Ringraziamo Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello e Karl Spuhler per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Summer Institute Collegio Undergraduate Research Vassar (URSI), Lucy Maynard fondo di ricerca Salmone e il premio NASA # NX09AU90A, National Science Foundation Centro di Eccellenza di Ricerca in Scienza e Tecnologia (NSF-CREST) ​​premio # 0630388 e il NSF premio # 1.058.385.

1. C. Preparazione elegans per l&#39;analisi video <ol><li> Spostare 10-20 nematodi adulti gravide a nuove NGM agar pieni di piastre di Petri con un sottile, appiattito scelta filo di platino. I piatti Petri riempite con l&#39;agar NGM contengono una piccola macchia circolare di E. coli (un ceppo crescita limitata, OP50, dà i migliori risultati) per i nematodi da mangiare. Lasciare i nematodi a deporre le uova per 3-5 ore e quindi rimuovere gli adulti, stabilendo così un piccolo, cultura evolutivamente sincronizzata di 50-150 nematodi. Lasciare i nematodi a crescere alla prima età adulta incubando le piastre Petri a 20 ° C per 4-5 giorni. Questi metodi di coltura sono basati su procedure stabilite Stiernagle (2006) 5. </li><li> Il giorno della video analisi, lavare un piatto di nematodi giovani adulti con 1 ml di acqua deionizzata, acqua distillata, quindi raccogliendo 50-150 vermi dalla cultura sincronizzato. Una soluzione tampone PBS come M9 o può anche essere usato. Utilizzare una microcentrifuga per far girare il wORM al fondo del tubo, o perché possano stabilirsi per gravità per circa 15 min. Rimuovere la maggior parte dell&#39;acqua dal tubo e sostituirlo con 1 ml di acqua deionizzata, acqua distillata per lavare i batteri aderenti ai nematodi. </li><li> Trasferire nematodi in acqua o tampone in una cuvetta di quarzo con una micropipetta. È importante lavorare con un numero piccolo, circa 5-10 nematodi in totale in una sola volta o anche meno in modo che un nematode alla volta può essere illuminata dal laser. Se il numero di nematodi sulle piastre di coltura è troppo grande, diluire i vermi in acqua o tampone fino a densità desiderata. È anche possibile scegliere nematodi singoli una goccia d&#39;acqua o tampone su una piastra di agar fresco per lavarli e trasferire vermi individuali nella cuvetta. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato 1 mm, 2 mm e 5 formati cuvette mm per esaminare gli effetti dei vincoli fisici a nuotare comportamento. </li></ol> 2. Configurazione ottica per l&#39;analisi dell Videos <ol><li> Eseguire l&#39;installazione come indicato nella figura 1 con una 543 nm (verde) elio-neon (HeNe) laser, due front-superficie specchi in alluminio, un supporto cuvetta, uno schermo di proiezione, e una telecamera ad alta velocità (High Speed ​​Exilim Casio) in grado di riprese a ~ 240 fps. I due specchi sono utilizzati per dirigere il fascio laser attraverso la cuvetta. Di dimensioni diverse cuvette può essere utilizzato a seconda della natura dello studio. A titolo di esempio, abbiamo usato le cuvette spessore di 5 mm per mostrare gli effetti dei vincoli spaziali sulle frequenze di nuoto. Il raggio laser deve soddisfare i requisiti di sovracampionamento,. Cioè, l&#39;organismo deve ostruire non più di un terzo del raggio laser. Per C. elegans, il laser deve essere di circa 2 mm di diametro quando interagisce con un nematode. Il raggio laser non dovrebbe essere maggiore di 5 mm di diametro in quanto il modello di diffrazione sarà difficile da individuare. La distanza dal microrganismo diffrazione alla schermata dovrebbe essere molto più grandel&#39;organismo stesso. </li><li> Parafilm posto sopra la parte superiore della cuvetta e capovolgere per miscelare i nematodi nella colonna d&#39;acqua. Posizionare la cuvetta in un porta cuvette in modo che i vermi sono inizialmente vicino alla parte superiore della cuvetta. Utilizzando gli specchi, dirigere il raggio laser attraverso il centro della cuvetta. Poiché i nematodi sono più pesanti dell&#39;acqua, essi lentamente cadono sul fondo della vaschetta, mentre allo stesso tempo nuotando nella colonna d&#39;acqua. </li><li> Sulla proiezione schermo, colore posto corrispondente al fascio laser trasmesso nero per ridurre la dispersione del fascio trasmesso incontra lo schermo di proiezione (Figura 2). Alternativamente mettere un&#39;apertura nello schermo di proiezione per consentire al fascio trasmesso a passare attraverso lo schermo. Eliminando o riducendo dispersione dal fascio trasmesso manterrà la matrice CCD della telecamera dalla saturazione dovuta al fascio trasmesso. </li><li> Per catturare una misura delle dimensioni del modello di diffrazione, tracciare una linea dicirca 5 cm sullo schermo di proiezione