우리는 기술 지원을 위해 Tzlil Rozenblat, 알렉산드라 Bello와 칼 Spuhler 감사드립니다. 이 작품은 대학은 대학 학사 연구 여름 연구소 (URSI), 루시 Maynard 연어 연구 기금과 NASA 수상 # NX09AU90A, 과학 기술의 연구 우수상 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 센터 (NSF-문장) 수상 # 0,630,388 및 NSF에 의해 지원되었다 수상 # 1058385.

1. C. 비디오 분석을위한 elegans 준비 <ol><li> 얇은 플랫 백금 와이어 곡괭이를 사용하여 신선한 NGM 한천이 가득한 페트리 접시에 10-20 gravid 성인 nematodes를 이동합니다. NGM 한천로 가득 페트리 요리 E.의 작은 원형 반점을 포함 대장균 먹을 수 nematodes에 대한 (성장 제한 스트레인, OP50은 최상의 결과를 제공합니다). nematodes은 3-5 시간에 알을 낳기 위해 허용하고 따라서 50-150 nematodes의 작은 발달 - 동기화 문화를 확립, 성인을 제거합니다. nematodes 4-5 일 동안 20 ° C에서 페트리 접시를 잠복기에 의해 초기 성인기로 성장할 수 있습니다. 이러한 문화 방식은 설립 절차 (Stiernagle 2006)을 기반으로합니다. 5 </li><li> 비디오 분석의 일에 따라서 동기화 문화 50-150 웜를 수집, deionized, 증류수 1 ML과 젊은 성인 nematodes의 접시를 플러시. M9 또는 PBS와 같은 완충 용액도 사용하실 수 있습니다. w를 회전 할 microcentrifuge를 사용하여튜브의 하단하거나 15 분 동안 중력에 의해 정착 할 수 있도록 orms. 관에서 물의 대부분을 제거하고 nematodes에서 모든 준수 세균을 씻어하기 위해 deionized, 증류수 1 ML로 교체. </li><li> micropipette를 사용하여 석영 큐벳에 물이나 버퍼에 nematodes을 전송합니다. 한 번에 한 선충류는 레이저로 조명 될 가능성이 있도록이 한 번 또는 더 적은에서 총 5-10 nematodes에 대해, 적은 수의 작업하는 것이 중요합니다. 문화 접시에 nematodes의 숫자가 너무 큰 경우에는 원하는 밀도에 도달 할 때까지 물이나 버퍼에있는 벌레를 희석. 그것은을 씻고 큐벳에 개별 웜을 전송하는 새로운 한천 플레이트에 물이나 버퍼의 한 방울에 개별 nematodes을 선택하는 것도 가능합니다. 우리의 연구에서 우리는 행동을 수영에 대한 물리적 제약의 효과를 조사 할 1mm, 2 mm와 5mm 큐벳 크기를 사용했습니다. </li></ol> 2. 비디오 Analysi에 대한 광학 설정에스 <ol><li> 할 수있는 543 나노 미터 (녹색) 헬륨 - 네온 (HeNe) 레이저, 두 전면 표면 알루미늄 거울, 큐벳 홀더, 프로젝션 스크린, 고속 카메라 (건반 고속 Exilim)를 사용하여 그림 1에 표시된 설정을 수행 ~ 240 FPS에서 촬영. 두 거울은 큐벳을 통해 레이저 빔을 조정하는 데 사용됩니다. 큐벳의 다른 크기는 연구의 특성에 따라 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 수영 주파수 공간 제약의 효과를 표시 할 수 두께 5mm 아르 큐벳를 사용했습니다. 레이저 빔은 오버 샘플링을위한 요구 사항을 충족해야하며. 즉, 조직은 레이저 빔의 더 이상보다 세째을 방해한다. C.에 대한 이 선충류와 상호 작용하는 경우 elegans는 레이저 빔의 직경은 약 2 mm해야합니다. 회절 패턴이 찾을 어려울 수 있기 때문에 레이저 빔 직경 5mm보다 클 수 없습니다. 화면에 diffracting 유기체의 거리보다 훨씬 커야합니다유기체 자체. </li><li> 장소는 큐벳의 맨 위에 parafilm과 물 열에 nematodes를 섞어을 반전. 웜은 큐벳의 상단에 처음하는 일이 없도록 큐벳 홀더에 큐벳를 놓습니다. 거울 사용하여 큐벳의 중심을 통해 레이저 빔을 조종. nematodes은 물보다 밀도가 있기 때문에 같은 시간에 물이 항목에서 수영을하는 동안, 그들은 천천히, 큐벳의 바닥에 떨어질 것입니다. </li><li> 전송 빔이 투영 화면 (그림 2) 충족 투영 화면, 색상에 검은 전송 레이저 빔에 해당하는 곳 분산을 줄일 수 있습니다. 또는 전송 빔이 화면을 통과 할 수 있도록 투영 화면에 구멍을 넣어. 제거하거나 전송 빔의 산란을 줄여하면 전송 빔으로 인해 포화에서 카메라의 CCD 어레이를 유지합니다. </li><li> 회절 패턴의 크기의 측정을 캡처하려면이 줄을 긋다diffracted 빛 이미지 방해없이 전송 레이저 빔 스폿 옆에 투영 화면에 대한 5cm. </li><li> 객실 빛에 따라서 5cm 라인 회절 이미지와 같은 장면에 있다는 것입니다 동안 카메라로 녹화를 시작합니다. 객실 라이트를 켜십시오. 