Este trabalho foi financiado pela D. Paulo Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pela Universidade da Pensilvânia IACUC. 1. Dissecção EDL e Preparação (cerca de 30 min) <ol><li> Anestesiar ratos para garantir que eles não sentem dor ou desconforto durante o procedimento, mas que os músculos permanecem bem oxigenado pela circulação. Nós rotineiramente um cocktail ketamina / xilazina (100/10 mg / kg), injectada via IP. Plano cirúrgico de anestesia é determinada pela completa ausência de pedal ou reflexos de retirada palpedral, ou a falta de resposta de contracção da orelha. </li><li> Imobilizar os membros posteriores, utilizando fita adesiva médica, e retirar a pele da parte inferior do membro posterior anterior para expor a musculatura da área. Manter os músculos húmido com a aplicação de PBS, a intervalos regulares. </li><li> Sob um escopo de dissecação, fazer uma pequena incisão lateral ao joelho, a fim de expor o tendão proximal do músculo EDL. Há dois tendões nesta região, e ambos devem ser cortadas para permitir o regressoMoval da EDL. </li><li> No tornozelo medial, cortou o tendão do músculo TA para expor os tendões distais do EDL, que se estendem ao longo dos tarsos meta. Levante o músculo TA fora do caminho, tomando cuidado para não cortar ou tocar os debaixo EDL. Retornar para os tendões distais do EDL, snip cada um e atraí-los através do tornozelo, então segurando os tendões, puxe o EDL longe do resto do membro. Deve libertar a partir da extremidade proximal livremente, mas se não for, volte para a incisão lateral para assegurar que o tendão é cortado. Retire o músculo e coloque em um prato cheio de dissecar refrigerados Ringers oxigenados. Pin do músculo através dos tendões no comprimento aproximadamente de repouso, que é o comprimento encontrado in vivo. O comprimento é curto demais quando o músculo está flácido no prato, e por muito tempo se o músculo está puxando os pinos de dissecação. </li><li> Euthanize o mouse imediatamente após a remoção do músculo por deslocamento cervical. </li><li> Atar suturas para o 10dons, o mais próximo possível do músculo, mas não tocando o músculo. Pin o músculo em comprimento aproximadamente repouso usando as suturas. </li></ol> 2. Dissecção diafragma e Preparação (aproximadamente 30 minutos) <ol><li> Eutanásia dos ratos antes deste procedimento por deslocamento cervical, sob anestesia, mesmo se o rato é submetido a dois esvaziamentos, ou CO 2, seguido de confirmação com deslocamento cervical. </li><li> Fazer uma incisão na pele para expor a cavidade abdominal e torácica. Abra a cavidade abdominal, e cortar a parede do corpo, logo abaixo das costelas. Com uma tesoura de ossos, e de partida acima da inserção do diafragma, corte em torno de toda a caixa torácica, seguindo a linha das nervuras, e cortar através da coluna. Cortar os vasos sanguíneos que atravessam o centro do diafragma de modo que o diafragma pode ser removido facilmente. </li><li> Retire o diafragma do rato, e coloque em um prato cheio de dissecar Ringers oxigenados. Agite suavemente o DIAPhragm no prato para lavar o sangue. Refrescar solução de Ringer, conforme necessário. </li><li> Cortar uma tira pequena do diafragma do tendão no centro das nervuras ao longo da orientação das fibras na porção central das hemidiafragmas laterais. A tira deve ser entre 2-4 mm de largura. Com uma tesoura de ossos, corte a nervura em ambos os lados da tira, deixando aproximadamente 1-2 mm de saliência nervura em ambos os lados da tira de membrana. </li><li> Atar suturas ao tendão central. Laço de sutura para cada uma das extremidades das costelas lateralmente salientes e, em seguida amarrar estes em conjunto para fazer um laço grande. </li><li> Duas tiras podem ser obtidas a partir de qualquer dada diafragma (um de cada lado). </li></ol> 3. Músculos de montagem em Bath Mecânica <ol><li> Agarrar as suturas e usá-las para ligar o músculo a um poste rígida em uma extremidade, e a um transdutor de força, na outra extremidade. </li><li> Ajustar o comprimento para assegurar que