vicino al punto del fascio laser trasmesso senza interferire con l&#39;immagine luce diffratta. </li><li> Avviare la registrazione con la fotocamera, mentre la luce della stanza è accesa in modo che la linea a 5 cm è lo stesso filmato su come le immagini di diffrazione. Spegnere il luce della stanza. Diffrazione registrare le immagini sullo schermo con la macchina fotografica come vermi passano attraverso il raggio laser. </li></ol> 3. Video Preparazione dei dati <ol><li> Installare il programma di analisi video (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> ) sul computer. Importare il video nel programma di analisi video </li><li> Impostare l&#39;origine a coincidere con il punto laser trasmesso. Imposta la scala utilizzando i 5 cm linea sullo schermo di proiezione. </li><li> Monitorare lo spostamento angolare dell&#39;immagine diffrazione formata da ciascuna nematode utilizzando il software di analisi video (Figura 3) </li><li> Per trovare l&#39;angolazionespostamento r prendendo la arctan (y / x), copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo (Excel) e aggiungere 180 gradi o π per tutti gli angoli negativi per produrre un grafico continuo (Figure. 4). </li></ol> 4. Acquisizione dati in tempo reale per l&#39;osservazione istantanea delle frequenze Nuoto <ol><li> Utilizzando la stessa impostazione per l&#39;analisi video, inserire un fotodiodo (DET10A da Thorlabs) con una piccola area (~ 1 mm 2) fuori centro nella figura di diffrazione di fronte allo schermo di proiezione. </li><li> Collegare il fotodiodo per l&#39;oscilloscopio digitale (PicoScope fatto da Pico Technology) che si collega al computer tramite porta USB. Osservare i modelli thrashing sullo schermo del computer. </li><li> Salva set di dati acquisiti in formato ASCII o di testo. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Importare i dati acquisiti mediante video o il fotodiodo in un programma di analisi dei dati in grado di forme d&#39;onda raccordo con chi quadrato minimizzazione. Il programma usato è di origine ( <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Adattare una curva sinusoidale per determinare la frequenza thrashing (figure 4 e 5). </li><li> Frequenze nuoto media di vari campioni e di determinare la varianza. Per questo studio, i dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando un singolo fattore ANOVA seguita dal test di Bonferroni comparazioni multiple. Un p-value &lt;0,05 è stato considerato statisticamente significativo. </li></ol> 6. Modello Motivi di diffrazione utilizzando Mathematica come esempio Nota: i modelli di diffrazione può essere modellato utilizzando molti strumenti diversi di calcolo. Questa procedura sarà diverso per i diversi strumenti di calcolo come Matlab, Excel, Origin, ecc <ol><li> Crea immagine: Prendere le immagini di nematodi su un vetrino da microscopio utilizzando un microscopio tradizionale. </li><li> Binarizzare immagine: importare &#39;Worm&#39; l&#39;immagine di vite senza fine into Mathematica trascinando l&#39;immagine in Mathematica. Convertire l&#39;immagine in un&#39;immagine in bianco e nero (binarizzare). Ciò può essere ottenuto con il comando &#39;binarizzare&#39; in Mathematica: BlackandWhiteImage = binarizzare [Worm]. L&#39;immagine può quindi essere vista come una immagine in bianco e nero. In alternativa, utilizzare il comando &#39;EdgeDetect&#39; per creare un BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], dove i due numeri finali controllare la grossolanità dei bordi che ne derivano. </li><li> Convertire un&#39;immagine in una matrice di zeri e di uno: Ciò può essere ottenuto con il comando &#39;ImageData&#39; in Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Trasformata di Fourier matrice: Utilizzare il &#39;Fourier&#39; comando in Mathematica per trasformata di Fourier della matrice utilizzando le FourierParameters indicati: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Modulo quadrato della matrice per ottenere la matrice di diffrazione e di migliorare il contrasto dell&#39;immagine: Square l&#39;assolutovalore della matrice e visualizzare l&#39;immagine risultante, che è la figura di diffrazione corrispondente all&#39;immagine originale. Inoltre, utilizzare la funzione &#39;Log&#39; per scalare il contrasto dell&#39;immagine: ImageContrast = Immagine [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Ridimensiona immagine per una facile visualizzazione: Ritaglia il modello centrale di diffrazione e ridimensionare a piacere: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Confronta i pattern di diffrazione modellati con figure di diffrazione ottenuti da vermi liberamente nuoto. (Figura 6) </li></ol>

