Biz teknik yardım için Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello ve Karl Spuhler ederim. Bu çalışma Vassar Koleji Lisans Araştırma Yaz Enstitüsü (URSI), Lucy Maynard Salmon Araştırma Fonu ve NASA ödülü # NX09AU90A, Bilim ve Teknoloji Araştırma Mükemmellik Ulusal Bilim Vakfı Merkezi (NSF-CREST) ​​ödülü # 0630388 ve NSF tarafından desteklenmiştir Ödül # 1058385.

1. C. Video Analizi için elegans Hazırlık <ol><li> Bir ince, düzleşmiş platin tel çekme kullanarak taze NGM agar dolu Petri plakalarına 10-20 gravid erişkin nematodlar taşıyın. NGM agar ile dolu petri E. küçük dairesel noktayı içerecek coli yemek nematodlar için (bir büyüme sınırlı zorlanma, OP50, iyi sonuç verir). Nematodlar 3-5 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin ver ve sonra böylece 50-150 nematod küçük, gelişimsel-senkronize kültürünün oluşturulması, yetişkin çıkarın. Nematodlar 4-5 gün süre ile 20 ° C&#39;de Petri plakalar inkübe ederek erken yetişkinlik büyümek için izin ver. Bu kültür yöntemleri, oluşturulan prosedürlere (Stiernagle 2006) dayanmaktadır. 5 </li><li> Video analiz gününde, dolayısıyla senkronize kültürü 50-150 solucanlar toplama, deiyonize, distile su 1 ml genç yetişkin nematod bir tabak yıkayın. M9 veya PBS gibi bir tampon çözelti de kullanılabilir. W spin için bir mikrosantrifüj kullanıntüpün alt ya da bunların, yaklaşık 15 dakika için yerçekimi ile yerleşmek için izin vermek için ORMS. Tüpten suyun çoğunluğu çıkarın ve nematodların dan herhangi yapışan bakterilerin yıkamak için deiyonize su, damıtılmış su, 1 ml ile değiştirin. </li><li> Bir mikropipet kullanarak kuvars küvetine su veya tampon nematodlar aktarın. Bir seferde bir nematod lazer ile aydınlatılmış olması muhtemeldir ki böylece bir kez ya da daha az, toplam 5-10 nematodlar hakkında küçük bir sayı ile çalışmak önemlidir. Kültür plakalar üzerinde nematod sayısı çok büyükse, istenilen yoğunluğa ulaşana kadar su veya tampon solucanlar seyreltin. Bu yıkayın ve küvet bireysel solucanlar aktarmak için taze bir agar plaka üzerine su veya tampon bir damla bireysel nematod almak da mümkündür. Bizim çalışmamızda, davranış yüzme fiziksel kısıtlamaların etkilerini incelemek için 1 mm, 2 mm ve 5 mm küvet boyutları kullanılabilir. </li></ol> 2. Video analysi için Optik Kurulumus <ol><li> Yetenekli bir 543 nm (yeşil) Helyum-Neon (HeNe) lazer, iki ön yüzeyi alüminyum aynalar, bir küvet tutucusu, bir projeksiyon ekranı ve yüksek hızlı kamera (Casio High Speed ​​Exilim) kullanarak Şekil 1&#39;de gösterildiği kurulumu gerçekleştirin ~ 240 fps filme. Iki ayna vasıtasıyla küvet lazer ışını yönlendirmek için kullanılır. Küvetlerin farklı boyutlarda çalışma doğasına bağlı olarak kullanılabilir. Bir örnek olarak, biz yüzme frekanslarda mekansal kısıtlar etkilerini göstermek için 5 mm kalınlığında olan küvetler kullanılmıştır. Lazer ışını örnekleme için şartları yerine getirmelidir;. Yani organizmanın lazer ışını fazla bir üçüncü engel olmalıdır. C. için Bir nematod ile etkileşime geçtiğinde elegans, lazer ışınının çapı yaklaşık 2 mm olmalıdır. Kırınım deseni bulmak zor olacağından lazer ışını çapı 5 mm&#39;den büyük olmamalıdır. Ekrana difraksiyon organizmadan mesafe çok daha büyük olmalıdırorganizmanın kendisi. </li><li> Yeri küvetin üst üzerinde parafilm ve su kanallarının içine nematod karıştırmak için onu çevirin. Solucanlar küvet üst kısmında başlangıçta böylece bir küvet tutucu küvet yerleştirin. Aynalar kullanarak, küvetin merkezi aracılığıyla lazer ışını yönlendirmek. Nematodlar su daha yoğun olduğu için aynı zamanda su sütunu içinde yüzerken, yavaş yavaş, küvet altına düşecek. </li><li> Iletilen ışın projeksiyon ekranı (Şekil 2) uygun olarak projeksiyon ekranı, renk üzerine siyah iletilen lazer ışını karşılık noktaya saçılma azaltmak için. Alternatif olarak iletilen ışın ekranı geçmesine izin vermek için projeksiyon ekranına bir açılış koydu. Giderilmesi veya iletilen ışını saçılması azaltarak iletilen ışın nedeniyle ıslatmasını kameranın CCD dizisi tutacak. </li><li> Sapma örüntüsünün boyut ölçümü yakalamak için, bir çizgi çizmekkırınan ışık görüntü engel olmadan iletilen lazer ışını nokta