o músculo não é folga, mas não está esticado. Uma boa aproximação é a musc repousole comprimento como em 1,4-1,5. </li><li> Banho deve ser cheio com solução de Ringer oxigenado mantida a 22 ° C para prolongar a estabilidade do músculo para teste. Músculos deve repousar durante 5 minutos neste banho, antes do teste funcional de modo que a temperatura do músculo é equilibrada a 22 ° C. </li></ol> 4. Contrações isométricas <ol><li> Estabelecer condições de estimulação supramáxima. Depois de um músculo é colocado no banho, usa pulsos de estimulação únicos 0,5 ms para gerar um tique, e monitorar a saída de força. Gradualmente aumentar a corrente até que a força atinge um nível máximo, mas constante. Aumentar a corrente a 10% mais do que este nível para os demais experimentos. </li><li> Estabelecer comprimento ideal. Usando estímulos contração isométrica, ajustar o comprimento do músculo gradualmente até que uma força máxima é obtida. Descansar o músculo ~ 10 segundos entre cada contração. Comprimento do músculo óptima (L o) é obtida quando a força é máxima contração. Comprimento de registro muscular (o comprimento sertre as junções miotendínea para EDL e entre a junção miotendínea tendão central e a inserção do músculo para a nervura), utilizando compassos de calibre de Vernier. </li><li> Força isométrica máxima tetânica. Estimular o músculo fixado em L o por um período de 500 ms, com uma série de pulsos de 0,5 ms a estimulação supramáxima e na freqüência de fusão (a partir do planalto da relação freqüência-força (por exemplo, Ref:. 8) O planalto para os músculos EDL é tipicamente alcançado com 120 Hz, e para os músculos do diafragma com 100 Hz. Estimular a 3 vezes na freqüência correspondente com períodos de descanso de 5 minutos entre as sessões de estimulação para cada músculo. </li></ol> 5. Contrações excêntricas <ol><li> Permitir muscular para descansar 5 minutos entre a realização de contrações isométricas e excêntricas. </li><li> Estimular os músculos a 80 Hz para o isometricamente inicial de 500 ms, seguido de um estiramento de 10% L o na final estimulação msec 200 (uma taxa de estiramento de 0,5 L o/ Seg.) </li><li> Repita padrão de estimulação com 5 min entre descansos para o número desejado de contrações excêntricas. </li><li> Medir a força de cada contracção no período de tempo antes do estiramento. Calcule a queda na força de contração entre o primeiro eo último. </li></ol> 6. Remoção do músculo do Aparelho <ol><li> Encurtar o comprimento do músculo para permitir a remoção suave do músculo do transdutor e postar e devolvê-lo a um prato de dissecação com Ringer. </li><li> Remover as suturas dos músculos. </li><li> Para o músculo EDL, limpar o músculo, duas vezes, em seguida, pesar, antes de um processamento subsequente (por exemplo, congelamento de fixação, etc.) Isto será importante para o cálculo da área da secção transversal, e uma força específica. </li><li> Para o músculo do diafragma, embeber em 0,1% Procion laranja, um corante impermeante de membrana para 15-20 min. Isto irá proporcionar um índice de dano dissecção. </li><li> Dissecar a distância do músculo esquelético de inserção, bem como o centtendão ral. Isto é necessário para proporcionar um peso preciso do músculo. Blot como acima antes da pesagem e posterior preparação. </li><li> Calcular a área transversal (CSA): CSA (mm 2) = massa (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)], onde L / L o é a fibra de músculo relação comprimento (0,45 para EDL, 1,0 para o diafragma) 5 e 1,06 é a densidade do músculo. </li></ol>

<ol>
	<li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro.">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li><li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. 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B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li><li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations.">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li></ol>

Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Aurora Científica.