카메라 화면에 기록 회절 이미지 웜은 레이저 빔을 통과 있습니다. </li></ol> 3. 비디오 데이터 준비 <ol><li> : 비디오 분석 프로그램 (로거 프로 설치 <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/를</a> 컴퓨터에). 비디오 분석 프로그램에 비디오를 가져 오기 </li><li> 전송 레이저 스폿과 일치 할 수있는 근원을 설정합니다. 투영 화면에 5cm 줄을 사용 규모를 설정합니다. </li><li> 비디오 분석 소프트웨어를 사용하여 각 선충류에 의해 형성된 회절 이미지의 각도 변위 (그림 3)을 추적 </li><li> angula를 찾으려면스프레드 시트 (엑셀)로 아크 탄젠트 (Y / X), 복사 및 붙여 넣기 데이터를 복용하고 연속 그래프 (Figure. 4) 생산 모든 부정적인 각도 180 ℃ 일 또는 π를 추가하여 R 변위. </li></ol> 4. 수영 주파수의 실시간 관찰을위한 실시간 데이터 수집 <ol><li> 비디오 분석을위한 동일한 설정을 사용하여 마우스 오른쪽 투영 화면의 앞의 회절 패턴에 중심을 벗어난 작은 영역 (~ 1mm 2)와 포토 다이오드를 (ThorLabs에서 DET10A) 넣습니다. </li><li> USB 포트를 통해 컴퓨터에 연결하는 디지털 오실로스코프 (피코 기술에 의해 만들어진 PicoScope)에 포토 다이오드를 연결합니다. 컴퓨터 화면에서 대패 패턴을 관찰합니다. </li><li> ASCII 또는 텍스트 형식으로 인수 데이터 세트를 저장합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 데이터가 치 평방 최소화를 사용하여 피팅 파형 할 수있는 데이터 분석 프로그램에 비디오 나 포토 다이오드를 사용하여 획득 가져 오기. 여기에 사용 된 프로그램은 (출처 <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). 탈곡 주파수를 (도 4 및 5) 결정하는 정현파 곡선을 맞추기. </li><li> 평균 수영장 다양한 샘플의 주파수와 편차를 결정합니다. 본 연구의 경우, 데이터는 통계적으로 Bonferroni 다중 비교 테스트에 이어 단일 요소 ANOVA를 사용하여 분석 하였다. &lt;0.05의 P-값은 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다. </li></ol> 6. 예를 들어 Mathematica를 사용하여 모델 회절 패턴 참고 : 회절 패턴은 여러 가지 계산 도구를 사용하여 모델링 할 수 있습니다. 이 절차는 MATLAB, 엑셀 등 다양한 전산 도구, 원산지 등에 다를 수 있습니다 <ol><li> 이미지 만들기 : 전통 현미경을 사용하여 현미경 슬라이드에 nematodes의 이미지를보십시오. </li><li> 이미지를 Binarize : 가져 오기 웜 이미지 &#39;웜&#39;전Mathematica로 이미지를 드래그하여 n 인물 Mathematica. 흑백 이미지 (binarize)로 이미지를 변환합니다. 이 작업은 Mathematica의 &#39;Binarize&#39;명령으로 달성 될 수있다 : BlackandWhiteImage = Binarize [웜]. 이미지가 흑백 이미지로 볼 수 있습니다. EdgeDetect [웜, 6.0,0.035] 두 후행 숫자가 결과 가장자리의 거침을 제어 : 또는 BlackandWhiteImage을 만들 수있는 &#39;EdgeDetect&#39;명령을 사용합니다. </li><li> 0과 사랑하는 사람들의 행렬로 이미지를 변환 :이은 Mathematica의 &#39;ImageData&#39;명령으로 달성 될 수있다 : 매트릭스 = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> 푸리에 변환 매트릭스 : 지정된 FourierParameters를 사용하여 행렬을 변환 푸리에에 Mathematica의 &#39;푸리에&#39;명령을 사용하여 FTransform = 푸리에 [매트릭스, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> 매트릭스의 광장 계수는 회절 매트릭스를 얻을 및 이미지 대비를 개선하는 방법은 다음과 같습니다 절대 광장매트릭스의 값과 원본 이미지에 해당하는 회절 패턴입니다 결과 이​​미지를 볼 수 있습니다. 또한, 이미지의 대비를 확장 할 수있는 &#39;로그&#39;기능을 사용 ImageContrast = 이미지 [로그 [1 + (ABS [FTransform]) ^ 2] / 0.5]. </li><li> 쉽게 볼 이미지 크기 조정 내기 : 중앙 회절 패턴을하고 원하는대로 조정될 크기 : ImageResize [ImageContrast [Y, 100], 500]. </li><li> 자유롭게 헤엄 웜에서 얻은 회절 패턴과 모델을 회절 패턴을 비교합니다. (그림 6) </li></ol>