yanındaki projeksiyon ekranında yaklaşık 5 cm. </li><li> Oda ışığı yüzden 5 cm lik çizgi difraksiyon görüntülerle aynı görüntüleri üzerinde olduğunu ise kamera ile kayda başlayın. Oda ışığı kapatın. Kamera ile ekranda Record kırınım görüntüleri solucanlar lazer ışını geçerken. </li></ol> 3. Video Verileri Hazırlama <ol><li> : Video analiz programı (Logger Pro Install <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> bilgisayarda). Video analiz programı içine video alma </li><li> Iletilen lazer nokta denk kökenli ayarlayın. Projeksiyon ekranında 5 cm satırını kullanarak ölçeği ayarlayın. </li><li> Görüntü analiz yazılımı kullanılarak her bir nematod ile oluşan kırılma görüntüsü açısal yer değişimi (Şekil 3) Takip </li><li> Angula bulmak içinBir elektronik tablo (Excel) arctan (x / y), kopyalama ve yapıştırma verileri alarak ve sürekli bir grafiği (Figure. 4) üretmek için tüm negatif açılar için 180 derece veya π ekleyin tarafından r deplasman. </li></ol> 4. Yüzme Frekanslar Anında Gözlem için Gerçek Zamanlı Veri Toplama <ol><li> Video analizi için olduğu gibi, aynı ayar kullanarak, doğru projeksiyon ekranı önünde sapma örüntüsünde, merkez dışı bir küçük bir alana (~ 1 mm 2) ile bir foto diyot (ThorLabs itibaren DET10A) yerleştirin. </li><li> USB portundan bilgisayara bağlanan dijital osiloskop (Pico Technology tarafından yapılan PicoScope) için fotodiyot bağlayın. Bilgisayar ekranında thrashing şablonlarını inceleyin. </li><li> ASCII veya metin biçiminde alınan veri setleri kaydedin. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Verilerin analizinde ki-kare minimizasyonu kullanarak uydurma dalga yeteneğine sahip bir veri analizi programı içine video veya fotodiyot kullanılarak elde alma. Burada kullanılan program (Kökeni <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Dayak frekans (Şekil 4 ve 5) belirlemek için bir sinüsoidal eğri yerleştirin. </li><li> Ortalama yüzme çeşitli örneklerinden frekansları ve uyuşmazlığını belirler. Bu çalışma için, verilerin istatistiksel Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile takip tek faktörlü ANOVA kullanılarak analiz edildi. &lt;0.05 p-değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. </li></ol> 6. Örneği Mathematica kullanarak model Kırınım Desenleri Not: Kırınım desenleri birçok farklı hesaplama araçlarını kullanarak modellenebilir. Bu yordam, Matlab, Excel gibi farklı hesaplama araçları, Menşe vs için farklı olacaktır <ol><li> Görüntü Oluşturma: geleneksel mikroskop kullanarak bir mikroskop lamı üzerine nematod fotoğraf çekebilirsiniz. </li><li> Görüntü Binarize: İthalat solucan görüntüyü &#39;Worm&#39; iMathematica içine görüntüsünü sürükleyerek nto Mathematica. Siyah beyaz bir görüntü (binarize) içine görüntü dönüştürün. Bu Mathematica &#39;Binarize&#39; komutu ile elde edilebilir: BlackandWhiteImage = Binarize [Sonsuz]. Görüntü sonra bir siyah beyaz resim olarak görülebilir. EdgeDetect [Solucan, 6.0,0.035], iki takip eden sayı edilen kenarların hoyratlık kontrol: Alternatif olarak, bir BlackandWhiteImage oluşturmak için &#39;EdgeDetect &quot;komutunu kullanarak. </li><li> Sıfır ve birlerin bir matris içine resim dönüştürme: Bu Mathematica &#39;ImageData&#39; komutu ile elde edilebilir: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Fourier matrisi: Belirtilen FourierParameters kullanarak matris dönüşümü Fourier Mathematica &#39;Fourier&#39; komutunu kullanın: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Matrisinin Meydanı modülü kırınım matris elde edilir ve görüntü kontrastı artırmak için: mutlak Meydanımatris değeri ve orijinal görüntü karşılık gelen kırınım modelidir çıkan görüntü görüntüleyebilir. Ayrıca, görüntünün kontrastını ölçeklendirmenize &#39;Log&#39; işlevini kullanın: ImageContrast = Resim [Günlükler [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Kolay görüntüleme için görüntüyü yeniden boyutlandırma: Mahsul merkezi kırınım deseni ve istenilen şekilde yeniden boyutlandırmak: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Serbestçe yüzme solucanlar alınan kırınım desenleri ile modellenen kırınım desenleri karşılaştırın. (Şekil 6) </li></ol>