O objetivo deste artigo é fornecer orientação para a execução da função muscular isolado em dois músculos de camundongos - a EDL e do diafragma. A avaliação destes músculos pode fornecer informações sobre se deve ou não candidatos terapêuticos para a doença muscular são benéficas. Para ambos os músculos, o principal fator na obtenção de dados consistentes que uma dissecação limpa. Portanto, praticando e aperfeiçoando o passo isolamento inicial é essencial antes de passar para testes funcionais. Além disso, o estabelecimento de parâmetros funcionais para muscular normal é fundamental antes de fazer comparações com o músculo distrófico, ou entre os tratamentos. Isto irá assegurar que os resultados do estudo não estão sujeitos a variabilidade conferida pela capacidade da pessoa que realiza as experiências. O uso de um corante impermeante de membrana podem ajudar com a optimização da preparação de dissecação, para a incubação de qualquer músculo, em uma solução que contém um tal corante irá marcar a maioria das fibras danificadas, e pode servir como um indicador de dissection sucesso. Minimizar o número de fibras danificadas no músculo irá ajudar a otimizar a medição. As fibras danificadas por dissecção fluorescência muito mais intensamente do que os danos por contracção excêntrica, e por isso, se o corante é também usado durante o processo de mecânica, pode-se usar a intensidade do corante para distinguir entre os dois tipos de danos. Dissecação de tiras de membrana terá sempre os danos nas fibras, simplesmente porque, cortando ao longo do comprimento das fibras, inevitavelmente algumas são destruídas. A absorção do corante é forte em que essas fibras danificadas, e estas são normalmente restringida às arestas exteriores da preparação. Em média, observa-se uma banda de fibras danificadas isto é ~ 3 fibras de largura (~ 120 mm) de cada lado da tira de músculo. Se a faixa danificada compreende mais de 15% do músculo, em seguida, os dados são descartados. A preparação diafragma também tem restrições sobre o tamanho ideal para as medidas funcionais. Encontraram-se que os pedaços de diaphragm que são maiores do que 5 mm começam a dobrar-se sobre si mesmos, porque o empate tendão central é apenas em um ponto. Isto resulta numa diminuição da força específica na preparação. Verificámos também que as tiras mais estreitas também têm menor força específica, que acreditamos ser visto que o número de fibras que foram danificados durante a dissecção compreendem uma maior proporção do número total de fibras. Por exemplo, se 0,1 milímetros de cada lado está danificado e, em seguida, que é de 5% (2x0.1 mm / 4 tira mm) da preparação de músculo que não contribui para a força, enquanto que, se a tira é apenas 1 mm, em seguida, 20 % da preparação de músculo está danificado. Assim, tanto a largura da região danificada, bem como a largura de toda a preparação são factores importantes para controlar. As medições de tensão isométrica máxima requerem que todas as fibras musculares em um músculo é estimulado. Uma vez que há uma grande variedade na dos componentes de um aparelho de funcionamento, isto deve ser determinado para cada conjunto individual-se. Por exemplo, o tamanho do banho ou do tipo de estimulador pode afectar a intensidade da estimulação. Estimulação Twitch é uma forma razoável para determinar as condições de estimulação supramáximos. Uma vez que esta é estabelecida por uma configuração específica e muscular, ele pode ser utilizado para estudos posteriores. Em contrapartida, o comprimento óptimo de qualquer músculo dado tem de ser medida para cada preparação utilizando o processo iterativo descrito acima. Isto assegura que não há sobreposição de filamentos grossos e finos são ideais e a capacidade de produção máxima potencial força é medida. Os processos alternativos podem contar com os padrões de difracção associados com as estrias do músculo, mas isso requer equipamento adicional não descrito aqui. Rotineiramente usar 500 durações estimulação ms, que cai na faixa média deste parâmetro utilizado por outros investigadores nesta área. Embora isto possa causar alguma fadiga do músculo durante a contracção, o que é evidentepor um &quot;sag&quot; na produção de força máxima, isso por si só pode ser informativo. Por exemplo, uma diferença de fadiga pode ser obtida por diferentes tipos de terapias, incluindo aqueles manuseamento de cálcio que, portanto, o objectivo de sag em vigor durante a contracção activo pode servir como um indicador de melhoria. Em alternativa, a perda de força pode indicar que as suturas nos tendões não são suficientemente apertado, e que são o escorregamento durante a contracção. O músculo devem ser removidos a partir do banho e as suturas devem ser re-ligada se isto ocorre. Nós também utilizar uma série de 3 contracções tetânica, o que ajuda a estimar a estabilidade da preparação. Mais uma vez, deslizamentos de sutura levaria à perda de força entre as contrações, requerendo sutura re-subordinação. Grandes músculos também pode gerar núcleos anóxicas, que levam a perdas de força durante o protocolo. Tamanho muscular é um fator limitante para a realização de testes de função muscular isolado, onde os músculos EDL com massas superiores a 20 mg perder força a cada contraçãoção, e não pode ser