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	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 실시간 운동의 측정과 현미경의 사용을 필요로하지 않습니다 nematodes 같은 미세한 미생물에서 간단한 locomotory 행동에 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 8이 방법 론적 접근 방법도 protists 같은 수많은 미세한 미생물을 연구에 활용 될 수 있습니다. 이 방법은 사용 빛의 파장에 의해 제한됩니다. 조직은 빛의 파장보다 작은이 아니어야합니다. 필요한 장비의 비용 절감과 휴대뿐만 아니라,이 접근법의 하나 장점은 현미경 이미지 비행기의 좁은 제약없이 실시간으로 세 차원의 행동을 측정 할 수있는 능력입니다. 이 기술은 현미경 기반의 접근 방식을 사용하여 공부 할 수없는 행동에 중력의 힘이나 여러 다른 조건의 영향을 조사하기 위해 함께도 가능합니다. 9 따라서, 우리는 미생물 자연 locomotory beha의 더 나은 이해를 얻을 수 있습니다현미경 슬라이드 방울 또는 전문 마이크로 유체 챔버 (파크 외, 2008)의 굴레에서 해방 viors 10. 회절 패턴의 위상 정보의 부족 원방 회절 패턴이 푸리에 변환의 절대 값의 제곱에 비례하기 때문에 diffracting 객체에 해당하는 이미지의 직접 검색을 허용하지 않습니다. 그들이 자유롭게 헤엄 nematodes (그림 6)의 회절 패턴과 일치 할 수 있도록 따라서 웜 이미지에서 회절 패턴을 계산합니다. 이 방법은 진정으로 자유롭게 C. 수영에 대한 결과가 생긴 elegans와 어떤 미세한 종에 적용 할 수있는 물이나 여러 가지 이온 솔루션과 같은 광학 투명 환경에서 연습. 기존 현미경은 마이크로 미터의 순서에 초점 깊이 연구 만 할 수 있습니다. 11이 제한된 때문입니다빛을 초점 피사계 심도 : <img alt="수식 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> 이 회절 방법은 확실히 기존의 현미경을 대체 아니지만 N은 짧은 초점 길이가 큰 C와 연결되어 있으므로 혼동 (C)의 원과 상호 관계를 맺고 F-번호입니다. 12,13, 그건 할 수있는 곳 그렇게 빨리 종 더 적은 비용으로 실시간으로 조작 할 수 양적 결과를 제공합니다. 회절 패턴은 어떤 레이저 포인터를 얻을 수 있습니다. 회절 패턴은 일반 디지털 카메라를 사용하여 감소 시간적 해상도로 촬영 할 수 있습니다. 사용자가 쉽게 사용할 수있는 현미경이나 광 다이오드가없는 수 있지만, 이러한 탈곡 주파수를 측정하고 회절 패턴을 평가하는 등이 실험의 핵심 부품은 매우 적은 비용으로 완료 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 543 nm의 HeNe 레이저 </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> 이하 5 MW로 보이는 범위에 포함되지 않는 모든 레이저가 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 이 전면 표면 알루미늄 거울 </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> 고속 Exilim 카메라 </td><td> 건반 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 석영 큐벳 </td><td> Starna 셀 </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (소프트웨어) </td><td> 버니어 </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> 볼프람 </td><td></td><tD&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

