Este trabajo fue apoyado por Paul D. Wellstone el Centro de Investigación Cooperativa (AR052646).

Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Pennsylvania IACUC. 1. La disección y preparación del EDL (Aproximadamente 30 minutos) <ol><li> Anestesiar los ratones para asegurar que no experimentan dolor o malestar durante el procedimiento, pero que los músculos permanecen bien oxigenada por la circulación. Habitualmente usamos un cóctel de ketamina / xilazina (100/10 mg / kg) inyectado a través de IP. Plano quirúrgico de anestesia se determina por la ausencia completa de pedal o reflejos palpedral de abstinencia, o la falta de respuesta del oído contracción. </li><li> Inmovilizar las extremidades posteriores utilizando cinta médica, y quitar la piel de las patas traseras anterior inferior para exponer los músculos de esta zona. Mantener los músculos húmeda con la aplicación de PBS a intervalos regulares. </li><li> Bajo un microscopio de disección, hacer una pequeña incisión lateral a la rodilla con el fin de exponer el tendón proximal del músculo EDL. Hay dos tendones en esta región, y ambos deben ser cortadas para permitir reremoción de la EDL. </li><li> En el tobillo medial, cortar el tendón del músculo TA para exponer los tendones distales de la EDL, que se extienden a lo largo de los tarsales meta. Levante el músculo TA fuera del camino, teniendo cuidado de no cortar ni tocar la parte de abajo EDL. Volver a los tendones distales de la EDL, recorte cada uno y llevarlos a través del tobillo, y luego agarrar los tendones, tire suavemente de la EDL lejos del resto de la extremidad. Se debe liberar desde el extremo proximal libremente, pero si no, volver a la incisión lateral para asegurar que el tendón se corta. Retire el músculo y colocar en un plato lleno de disección refrigerados Ringers oxigenados. Pin el músculo a través de los tendones en longitud aproximadamente de reposo, que es la longitud observada in vivo. La longitud es demasiado corto cuando el músculo está flácido en el plato, y demasiado largo si el músculo está tirando de los pasadores de disección. </li><li> Sacrificar al ratón inmediatamente después de la extracción del músculo por dislocación cervical. </li><li> Ate las suturas de los diezDons, tan cerca como sea posible del músculo, pero sin tocar el músculo. Pin el músculo en reposo longitud aproximadamente con las suturas. </li></ol> 2. Diafragma de disección y preparación (aproximadamente 30 minutos) <ol><li> Eutanasia a los ratones antes de este procedimiento por dislocación cervical bajo anestesia, si el mismo ratón se somete a ambos disecciones, o por CO 2 seguido por la confirmación con dislocación cervical. </li><li> Hacer una incisión en la piel para exponer la cavidad abdominal y el pecho. Abrir la cavidad abdominal, y cortar la pared del cuerpo justo debajo de las costillas. Con una tijera de hueso, y comenzando por encima de la inserción del diafragma, corte alrededor de toda la caja torácica siguiendo la línea de las costillas, y corte a través de la columna vertebral. Cortar los vasos sanguíneos que atraviesan el centro del diafragma de modo que el diafragma se puede quitar fácilmente. </li><li> Retire el diafragma del ratón, y colocar en un plato lleno de disección Ringers oxigenados. Agite suavemente la diaphragm en el plato para lavar la sangre. Actualizar solución Ringer, según sea necesario. </li><li> Cortar una tira pequeña de la membrana desde el tendón central a las costillas a lo largo de la orientación de las fibras en la porción central de los hemidiafragmas laterales. La tira debe estar entre 2-4 mm de ancho. Usando tijeras de hueso, cortar el nervio a cada lado de la tira, dejando aproximadamente 1-2 mm de nervio saliente a cada lado de la tira de membrana. </li><li> Atar las suturas en el tendón central. Ligado de suturas a cada uno de los extremos costales que sobresalen lateralmente, y después unir estos juntos para hacer un bucle grande. </li><li> Dos tiras se pueden obtener de cualquier