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	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio per la misurazione in tempo reale di movimento e semplici comportamenti locomotore in organismi microscopici come i nematodi, che non richiedono l&#39;uso di microscopi. 8 Questo approccio metodologico potrebbe essere utilizzato anche per lo studio di numerosi organismi microscopici come i protisti. Questo metodo è limitato solo dalla lunghezza d&#39;onda della luce utilizzata. L&#39;organismo non deve essere inferiore alla lunghezza d&#39;onda della luce. Oltre al risparmio di costi e portabilità del dispositivo necessario, uno dei principali vantaggi di questo approccio è la capacità di misurare il comportamento in tempo reale e in tre dimensioni, senza i vincoli stretti di piani di immagini al microscopio. È anche possibile con questa tecnica per esaminare influenze di forze gravitazionali o numerose altre condizioni sul comportamento che non possono essere studiati utilizzando microscopio approcci. 9 Così, si può ottenere una migliore comprensione del microrganismo naturale locomotoria Behaviors liberati dai confini della goccioline vetrino da microscopio o specializzati camere microfluidici (Park et al, 2008). 10 La mancanza di informazioni di fase in un modello di diffrazione non consente il recupero diretto dell&#39;immagine corrispondente all&#39;oggetto diffrazione poiché il campo lontano modello di diffrazione è proporzionale al quadrato del valore assoluto della trasformata di Fourier. Siamo quindi calcolando diffrazione da verme immagini in modo che possano essere confrontati con i modelli di diffrazione di nematodi liberamente nuoto (Figura 6). Questo metodo ha prodotto risultati per davvero nuotare liberamente C. elegans e può essere applicato a qualsiasi specie microscopiche che manovre in un ambiente otticamente trasparente come acqua o diverse soluzioni ioniche. Microscopi convenzionali consentono solo studi con una profondità focale dell&#39;ordine di micrometri. 11 Questo è dovuto alla limitataprofondità di campo per mettere a fuoco la luce: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> dove il numero f N ha un rapporto reciproco con il cerchio di confusione (c) in modo che una breve lunghezza focale è associata ad un grande c. 12,13 Mentre questo metodo di diffrazione non è certamente un sostituto per microscopia convenzionale, è in grado per fornire risultati quantitativi rapidamente, in modo che le specie possono anche essere manipolati in tempo reale a basso costo. I pattern di diffrazione può essere ottenuta con qualsiasi puntatore laser. I pattern di diffrazione può essere filmato con una risoluzione temporale ridotta utilizzando una normale fotocamera digitale. Mentre l&#39;utente non può avere un microscopio o un fotodiodo prontamente disponibile, le parti principali di questo esperimento come misurare frequenze thrashing e valutare modelli di diffrazione può essere completata a costi estremamente bassi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 543 nm Laser HeNe </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> Qualsiasi laser nel visibile con meno di 5 mW può essere utilizzato. </td></tr><tr><td> 2 superficie frontale in alluminio Specchi </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> Macchina fotografica ad alta velocità Exilim </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Quarzo Cuvette </td><td> Starna Cells </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Software) </td><td> Verniero </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Wolfram </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

Suolo e acquatici organismi microscopici vivere e comportarsi in un complesso ambiente tridimensionale. La maggior parte degli studi sul comportamento organismo microscopico, al contrario, sono stati eseguiti utilizzando microscopio approcci, che limitano il movimento e il comportamento di una stretta, campo quasi bidimensionale focale. 1 Vi presentiamo un nuovo approccio analitico che fornisce analisi in tempo reale di liberamente nuoto C. elegans in una cuvetta senza dipendenza da microscopio a base di attrezzature. Questo approccio consiste inseguimento periodicità temporale di diffrazione generati dirigendo la luce laser attraverso la cuvetta. Misuriamo frequenze di oscillazione per i nematodi liberamente nuoto. Analisi dei campo lontano pattern di diffrazione rivela indizi sulla forme d&#39;onda dei nematodi. Diffrazione è il processo di deflessione della luce attorno ad un oggetto. In questo caso la luce viene diffratta dagli organismi. Le onde luminose interferiscono e possono formare adiffraction modello. Un campo lontano, o Fraunhofer, diffrazione è formato se lo schermo a distanza oggetto è molto più grande dell&#39;oggetto diffrazione. In questo caso, il modello di diffrazione può essere calcolata (modellato) utilizzando una trasformata di Fourier. 2 C. elegans sono a vita libera nel terreno nematodi che navigano in tre dimensioni. Si muovono sia su una matrice solida come il suolo o agar in un andamento sinusoidale locomotoria chiamato scansione e in liquido in un modello diverso chiamato nuoto. 3 I ruoli svolto dalle informazioni sensoriali fornite da mechanosensory, chemiosensoriali, e le cellule che regolano thermosensory cambiamenti plastici in locomotoria i modelli e gli interruttori dei modelli stanno solo iniziando a chiarire. 4 Abbiamo descrivere un approccio ottico per misurare locomozione nematode in tre dimensioni che non richiede un microscopio e ci permetterà di iniziare ad esplorare la complessità di locomozione nematode in co diversonditions.

