זרימה בין coverslip 24 x 60 מ&quot;מ והמ&quot;מ coverslip 22 x 22 באמצעות גריז ואקום, extruded ממזרק דרך קצה פיפטה, כspacer. כל נתיב זרימה צריך להיות כ 10 μl בנפח (כרכים באים בקנה המידה בהתאם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 10 μl של חיץ ביו BSA לתוך כל סמטה. דגירת 5 דקות על מנת לאפשר לBSA מעייל משטחי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA μl 15 להסיר חופשי ביוטין-BSA, תוך המשך כדי לחסום את שקופית פני השטח. השתמש Kimwipe או נייר סינון כדי להסיר את החיץ מהצד השני של תא זרימה, להיות בטוח שלא לאפשר לבועות אוויר לצאת דרך חדר הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 15 μl SA-החיץ לתוך כל סמטה. חכה 10 דקות, או עד 2 שעות. Streptavidin יהיה לאגד את המשטח בכריכת ביוטין-BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את כל מסלול שלוש פעמים עם חיץ BSA 15 μl להסיר החופשי SA תוך כדי לחסום את שקופית פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את כל מסלולים עם 15 חיץ μl α-קזאין. α-קזאין מסייע לחסום נוסף מחייב שאינו ספציפי של kinesin וmicrotubules לזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל kinesin עד 10 ננומטר במאגר α-קזאין ותרחץ כל שביל עם 15 μl של kinesin זה - פתרון α-קזאין. חכה 15 דקות (או עד שעה) לkinesin biotinylated כדי לאגד באופן ספציפי לstreptavidin קרקע המאוגדת. התחומים המוטוריים kinesin יישארו חופשיים microtubules אגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל פקליטקסל ל40 מיקרומטר בטמפרטורת חדר חיץ α-קזאין, ותרחץ כל שביל עם 15 μl של פתרון זה לשטוף את kinesin החופשי ומראש לטעון כל תא זרימה עם פקליטקסל פתרון כדי למנוע מmicrotubules depolymerizing. קר גם depolymerizes microtubules, כדי לוודא שהצעדים הללו מתרחשים בטמפרטורת חדר עם החדר temperatuמחדש פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל כותרת fluorescently microtubules 1:100-1:1,000 במאגר פלואורסצנטי אנטי אקונומיקה עם mM ATP 1. שטוף 15 μl לנתיב אחד ולהתבונן בתוך 30 דקות. </li></ol> 4. איסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב microtubules הגלישה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; מיקרוסקופ מסוגל לפתור fluorophores הבודד כגון התקנת TIRF מסחרית או ביתי לבנות נדרש 26 (איור 2). את microtubules צריך להיות מונע על ידי מנועי kinesin על המצע בכ 0.5 מיקרומטר / s, תלוי בטמפרטורה. אם השדה של הנוף של המיקרוסקופ הוא 50 מיקרומטר, microtubules הבודד צריך להיות גלוי לכ 100 שניות. הגדרת עוצמת תאורה, כך שfluorophores הבודד לא photobleach מהר יותר מ 100 שניות. אם אתם משתמשים בעירור ליזר, הגדרת הספק של כ 3-5 mW היא מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רצפים של תמונות לניתוח. 600 תמונות ב5 הרץ (2 סך הכל דקות) עובד היטב. השתמש ברצפים ארוכים מספיק שmicrotubules חוצה את כל התחום של הנוף. </li></ol> 5. ניתוח נתונים שגרת IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro,</a> מצורפת. שגרה זו מחזירה ערך אורך התמדה מבוסס על כל microtubules הגלישה בתמונה ברצף נתון. כך או להפעיל את השגרה הזאת בכל תמונה ברצף, שינוי פרמטרים בעצימות בהתאם להגדרת מיקרוסקופ המסוימת שלך, או בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר כל fluorophore המצורף microtubule ליצור מסלולי fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את כל המסלולים של fluorophores על microtubule ניתן למסלול microtubule כלל החוזרים עבור כל microtubule בתמונה ברצף (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את זווית משיק לכל נקודה לאורך המסלול (איור 4)ולחשב &lt;cos θ s&gt; במשוואה. 1 על ידי ממוצעים של הקוסינוס של זווית ההבדל עבור כל זוג הנקודות המופרדות של הנתיב באורך (איור 5). מצא את אורך ההתמדה לmicrotubule בודד או קבוצת microtubules ידי &lt;cos ההולם של θ&gt; למשוואה. 1, שקלול נקודתי נתונים הבודדים בכושר על ידי מספר הערכים עצמאיים של cos θ s המשמשים לחישוב ממוצע. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+microtubules.">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length.">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li><li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model.">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102 (2008).</li><li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length.">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li><li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking.">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li><li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness.">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li><li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers.">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li><li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity.">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li><li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements.">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li><li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Gliding+assays"+for+motor+proteins:+A+theoretical+analysis.">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li><li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics.">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627 (2011).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea.">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li><li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential.">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li><li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+tensegrity+in+cell+mechanics.">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li><li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness.">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li><li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps.">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li><li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations.">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li><li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories.">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li><li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical biology of the cell. , (2008).</li><li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments.">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li><li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific,+high-precision+label+of+microtubules.">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li><li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+modified+tubulins.">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curve+reconstruction+from+unorganized+points.">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li><li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence.">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li><li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty.">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li><li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport.">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מדידות אורך התמדה הן אפיון טוב של התכונות המכאניות של biopolymers הבודד. במאמר זה, יש לנו תאר שיטה למדידת אורך ההתמדה של microtubules. כפי שצוין במבוא, שיטה זו היא להרחיב בקלות לבחינת מאפייני microtubule מכאניים במגוון רחב של תנאים פשוט על ידי שינוי את ריאגנטים, הטמפרטורה, או הצמיגות ב?...