diafragma dado (uno de cada lado). </li></ol> 3. Los músculos de montaje en Bath Mecánica <ol><li> Agarre las suturas y utilizar éstos para unir el músculo a un poste rígido en un extremo, y a un transductor de fuerza en el otro extremo. </li><li> Ajuste de la longitud para asegurar que el músculo no está floja, pero no es tensa. Una buena aproximación es la musc reposole longitud como en 1.4 - 1.5. </li><li> Del baño debe ser llenado con solución de Ringer oxigenada mantenida a 22 ° C para prolongar la estabilidad de músculo para la prueba. Músculos debe descansar durante 5 min en este baño antes de la prueba funcional de modo que la temperatura del músculo se equilibra a 22 ° C. </li></ol> 4. Las contracciones isométricas <ol><li> Establecer condiciones supramáximos estimulación. Después de un músculo se coloca en el baño, de un solo uso pulsos de estimulación 0,5 mseg para generar una contracción, y supervisar la salida de fuerza. Poco a poco aumentar la corriente hasta que la fuerza alcanza un nivel máximo pero constante. Aumentar la corriente a más del 10% de este nivel durante el resto de experimentos. </li><li> Establecer longitud óptima. Uso de estímulos de contracción isométrica, ajustar la longitud del músculo gradualmente hasta una fuerza máxima se obtiene. Apoye el músculo ~ 10 segundos entre cada contracción. Longitud muscular óptimo (o L) se logra cuando la fuerza de contracción es máxima. Grabar la longitud muscular (la longitud seaentre las uniones miotendinosa de EDL, y entre el centro de unión del tendón miotendinosa y la inserción de los músculos a la costilla) con pie de rey. </li><li> Fuerza máxima isométrica tetánica. Estimular el músculo fijado en L o por un periodo de 500 milisegundos, con una serie de pulsos de 0,5 ms en la estimulación supramáxima y en la frecuencia de fusión (de la meseta de la relación fuerza-frecuencia (por ejemplo, Ref.:. 8) La meseta de los músculos EDL es normalmente se logra con 120 Hz, y para los músculos del diafragma con 100 Hz. Estimular 3 veces a la frecuencia correspondiente, con periodos de descanso de 5 minutos entre las series de estimulación para cada músculo. </li></ol> 5. Las contracciones excéntricas <ol><li> Permita que los músculos para descansar 5 minutos entre realizar contracciones isométricas y excéntrico. </li><li> Estimular los músculos a 80 Hz isométricamente para la inicial 500 ms, seguido de un 10% de estiramiento L o en el final de la estimulación 200 mseg (una velocidad de estiramiento de 0,5 L o/ Seg). </li><li> Repetir patrón de estimulación con 5 min descansa entre el número deseado de las contracciones excéntricas. </li><li> Medir la fuerza de cada contracción en el período de tiempo antes de que el estiramiento. Cálculo de la caída de la fuerza de contracción entre el primero y el último. </li></ol> 6. Músculo Retiro del aparato <ol><li> Acortar la longitud de los músculos para permitir la eliminación suave de los músculos del transductor y publicar y devolverlo a un plato de disección con timbres. </li><li> Retirar las suturas de los músculos. </li><li> Para el músculo EDL, secar el músculo dos veces, luego se pesan, antes de tratamiento posterior (por ejemplo, congelación, fijación, etc.) Esto será importante para el cálculo del área de sección transversal, y la fuerza específica. </li><li> Para el músculo diafragma, de inmersión en 0,1% Procion naranja, un tinte membrana impermeabilizante durante 15-20 min. Esto proporcionará un índice de daño disección. </li><li> Diseccionar el músculo lejos de la inserción ósea, así como la cientotendón ral. Esto es necesario para proporcionar un peso exacto del músculo. Seque el anterior antes del pesaje y posterior elaboración del mismo. </li><li> Cálculo de área de sección transversal (CSA): CSA (mm 2) = masa (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)], donde L / L o es el cociente del músculo de fibra a la longitud (0,45 para EDL, 1,0 para el diafragma) 5 y 1,06 es la densidad del músculo. </li></ol>