토양 및 수생 미세한 미생물들은 살고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 미세 유기체의 행동의 대부분은 연구 반면, 우리는 실시간 분석을 제공하는 새로운 분석 방법을 제시 좁은 거의 2 차원 초점 필드에 움직임과 행동을 제한 현미경 기반의 접근 방법 1.를 사용하여 수행되었습니다 자유롭게 C. 수영 현미경 기반의 장비에 의존하지 않고 큐벳에서 elegans. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다. 우리는 자유롭게 수영을 nematodes에 대한 진동 주파수를 측정합니다. 원방 회절 패턴 분석 nematodes의 파형에 대한 단서를 드러내고있다. 회절은 개체 주위에 절곡 빛의 과정입니다. 이 경우에는 빛이 생물에 의해 diffracted입니다. 빛 파도가 방해 및 광고 게재를 형성 할 수iffraction 패턴. 화면에 객체 거리가 diffracting 객체보다 훨씬 큰 경우 멀리 필드, 또는 Fraunhofer, 회절 패턴이 형성된다. 이 경우 회절 패턴은 푸리에 변환을 사용하여 (모델화) 계산 될 수있다. 2 C. elegans의 세 차원에서 탐색 무료 생활 토양 - 사는 nematodes 있습니다. 그들은 크롤링라는 정현파 locomotory 패턴과 수영라는 다른 패턴의 액체에서 흙이나 한천 같은 고체 매트릭스에 모두 이동합니다. 3 역할은 mechanosensory, chemosensory 및 locomotory에 플라스틱 변경 사항을 적용 thermosensory 세포에 의해 제공 감각 정보에 의해 연주 패턴에 패턴 및 스위치는 elucidated 수하기 시작합니다. 우리는 현미경을 필요로하지 않습니다 그리고 우리가 다른 공동에서 선충류의 운동의 복잡성을 탐험하기 시작 할 수있게 될 것 가로, 세로, 높이로 선충류의 운동을 측정하는 광학 방식을 설명 4nditions.