<ol>
	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz gerçek zamanlı hareket ölçme ve mikroskopların kullanımı gerektirmez nematod gibi mikroskobik organizmaların basit lokomotor davranışlar için yeni bir yaklaşım geliştirdik. 8 Bu metodolojik yaklaşım da tek hücreliler gibi çok sayıda mikroskobik organizmaların incelemek için yararlanılabilir. Bu yöntem, yalnızca kullanılan ışık dalga boyu ile sınırlıdır. Organizma ışığın dalga boyundan daha küçük olmaması gerekir. Ihtiyaç duyulan donanım ve maliyet tasarrufu ve taşınabilirlik ek olarak, bu yaklaşım, bir önemli avantajı, bir mikroskop altında görüntü düzlemlerinin dar kısıtlama olmaksızın, gerçek zamanlı olarak ve üç boyutlu olarak davranış ölçmek için yeteneğidir. Bu teknik mikroskop bazlı yaklaşımlar kullanılarak çalışılabilir bir davranış üzerinde yerçekimi kuvvetleri veya çok sayıda diğer koşulların etkilerini incelemek ile de mümkündür. 9 Böylece, mikroorganizmanın doğal lokomotor davranış bozuklukla daha iyi anlaşılmasını sağlamak içinmikroskop lamı damlacıkları veya özel mikroakışkan odaları (Park ve ark, 2008) sınırlarından kurtulmuş viors. 10. Kırınım deseninin faz bilgi eksikliği uzak-alan kırınım deseni Fourier dönüşümünün mutlak değer karesi ile orantılı olduğundan Kırınımlı nesneye karşılık görüntünün doğrudan alımı için izin vermez. Onlar serbestçe yüzme nematod (Şekil 6) kırınım desenleri ile uyumlu olabilir, böylece Biz bu nedenle solucan görüntüleri kırınım desenleri hesaplıyoruz. Bu yöntem gerçekten özgürce C. yüzme için sonuçlar vermiştir elegans ve hiçbir mikroskobik tür uygulanabilir ki su ya da birçok farklı iyonik çözeltiler gibi bir optik olarak transparan bir ortam içinde manevralar. Konvansiyonel mikroskoplar mikrometre sipariş üzerine bir odak derinliğinde çalışmalara izin verir. 11. Bu Sınırlı nedeniyleışık odaklama alan derinliği: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> Bu kırınım yöntemi kesinlikle geleneksel mikroskopi için bir yedek değil iken N kısa bir odak uzaklığı bir büyük c ile ilişkili olduğunu böylece karışıklık (c) daire karşılıklı bir ilişki vardır f-sayısı. 12,13, bunun mümkün olduğu hızlı bir şekilde türlerin bile düşük maliyetli gerçek zamanlı olarak manipüle edilebilir kantitatif sonuçlar sunmak için. Kırınım desenleri herhangi bir lazer pointer ile elde edilebilir. Kırınım desenleri normal bir dijital kamera kullanarak azaltılmış bir zamansal çözünürlükte filme olabilir. Kullanıcının kolayca kullanılabilir bir mikroskop veya fotodiyot sahip olmasa da, böyle bir dayak frekansları ölçme ve kırınım desenleri değerlendirerek bu denemenin önemli parçaları son derece düşük maliyetle tamamlanabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> 543 nm HeNe Lazer </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> En az 5 mW&#39;a ile görülebilir aralığındaki herhangi bir lazer kullanılabilir. </td></tr><tr><td> 2 Ön Yüzey Alüminyum Aynalar </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim Kamera </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kuvars Cuvette </td><td> Starna Hücreler </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Yazılım) </td><td> Verniyer </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Volfram </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