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	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. 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B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Aurora Científico.

El objetivo de este artículo es proporcionar una guía para la realización de la función del músculo aislado en dos músculos de los ratones - la EDL y el diafragma. La evaluación de estos músculos puede dar una idea de si es o no candidatos terapéuticos para enfermedades musculares son beneficiosas. Para ambos músculos, el factor más importante en la obtención de datos fiables es una disección limpia. Por lo tanto, la práctica y el perfeccionamiento de la etapa de aislamiento inicial es esencial antes de pasar a las pruebas funcionales. Además, el establecimiento de parámetros funcionales para el músculo normal es crítico antes de hacer comparaciones con el músculo distrófico, o entre los tratamientos. Esto asegurará que los resultados del estudio no están sujetos a la alta variabilidad impartida por la capacidad de la persona que realiza los experimentos. El uso de un colorante impermeant membrana puede ayudar con la optimización de la preparación de la disección, para la incubación de cualquier músculo en una solución que contiene un colorante marcará fibras dañadas, y puede servir como un índice de dissection éxito. Minimizar el número de fibras dañadas en el músculo ayudará a optimizar la medición. Las fibras dañadas por disección fluorescencia mucho más intensamente que los perjudicados por la contracción excéntrica, y por lo que si el tinte también se utiliza durante el proceso de la mecánica, se puede utilizar la intensidad de la tintura para distinguir entre los dos tipos de daños. La disección de las tiras de membrana casi siempre tienen daño de la fibra, porque simplemente cortando a lo largo de la longitud de las fibras, algunos inevitablemente se destruyen. La absorción de colorante es fuerte en esas fibras dañadas, y estos normalmente se restringen a los bordes exteriores de la preparación. En promedio, se observa una banda de fibras dañadas que es ~ 3 fibras de ancho (~ 120 m) a cada lado de la tira de músculo. Si la banda dañado comprende más de 15% del músculo, a continuación, los datos se descartan. La preparación diafragma también tiene limitaciones en el tamaño óptimo de las medidas funcionales. Hemos encontrado que los trozos de diaphragm que son más anchas que 5 mm comienzan a plegarse sobre sí mismas, debido a que el lazo del tendón central es sólo en un punto. Esto se traduce en disminución de la fuerza específica en la preparación. También hemos encontrado que tiras más estrechas también tienen menor fuerza específica, que creemos que es porque el número de fibras dañadas durante la disección comprender una mayor proporción de la cantidad total de fibra. Por ejemplo, si 0,1 mm en cada lado está dañado, a continuación, que es 5% (2x0.1 mm / 4 mm tira) de la preparación de músculo que no contribuye a la fuerza, mientras que si la tira es solamente 1 mm, a continuación, 20 % de la preparación músculo está dañado. Así, tanto la anchura de la región dañada, así como el ancho de toda la preparación son factores importantes a controlar. Las mediciones de la tensión isométrica máxima requieren que todas las fibras musculares de un músculo se estimula. Debido a que hay una gran variabilidad en los componentes de un aparato de función, esto debe ser determinado para cada conjunto individualarriba. Por ejemplo, el tamaño del baño o el tipo de estimulador puede afectar a la intensidad de la estimulación. Estimulación Twitch es una forma razonable de determinar las condiciones supramáximos estimulación. Una vez que se estableció para una configuración específica y músculo, puede ser utilizado para estudios posteriores. En contraste, la longitud óptima de cualquier músculo dado necesita ser medida para cada preparación utilizando el proceso iterativo descrito anteriormente. Esto asegura que la superposición de filamentos gruesos y delgados es óptima y la máxima capacidad potencial de generación de la fuerza se mide. Procedimientos alternativos pueden confiar en los patrones de difracción asociados con las estrías musculares, pero esto requiere un equipo adicional que no se describe aquí. Habitualmente usamos 500 ms duración de la estimulación, se clasifica en el rango medio de este parámetro utilizado por otros investigadores en este campo. Aunque esto podría producir cierta fatiga del músculo durante la contracción, lo cual es evidentepor un &quot;hundimiento&quot; de la producción de fuerza máxima, esto en sí mismo puede ser informativa. Por ejemplo, una diferencia en la fatiga podría lograrse mediante diferentes tipos de terapias incluyendo aquellos manipulación de destino que el calcio, por lo tanto, el pandeo en vigor durante la contracción activa puede servir como un índice para la mejora. Alternativamente, la pérdida de la fuerza podría indicar que las suturas en los tendones no están suficientemente apretados, y que se deslice durante la contracción. El músculo se debe quitar de la bañera y las suturas deben ser re-atado si esto ocurre. También utilizamos una serie de 3 contracciones tetánicas, lo que ayuda a evaluar la estabilidad de la preparación. Una vez más, se desliza de sutura daría lugar a la pérdida de fuerza entre las contracciones, lo que requiere sutura re-vinculación. Músculos grandes también pueden generar núcleos de anoxia, que conducen a la pérdida de fuerza durante el protocolo. Tamaño muscular es un factor limitante para la realización de las pruebas de función muscular aislado, donde los músculos EDL con masas superiores a 20 mg perder fuerza con cada contracciónción, y no puede ser soportado por superfusión en un baño. Tiras de membrana no sufren de las mismas complicaciones porque son lo suficientemente delgada como para tener viabilidad prolongada en el baño. Otros músculos puede ser utilizado para la función muscular aislado, incluyendo el músculo sóleo, que se utiliza comúnmente, pero no se describe aquí. Muchos de los mismos procedimientos que se pueden adoptar para el sóleo en términos de la preparación y la prueba de funcionamiento. Sin embargo, las diferencias principales están en la frecuencia de estimulación, y los parámetros para las contracciones excéntricas. El uso de los sóleo para la función complementaria de la de los otros dos músculos, y por lo que debe ser considerado como parte de un &quot;paquete estándar&quot; para la evaluación de ratones distróficos 4, 7. La contracción excéntrica proporciona un índice de fragilidad contráctil, y es importante utilizar un protocolo que resulta en la pérdida modesta de la fuerza en los músculos de los animales de tipo salvaje y una pérdida significativa de la fuerza enmúsculos distróficos no tratadas de modo que hay un amplio rango dinámico para las comparaciones. A falta de cualquier pérdida de fuerza en los músculos normales sugiere que la contracción excéntrica es demasiado suave, y no será adecuada para distinguir entre las terapias que no son eficaces y las que son realmente beneficiosos. Sin embargo, una dramática pérdida de fuerza en los músculos normales sometidos a la contracción excéntrica puede ser demasiado grande para desentrañar las diferencias asociadas con la enfermedad. Nuestro protocolo para la EDL y utiliza un diafragma 0,5 Lo / seg velocidad de estiramiento para producir un cambio de longitud del 10%. Por lo general realizar 5 contracciones excéntricas, que se traducen en una pequeña pérdida de fuerza en los músculos normales y una importante pérdida de fuerza en los músculos distróficos. Ciertamente, todos estos parámetros se pueden variar para aumentar el cambio de longitud total, la velocidad de estiramiento, o el número de contracciones excéntricas con el fin de distinguir las diferencias entre músculo enfermo y sano, así como sobre los efectos de un tipo específico de mutación o tratamiento que se está estudiando. Mientras haya una marcada diferencia entre los músculos normales y enfermos, entonces hay un estándar de oro para alcanzar en términos de tratamientos. En resumen, este protocolo establece las directrices para la realización de contracciones isométricas y excéntrico, y espero que identifica los peligros potenciales para evitar al establecer esta técnica en su laboratorio.