<html> Come esempio, abbiamo studiato C. elegans in una cuvetta di quarzo larghe 1 cm, 5 mm di spessore e 4 cm di altezza cuvette. Campionare un verme singolo utilizzando analisi video, la frequenza media di nuoto ottenuto dall&#39;analisi video in una cuvetta di 5 mm di spessore è di circa 2,5 Hz (Figura 4). Analogamente, il campionamento di un verme unico usando il reale tempo di acquisizione dati metodo, si ottiene una frequenza di circa 2,7 nuoto Hz (Figura 5), utilizzando l&#39;oscilloscopio digitale (PicoScope). Questa procedura può essere ripetuta per molti vermi. Uno studio dettagliato di vermi liberamente nuoto rivelato una frequenza media di 2,37 Hz nuoto in una cuvetta 5 mm. 6 Come previsto, la frequenza nuoto è superiore a quella di un verme strisciare (~ 0,8 Hz). 3 Usando questo metodo di diffrazione, la nuoto frequenze medie di una C. elegans, che si limita a un vetrino da microscopio, è stato trovato in modo che corrisponda al valore precedentemente pubblicato di 2 Hz.. 1,7 ve_content &quot;&gt; 3 procedure seguenti.) e poi a 6.) consente la modellazione di nuoto modelli di diffrazione con l&#39;aiuto di immagini verme ottenute con un microscopio convenzionale. I pattern di diffrazione modellate sono utilizzati per simulare un ciclo nuotata del C. elegans ( Figura 6). Modello efficace consiste fisicamente realizzabili modelli nuotata successive corrispondenti frequenze nuoto. Il verme dovrebbe essere nella stessa forma al termine di un ciclo di nuotata poiché era all&#39;inizio di un ciclo nuotata. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Figura 1. Un verde HeNe laser è stato usato per creare un modello di diffrazione dinamica utilizzando vivo C. elegans. Questo pattern di diffrazione è stato girato a 240 fps. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Figura 2. Dra<html> ala un punto nero aumenta l&#39;assorbimento del fascio trasmesso. Saturazione della telecamera per la luce diffusa viene ridotta e il modello di diffrazione diventa visibile. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Figura 3. Schermata del software di analisi video (Logger Pro) con un pattern di diffrazione worm che viene monitorata. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Figura 4. Dati video corrispondente al ciclo di nuotata nematodi in una cuvetta di 5 mm. La curva rivela una frequenza nuoto di ~ 2,5 Hz. &quot;/&gt; Figura 5. Dati in tempo reale corrispondente al ciclo di nuotata di un nematodi in una cuvetta di 5 mm. La curva rivela una frequenza nuoto di ~ 2,7 Hz. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Figura 6. La riga superiore rappresenta le figure di diffrazione reali e corrisponde ai modelli di diffrazione modellate nella riga in basso. I pattern di diffrazione modellati sono stati prodotti utilizzando i vermi su un vetrino da microscopio (riga centrale).

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Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Organismi microscopici, come il free-nuoto nematode<em&gt; C. elegans</em&gt;, Vivere e comportarsi in un complesso ambiente tridimensionale. Riportiamo su un nuovo approccio che fornisce un&#39;analisi di<em&gt; C. elegans</em&gt; Con pattern di diffrazione. Questo approccio consiste inseguimento periodicità temporale di diffrazione generati dirigendo la luce laser attraverso una cuvette.

Studio Locomotion quantitativa di Liberamente Nuoto microorganismi Uso diffrazione laser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

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11.5K Views.  Vassar College. Organismi microscopici, come il free-nuoto nematode C. elegans, Vivere e comportarsi in un complesso ambiente tridimensionale. Riportiamo su un nuovo approccio che fornisce un'analisi di C. elegans Con pattern di diffrazione. Questo approccio consiste inseguimento periodicità temporale di diffrazione generati dirigendo la luce laser attraverso una cuvette.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

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Bioingegneria

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

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Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

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Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L&#39;ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Doppia Emulsione Generazione Utilizzando un Polidimetilsilossano (PDMS) coassiale flusso fuoco Dispositivo

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

Un protocollo efficiente e riproducibile per osteogenesi di distrazione in un modello del ratto che conduce a un femore rigenerato funzionale

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Doppia scansione Raster Photoacoustic Small-Animal Imager per la visualizzazione vascolare

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...