Cytoskeleton, רשת של biopolymers נמצא ברוב התאים האיקריוטים, ממלא תפקיד בארגון סלולרי, תחבורה תאית, ומכניקת תא. המאפיינים המכאניים של biopolymers של cytoskeleton (בעיקר תקטין וmicrotubules) לשחק תפקיד משמעותי בקביעת התכונות המכאניות של התא ככולו 12. מאז שלמה מכניקה סלולרית יכולה לאפיין תאים בריאים וחולים 13,14 ומעורב בתנועתיות סלולריות 15, את התכונות המכאניות של רכיבי cytoskeletal הבסיסיים היו אזור פעיל של מחקר בשני העשורים האחרונים 1. הגמישות (או נוקשות) של biopolymers מאופיין באורך ההתמדה, אורכו של פולימר אשר מתכופף על ידי כ 1 רדיאן תחת תנודות תרמיות בטמפרטורת הסביבה. מספר הטכניקות פותח כדי למדוד אורך התמדה 16, לexampטכניקות פעילות le אשר כרוכות כיפוף הפולימר באמצעות זרימה הידרודינמית, מלכודות אופטיות, או שדות חשמליים 4,17,18, וטכניקות פסיביות אשר מודדות את התנודות של פולימרים חופשיים בפתרון 5,6. המדידות הפעילות, עם זאת, דורשות setups המיוחד כדי ליישם את הכוחות ידועים בסולם מיקרומטר, והמדידות, התנודות חופשיות יכולות להיות מאתגרות בשל דיפוזיה מחוץ למטוס של מוקד מיקרוסקופ בשימוש. במאמר זה, אנו מתארים, טכניקה משלימה, פסיבית כדי למדוד את אורך ההתמדה של microtubules, פולימר cytoskeletal. הטכניקה כוללת מבחני דאייה, אשר להבטיח כי הפולימר נשאר תמיד במישור המוקד של 19. יתר על כן, זה כרוך fluorophores מעקב הבודד מחובר באופן קבוע לפולימר של ריבית, כך שמקומות מסוימים לאורך הפולימר מאופיינים היטב. קריקטורה של השיטה מוצגת בFigurדואר 1. Kinesin נע במיוחד לקראת הסוף + של microtubules, כך microtubules בassay גלישה הם מונעים unidirectionally. הסוף המוביל של microtubule, מעבר kinesin האחרון צורף, הוא חופשי להשתנות תחת כוחות התרמיות של הפתרון שמסביב. כmicrotubule מונע קדימה, הסוף משתנה עד קשירת מולקולה חדשה kinesin המשך שקופית הזכוכית קופא בתנודות נתונות. בגלל kinesin מייחס microtubules חזק מאוד, microtubule מוגבל ללכת בדרך של הסוף המוביל. לכן, התנודות הסטטיסטיות שקפאו למסלול microtubule זהות לתנודות הסטטיסטיות של הקצה החופשי של 11 microtubules, ולכן יכולות לשמש כדי לחשב את אורך ההתמדה פי 20 <img alt="משוואה 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srג = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; איפה אני p הוא אורך ההתמדה של microtubule, θ s היא הזווית בין משיקים למסלול המופרד באורך של קו מתאר, ו&lt;&gt; מסמן ממוצע לאורך כל הזוגות של עמדות המופרדות באורך של קווי מתאר. Assay הגלישה עוצמה משתמש biotinylated kinesin ב21-הסליל מפותל קשורים באופן ספציפי לשקופית הזכוכית באמצעות הצמדת streptavidin-ביוטין. התקשרות זו מבטיחה כי התחומים המוטוריים חופשיים להיקשר ולהניע microtubules. על מנת לעקוב אחר מסלולי microtubule, microtubules מתויגים דלילות עם fluorophores אורגני 22,23 - התוויות חייבות להיות דלילות מספיק שfluorophores היחיד הם פתיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדה. fluorophores היחיד נמצאים במעקב באמצעות שגרת ניתוח תמונה נכתבה בIDL. המסלולים שכל fluorophore חייבים מיקרופון ניתןrotubule משולבים לתוך מסלול microtubule מורכב באופן אוטומטי 24. זוויות θ לכל נקודה לאורך מסלול המשיקות מחושבות; מזוויות משיקות אלה &lt;cosθ של&gt; הערך מחושב לכל אורכו של קו מתאר. לבסוף, נתונים אלה מתאימים למשוואה. 1 כדי לחלץ אורך התמדה לmicrotubule נתון, או לmicrotubules רב באותו assay הדאייה. השיטה היא חזקה מספיק כדי לעבוד עם microtubules הוכן במגוון רחב של מצבים (עם סוכנים שונים מייצבים או מולקולות קטנות אחרות מאוגדים לmicrotubule, עם חלבונים מאוגדים microtubule קשור (מפות), או עם מגוון רחב של פתרונות צמיגים). במעבדה שלנו, הטכניקה נעשתה שימוש כדי לאפיין את אורך ההתמדה של microtubules כפונקציה של אורך לאורך microtubules וmicrotubules עם סוכני מייצבים שונים. המגבלה העיקרית היא שmicrotubules חייב עדיין שלתנועתיות upport kinesin. מאז kinesin הוא אנזים מנוע חזק, זוהי מגבלה די רופפת. על ידי החלפת microtubules עם אקטין וkinesin עם משפחת אנזים מיוזין, אורך ההתמדה של אקטין יכול להימדד באותה הטכניקה.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; ריאגנטים</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazole</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אשלגן כלורי</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מגנזיום כלוריד</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinylated BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-קזאין</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidin</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dithiothreitol</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פקליטקסל</td&gt;<td&gt; מעבדות LC</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקוז אוקסידאז</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalase</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקוז</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ה-ATP</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoethanol</td&gt;<td&gt; סיגמה אולדריץ</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; רעיל. קנה כמות קטנה.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24X60 מ&quot;מ מס &#39;1 1/2 כוס כיסוי</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 מ&quot;מ מספר 1 מכסה זכוכית</td&gt;<td&gt; זהב חותם</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גריז ואקום גבוה</td&gt;<td&gt; דאו-קורנינג</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; ציוד</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מיקרוסקופ TIRF</td&gt;<td&gt; רב</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; מיקרוסקופ TIRF השתמש בשיטה זו היה התוצרת בית.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (תוכנה)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; יכול להחליף MATLAB, ImageJ, או תוכנת ניתוח תמונה אחרת.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