Mediciones de función muscular contribuir a la evaluación de tratamientos potenciales para la patología muscular, así como para la determinación de los mecanismos subyacentes a la fisiología de este tejido. Para la enfermedad muscular, el uso de modelos de ratones se han convertido en un componente central para la comprensión de los vínculos entre el genotipo y el fenotipo, y para ampliar el conocimiento en el diseño y prueba de productos terapéuticos potenciales. Las distrofias musculares, en particular, se han basado en ratones para evaluar estos agentes y establecer los datos preclínicos necesarios para avanzar a los ensayos en pacientes. Una medida de resultado frecuente utiliza la función muscular aislado para determinar la fuerza, que es aplicable a una amplia gama de estudios. Otra medida es el uso de excéntrica, o el alargamiento, las contracciones para determinar cambios en la integridad de la membrana muscular, que es deficiente en la distrofia muscular de Duchenne, y el modelo de ratón de esta enfermedad (mdx). Por lo tanto, es esencial para este tipo de measurempadres a ser sensible y reproducible. El ratón extensor digitorum longus (EDL) se ha utilizado ampliamente para la función muscular aislado debido a su geometría ideal y tamaño, incluyendo la orientación de fibra uniforme y tendones definitivos 2, 5, 6, 10, 12. Métodos para músculos EDL isométricas medidas funcionales se han descrito en una publicación anterior JoVE 8, así como en el SOP Treat-NMD 1. Hemos extendido la descripción de estos métodos para incluir tanto las contracciones isométricas y excéntrica. Características de la enfermedad son evidentes en la EDL, incluidos los ciclos heighted de degeneración / regeneración y producción de fuerza disminuida. El diafragma de ratón muestra la progresión patológica más rápido de la distrofia muscular en comparación con otros músculos en el ratón 11. A los 6 meses de edad, fibrosis acumulada comprende aproximadamente el 50% del músculo. Esto da como resultado significativamente impaired fuerza de salida 11. Por lo tanto, los agentes terapéuticos que pueden prevenir la infiltración fibrótica se puede evaluar de manera eficiente en el diafragma. La pérdida de distrofina en el músculo conduce a mayor fragilidad y el daño contráctil aumentado en todos los 9 músculos. Por lo tanto muchas terapias para la distrofia muscular de Duchenne están orientados para el reemplazo de la distrofina. Como tal, un ensayo que se ha convertido en esencial para la evaluación de estas estrategias es la contracción excéntrica, que puede distinguir entre el músculo normal y distrófico, así como determinar qué beneficios de una estrategia particular ha de proteger a un músculo distrófico de daño contráctil 2, 3, 4, 12. Este procedimiento requiere o bien un modo dual servo-motor que puede modular / longitud del registro y la fuerza, o un método de ajuste de longitud rápidamente separado de un transductor de fuerza.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> sistema in vitro Prueba muscular </td><td> Aurora Científico </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE fuente de luz </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras de disección </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Ángulo tijeras de disección </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Mango de bisturí </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 10003-12 </td><td> herramienta alternativa de disección </td></tr><tr><td> Curved las hojas de bisturí # 12 </td><td> Ciencia FineInstrumentos </td><td> 10012-00 </td><td> herramienta alternativa de disección </td></tr><tr><td> Tijeras de hueso </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T sutura empate fórceps </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS forceps - ángulo </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Seda trenzada tamaño de la sutura 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07/30/10 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta médica </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina clorhidrato 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Dosis final es de 80 mg / kg </td></tr><tr><td> Inyección TranquiVed (xilazina 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Dosis final es de 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reactive Orange 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Componentes de la solución de Ringer </td><td></td><td></td><td> La solución es gas equilibrada con 95% de O 2 y 5% de CO 2, pH final 7,4 </td></tr><tr><td> De cloruro de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Concentración final: 118 mM </td></tr><tr><td> El cloruro de potasio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Concentración final: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio dihidrato </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Concentración final: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Fosfato de potasio monobásico </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Concentración final: 1,2 mM </td></tr><tr><td> Sulfato de magnesio </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Concentración final: 0,57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-hidroxietil) pipeRazine-1-etanosulfónico (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Concentración final: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Concentración final: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Crítica para la evaluación de agentes terapéuticos potenciales para la enfermedad muscular son evaluaciones fisiológicas sensibles y reproducibles de la función muscular. Debido a que muchos ensayos pre-clínicos se basan en modelos de ratón para estas enfermedades, la función muscular aislado se ha convertido en uno de los estándares de Pasa / No Pasa decisiones en el movimiento de los fármacos candidatos con interés en los pacientes. Vamos a demostrar la preparación del extensor digitorum longus (EDL) y los músculos del diafragma para las pruebas funcionales, que son los músculos predominantes utilizados para estos estudios. La geometría del músculo EDL es ideal para preparaciones de músculo aisladas, con dos tendones de fácil acceso, y un tamaño pequeño que puede ser soportada por superfusión en un baño. El diafragma presenta una profunda patología progresiva en animales distróficos, y puede servir como una plataforma para la evaluación de muchas terapias potenciales lucha contra la fibrosis y la promoción de la estabilidad de miofibras. Los protocolos para las pruebas de rutina, incluyendo isométrico y ECCENtricas, las contracciones serán mostrados. Fuerza isométrica proporciona una evaluación de la fuerza, y las contracciones excéntricas ayudar a evaluar la estabilidad del sarcolema, que se rompe en muchos tipos de distrofias musculares. Las comparaciones de los resultados esperados entre los músculos de los músculos de tipo salvaje y distrófica también se proporcionará. Estas medidas pueden complementar las mediciones morfológicas y bioquímicas de la homeostasis del tejido, así como evaluaciones de enteros de animales de la función muscular.