Toprak ve su mikroskobik organizmalar yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Mikroskobik organizmanın davranışının çalışmaların çoğu, aksine, biz gerçek zamanlı analiz sağlar yeni bir analitik yaklaşım sunmak dar, yaklaşık iki boyutlu odak alanına hareket ve davranış sınırı mikroskop-temelli yaklaşımlar. 1 kullanılarak yapılmıştır serbestçe C. yüzme mikroskop tabanlı donanım bağımlı olmadan bir küvet içinde elegans. Bu yaklaşım, küvet aracılığıyla lazer ışık yönlendirilmesi ile oluşturulan kırınım desenleri geçici periyodiklik izleme oluşur. Biz serbestçe yüzme nematodlar için salınım frekansları ölçer. Uzak-alan kırınım desenleri Analiz nematodların dalga hakkında ipuçları ortaya koymaktadır. Difraksiyon bir nesnenin etrafında bükme ışık işlemidir. Bu durumda ışık organizmalar tarafından kırıldıkları olduğunu. Işık dalgaları müdahale ve reklam oluşturabiliriffraction desen. Ekran-nesne mesafe Kırınımlı nesnenin daha büyük ise, bir uzak-alan veya Fraunhofer, kırınım deseni oluşur. Bu durumda, sapma örüntüsü, bir Fourier transform kullanılarak (örnek alınarak) hesaplanabilir. 2 C. elegans üç boyutta gezinmek serbest yaşayan Toprakta yaşayan nematodlar vardır. Onlar tarama denilen bir sinüzoidal lokomotor desen ve yüzme denen farklı bir desen sıvı toprak veya agar gibi bir katı matris üzerinde her iki hareket. 3 rolleri mechanosensory, kimyasal duyusal ve lokomotor plastik değişiklikler yöneten thermosensory hücreleri tarafından sağlanan duyusal bilgi oynadığı desen desen ve anahtarlar sadece aydınlatılamamış başlıyor. Biz bir mikroskop gerektirmez ve bize farklı işbirliği altında nematodu lokomosyon karmaşıklığı keşfetmek için başlamanızı sağlayacak üç boyutlu nematod lokomosyon ölçmeye yarayan bir optik yaklaşımı açıklamak 4şulları.