Microtubules הם פולימרי cytoskeletal אשר ממלאים תפקיד בחלוקת תאים, מכניקה של תאים, ותחבורה תאית. כל אחת מהפונקציות הללו דורש microtubules שנוקשים וישר מספיק כדי להקיף חלק משמעותי של קוטר התא. כתוצאה מכך, אורך microtubule התמדה, מידה של נוקשות, נחקר באופן פעיל בשני העשורים האחרונים 1. עם זאת, נותרו שאלות פתוחות: microtubules הקצר הם 10-50 פעמים פחות נוקשה מאשר microtubules הארוך 2-4, ואפילו microtubules הארוך מדד אורכי התמדה המשתנים על פי סדר הגודל 5-9. כאן, אנו מציגים שיטה למדידת אורך התמדת microtubule. השיטה מבוססת על בדיקת גלישת microtubule kinesin מונחה 10. על ידי שילוב של ניאון תיוג דליל של microtubules הבודד עם מעקב אחת של חלקיק הבודד fluorophores המצורף לmicrotubule, glidinמסלולי G של microtubules הבודד מתבצעים מעקב בדייקנות ננומטר ברמה. אורך ההתמדה של המסלולים הוא זהה לאורך ההתמדה של microtubule בתנאים המשמשים 11. שגרת מעקב אוטומטית משמשת ליצירת מסלולי microtubule מfluorophores המצורף לmicrotubules הבודד, ואורך ההתמדה של מסלול זה מחושב באמצעות רוטינות שנכתבו בIDL. טכניקה זו היא מהירות ישימה, ומסוגל למדוד את אורך ההתמדה של 100 microtubules ביום אחד מניסויים. השיטה ניתן להאריך למדידת אורך התמדה תחת מגוון רחב של תנאים, כולל אורך התמדה כפונקציה של אורך יחד microtubules. יתר על כן, את שגרת הניתוח משמשת יכולה להיות מורחבת למבחני שרירן מבוסס משחק גלישה, כדי למדוד את אורך ההתמדה של סיבי יקטין גם כן.

תמונת מצב מבדיקת גלישה מוצגת באיור 2. צפיפות microtubule טובה היא microtubules 1-10 לשדה הראייה; משמעותי יותר יגרום mistracking כmicrotubules חוצים זה את זה. עלילה של מסלולי 11 microtubule מבדיקת הגלישה באיור 2 מוצגת באיור 3. מסלולים אופייניים הם ארוכים 10-30 מיקרומטר; כמה מס?...

Watch this Scientific Journal Video about Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays at JoVE.com

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  Lawrence University. שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.

Video: Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

מולקולרי הסתבכות וElectrospinnability של Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

שיטות העצמי הוא השילוב של Biopolymers Megamolecular על ממשק האוויר-LC הייבוש

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

מידות קלט כוח ריאקטורים מנוער בקנה מידה מעבדה

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

מילימטר סולם Flexural בדיקות מערכת למדידת התכונות המכאניות של הספוג הימי Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.