<html> 예를 들어, 우리는 C.을 공부 다양한 석영 큐벳 1cm, 두께 5mm와 4cm 높이 큐벳에서 elegans. 비디오 분석을 사용하여 하나의 웜을 샘플링, 5mm 두께의 큐벳에서 비디오 분석에서 얻은 평균 수영 주파수는 2.5 Hz에서 (그림 4)입니다. 마찬가지로, 실시간 데이터 수집 방법을 사용하여 하나의 웜을 샘플링, 우리는 2.7에 대한 Hz에서 (그림 5)의 수영장 주파수를 얻을 디지털 오실로스코프 (PicoScope)를 사용합니다.이 절차는 많은 벌레 반복 할 수 있습니다. 자유롭게 헤엄 웜에 대한 자세한 연구가 5mm 큐벳에 2.37 Hz의 평균 수영장 주파수를 공개했다. 6 예상대로, 수영 주파수는 크롤링 웜 (~ 0.8 Hz에서)에 대한보다 높은 것입니다. 3이 회절 방법을 사용하여 C.의 평균 수영 주파수 현미경 슬라이드에 국한되어있다 elegans은 2 Hz의 이전에 다음 ID로 출판 값과 일치하는 것으로 확인되었습니다. 1,7 ve_content는 &quot;&gt; 다음 절차 3.) 후 6). 기존의 현미경으로 얻은 웜 이미지의 도움으로 회절 패턴을 수영의 모델링 할 수 있습니다. 모델화 회절 패턴은 C. elegans의 수영주기를 (시뮬레이션하는 데 사용됩니다 그림 6). 성공적인 모델은 수영 주파수를 일치 물리적으로 가능한 연속 수영 패턴으로 구성되어 있습니다.이 수영 사이클의 처음과 같이 웜은 수영주기의 끝 부분에 동일한 모양에 있어야합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> 그림 1. 녹색 HeNe 레이저 라이브 C.를 사용하여 동적 회절 패턴을 생성하는 데 사용 된 elegans. 이 회절 패턴은 240 프레임으로 촬영했습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> 그림 2. 드라<html> 날개는 검은 색 점은 전송 빔의 흡수를 증가시킵니다. 분산 된 광으로 인해 카메라의 채도가 감소하고 회절 패턴은 표시되고 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> 그림 3은. 추적하는 웜 회절 패턴과의 영상 분석 소프트웨어의 스크린 샷 (로거 프로). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> 그림 4. 5mm 큐벳에 선충류의 수영주기에 해당하는 비디오 데이터입니다. 곡선 맞는 ~ 2.5 Hz의 주파수 수영을 드러내고있다. &quot;/&gt; 그림 5. 5mm 큐벳에 선충류의 수영주기에 해당하는 실시간 데이터입니다. 곡선 맞는 ~ 2.7 Hz의 주파수 수영을 드러내고있다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> 그림 6. 상단 행은 실제 회절 패턴을 나타내며 아래쪽 행에있는 모델을 회절 패턴을 일치합니다. 모델을 회절 패턴은 현미경 슬라이드 (중간 행)에 웜을 사용하여 제작되었다.

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Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

자유 수영 선충류와 같은 미세한 미생물<em&gt; C. elegans</em&gt; 생활하고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 우리는 분석을 제공하는 새로운 접근 방식을보고<em&gt; C. elegans</em&gt; 회절 패턴을 사용합니다. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다.

자유롭게 미생물 수영의 양적 운동 연구는 레이저 회절을 사용하여

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K 조회수.  Vassar College. 자유 수영 선충류와 같은 미세한 미생물 C. elegans 생활하고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 우리는 분석을 제공하는 새로운 접근 방식을보고 C. elegans 회절 패턴을 사용합니다. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

연구

생체공학

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 공동 축류 초점 장치를 사용하여 이중 에멀젼 생성

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

심근 구조, 기능의 생체 양적 평가에서 관류 및 생존 능력은 심장 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

주의 골 기능 재생성 된 대 퇴 골으로 이어지는 쥐 모델에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

혈관 시각화를 위한 이중 래스터 스캐닝 광음향 소형 동물 이미지

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...