<html> Bir örnek olarak, C incelenmiştir geniş bir kuvars küvetine 1 cm, 5 mm kalınlığında ve 4 cm boyunda küvet içinde elegans. Video analizi kullanarak tek bir solucan Örnekleme, 5 mm kalınlığında küvet içinde video analizi elde edilen ortalama yüzme sıklığı yaklaşık 2.5 Hz (Şekil 4). Benzer şekilde, gerçek zamanlı veri toplama yöntemi kullanılarak tek bir solucan örnekleme, biz yaklaşık 2,7 Hz (Şekil 5) bir yüzme frekansı elde dijital osiloskop (PicoScope) kullanarak. Bu prosedür birçok solucanlar için tekrar edilebilir. Serbestçe yüzme solucan detaylı bir çalışma, 5 mm küvet içinde 2.37 Hz ortalama yüzme sıklığı saptandı. 6 Beklendiği gibi, yüzme frekansı bir tarama solucan (~ .8 Hz) daha yüksektir. 3, bu kırınım yöntemi kullanarak Bir C. ortalama yüzme frekansları bir mikroskop slaydı ile sınırlı elegans, 2 Hz önceden yayınlanmış değeri ile eşleştirmek için tespit edilmiştir. 1.7 ve_content &quot;&gt; Aşağıdaki prosedürler. 3) ve daha sonra 6). geleneksel bir mikroskop ile elde edilen solucan görüntü yardımıyla kırınım desenleri yüzme modellenmesi için olanak sağlar. modellenen kırınım desenleri C. elegans yüzerek döngüsü (simüle etmek için kullanılırlar Şekil 6). başarılı bir model yüzme frekansları uygun fiziksel olarak uygulanabilir ardışık yüzme desen meydana gelir. bir yüzme döngüsünün başlangıcında olduğu gibi solucan yüzebilir döngüsünün sonunda aynı şeklinde olmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Şekil 1. Yeşil HeNe lazer canlı C. kullanarak dinamik bir kırınım deseni oluşturmak için kullanılan elegans. Bu kırınım deseni 240 fps&#39;de çekildi. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Şekil 2. Dra<html> kanat siyah bir nokta iletilen ışının emilimini artırır. Dağınık ışık nedeniyle kameranın Doygunluk azaltılmış ve kırınım deseni görünür hale gelir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Şekil 3. Izlenmekte olan bir solucan kırınım deseni ile video analiz yazılımı ekran görüntüsü (Logger Pro). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Şekil 4. 5 mm küvet bir nematod yüzmek döngüsü karşılık gelen video veri. Eğri fit ~ 2.5 Hz&#39;lik bir yüzme frekansını gösterir. &quot;/&gt; Şekil 5. 5 mm küvet bir nematod yüzmek döngüsü karşılık gelen gerçek zamanlı veri. Eğri fit ~ 2.7 Hz&#39;lik bir yüzme frekansını gösterir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Şekil 6. Üst satırı gerçek kırınım desenleri temsil ve alt satırında modellenen kırınım desenleri ile eşleştirilir. Modellenen kırınım desenleri bir mikroskop lamı (orta sıra) üzerinde solucanlar kullanılarak üretilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction at JoVE.com

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Serbest yüzme nematod gibi mikroskobik organizmalar<em&gt; C. elegans</em&gt;, Yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Biz analiz sağlar yeni bir yaklaşımı üzerine rapor<em&gt; C. elegans</em&gt; Kırınım desenleri kullanılarak. Bu yaklaşım, bir küvet ile lazer ışığı yönlendirerek oluşturulan kırınım desenleri zamansal dönemsellik izleme oluşur.

Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K Görüntüleme.  Vassar College. Serbest yüzme nematod gibi mikroskobik organizmalar C. elegans, Yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Biz analiz sağlar yeni bir yaklaşımı üzerine rapor C. elegans Kırınım desenleri kullanılarak. Bu yaklaşım, bir küvet ile lazer ışığı yönlendirerek oluşturulan kırınım desenleri zamansal dönemsellik izleme oluşur.

Video: Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Biyomühendislik

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

Bir Polidimetilsiloksan (PDMS) Koaksiyel Akış Odak Aygıtı Kullanma Çift Emülsiyon Üretimi

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

Miyokard Yapı, Fonksiyon Vivo Kantitatif Değerlendirilmesi yılında Perfüzyon ve Canlılık Kardiyak Mikro-bilgisayarlı Tomografi ile

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

Oyalama Osteogenesis fonksiyonel rejenere uyluk için önde gelen bir fare modeli için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Vasküler Görselleştirme için Çift Raster Taramalı Fotoakoustik Küçük Hayvan Görüntüleyici

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...