Los valores esperados para las fuerzas isométricas de músculos EDL de 12 semanas de edad los animales se muestran en la figura 1. Dado que los músculos mdx exponer hipertrofia compensatoria, la fuerza tetánica total puede ser mayor en los músculos mdx en comparación con controles emparejados por edad de tipo salvaje. Sin embargo, una medida más apropiada de la salida funcional es la fuerza específica (Figura 2), donde la fuerza se normaliza para el área transversal para calcular este valor. Fuerza específica depende de la capacidad inherente funcional del músculo, donde la debilidad en los músculos distróficos es más evidente cuando tanto la fuerza absoluta y área de sección transversal se tienen en cuenta. En nuestras manos, músculos EDL de ratones mdx generan aproximadamente 20 a 25% más bajas que las fuerzas específicas de la misma edad ratones de tipo salvaje 10 a 26 semanas de edad. Para que el diafragma, solamente la fuerza específica es pertinente para las comparaciones porque la preparación es una pieza del músculo dependiente de la dissección. Comparación de la fuerza específica entre wildtype y músculos mdx diafragma refleja la patología progresiva en este tejido. Producción de fuerza isométrica disminuye con la edad (Figura 3), de modo que a los 6 meses de edad, los músculos del diafragma de ratones mdx no producen más de la mitad de la salida funcional de las tiras de membrana de edad con ajuste los controles de tipo salvaje. Un ejemplo de las contracciones excéntricas de las pruebas de diafragma se muestra en la Figura 4. Con cada contracción excéntrica posterior, disminuye la producción de fuerza en las tiras de membrana, tanto de tipo salvaje (C57) y ratones mdx. Sin embargo, la pérdida de la fuerza es más dramático en muestras de músculo de ratón mdx, presumiblemente a partir de la ausencia de distrofina y sus proteínas asociadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figura 1. Fuerza isométrica tetánica en wildtype y EDL músculos mdx f<html> Rm 12 semanas de edad ratones. Fuerza absoluta puede ser mayor en la misma edad mdx músculos EDL debido a la hipertrofia compensatoria. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figura 2. Isométrica fuerza tetánica normalizado por área de sección transversal del músculo es la fuerza específica, y revela la capacidad deprimido funcional de los músculos EDL de ratones mdx, en comparación con los de los ratones de tipo salvaje. Las huellas son de los mismos ratones como en la figura 1. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figura 3. La pérdida progresiva de la capacidad de generación de fuerza evaluada por la fuerza específica es más evidente en el diafragma de ratones mdx (barras rojas) en comparación con los de tipo salvaje (C57 en línea azul). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. La pérdida de la fuerza como una función del número contracción excéntrica de los músculos del diafragma de 12 semanas de edad C57 y ratones mdx. Los datos son la media ± SEM para N = 4 músculos por genotipo.

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Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Mediciones de función muscular contribuir a la evaluación de agentes terapéuticos potenciales para patología muscular, así como para la determinación de los mecanismos subyacentes a la fisiología de este tejido. Vamos a demostrar la preparación del extensor largo de los dedos y los músculos del diafragma para la prueba funcional. Los protocolos para las contracciones isométricas y excéntrico se muestra, así como las diferencias en los resultados entre los músculos distróficos, que representan un estado patológico, y los músculos de tipo salvaje.

Evaluación de Generación de la Fuerza isométrica y excéntrica de los músculos esqueléticos Aislados de modelos murinos de Distrofias Musculares

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

32.6K vistas.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. Mediciones de función muscular contribuir a la evaluación de agentes terapéuticos potenciales para patología muscular, así como para la determinación de los mecanismos subyacentes a la fisiología de este tejido. Vamos a demostrar la preparación del extensor largo de los dedos y los músculos del diafragma para la prueba funcional. Los protocolos para las contracciones isométricas y excéntrico se muestra, así como las diferencias en los resultados entre los mús...

Video: Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

La transfección de ADN de músculos esqueléticos de mamíferos con En Vivo La electroporación

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Investigación

Biología

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

La Ex vivo Preparación aislada Microvessel esquelético para la Investigación de la reactividad vascular

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triage de tejidos y de congelación para los modelos de la enfermedad del músculo esquelético

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Contractilidad Mediciones en músculos papilares aislados para la Investigación de Cardíaca inotropía en ratones

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados ​​en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Generación De Monocapas Epiteliales Murinas Primarias De Colon De Criptas Intestinales

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...