suportado por superfusão de um banho. Tiras de membrana não sofrem as mesmas complicações porque são suficientemente fina para que a viabilidade prolongada no banho. Outros músculos podem ser utilizados para a função do músculo cardíaco isolado, incluindo o músculo sóleo, que é comumente utilizada, mas não descritas aqui. Muitos dos mesmos procedimentos podem ser adoptados para o sóleo, em termos de preparação e os testes funcionais. No entanto, as principais diferenças estão na freqüência de estimulação, e os parâmetros para contrações excêntricas. Utilização dos sóleo de função complementa a dos outros dois músculos, e por isso deve ser considerado como parte de um &quot;pacote&quot; de avaliação camundongos distróficos 4, 7. Contração excêntrica proporciona um índice de fragilidade contráctil, e é importante o uso de um protocolo que resulta em perda de força modesta em músculos de animais de tipo selvagem e de uma perda significativa da força nasnão tratados músculos distróficos para que haja uma ampla faixa dinâmica para comparações. A falta de qualquer perda de força nos músculos normais sugerem que a contração excêntrica é muito leve, e não será suficiente para distinguir entre as terapias que não são eficazes e as que são realmente benéfica. No entanto, uma perda dramática de força nos músculos normais submetidos a contração excêntrica pode ser muito grande para trazer à tona diferenças associadas com a doença. O protocolo para o EDL e diafragma utiliza uma taxa de estiramento 0,5 Lo / sec para produzir uma alteração de comprimento de 10%. Nós normalmente executam 5 contrações excêntricas, que resultam em uma pequena perda de força nos músculos normais e uma significativa perda de força nos músculos distróficos. Certamente, todos estes parâmetros podem ser variados para aumentar o comprimento global mudança, a taxa de estiramento, ou o número de contracções excêntricas para distinguir diferenças entre músculo doente e saudável, bem como sobre os efeitos de um tipo específico de mutação ou tratamento um está estudando. Enquanto não existe uma diferença marcada entre os músculos normais e doentes, então existe um padrão de ouro para alcançar em termos de tratamentos. Em resumo, este protocolo estabelece as diretrizes para a realização de contrações isométricas e excêntricas, e espero que identifica os potenciais armadilhas a evitar quando definir esta técnica em seu laboratório.

As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais tratamentos para patologias do músculo, assim como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Para doença muscular, o uso de modelos de ratos se tornaram um componente central para a compreensão das ligações entre genótipo e fenótipo, e para estender esse conhecimento para o desenvolvimento e teste de terapêuticas potenciais. As distrofias musculares, em particular, basearam-se em ratos, para avaliar estes agentes e estabelecer dados pré-clínicos necessários para avançar para ensaios clínicos em doentes. A medida do resultado frequente usa a função do músculo cardíaco isolado para determinar a força, a qual é aplicável a uma ampla gama de estudos. Outra medida é a utilização de excêntricos, ou alongamento, contracções para determinar as alterações na integridade da membrana muscular, o que é deficiente na distrofia muscular de Duchenne, eo modelo de rato desta doença (mdx). Portanto, é essencial para estes tipos de measurementos para ser sensível e reprodutível. O rato extensor digitorum longus (EDL) do músculo tem sido amplamente utilizado para a função do músculo cardíaco isolado, devido à sua geometria e tamanho ideal, incluindo a orientação das fibras uniforme e tendões definitivas 2, 5, 6, 10, 12. Métodos para músculos EDL medições isométricas funcionais foram descritos numa publicação anterior JoVE 8, bem como na SOP Treat-NMD 1. Nós estendemos a descrição destes métodos para incluir tanto contrações isométricas e excêntricas. Características da doença são evidentes no EDL, incluindo os ciclos heighted de degeneração / regeneração e produção de força diminuída. O diafragma de rato apresenta a progressão mais rápida patológica de distrofia muscular em comparação com outros músculos do rato 11. Aos 6 meses de idade, fibrose cumulativa compreende aproximadamente 50% do músculo. Isto resulta em significativamente diminuissed produção de força 11. Portanto, agentes terapêuticos que podem impedir a infiltração fibrótica pode ser avaliada de forma eficiente no diafragma. A perda da distrofina no músculo leva ao aumento da fragilidade e danos contráctil aumentada em todos os 9 músculos. Portanto, muitas terapias para a distrofia muscular de Duchenne são voltadas para a substituição da distrofina. Como tal, um ensaio que se tornou essencial para a avaliação destas estratégias é a contração excêntrica, que podem distinguir entre o músculo normal e distrófica, bem como determinar o que beneficiem de uma estratégia particular, para proteger um músculo distrófico de danos contrátil 2, 3, 4, 12. Este procedimento requer um duplo modo de servo-motor, que é capaz de modular / registo de tamanho e força, ou por um método de ajustar o comprimento rapidamente separado a partir de um transdutor de força.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sistema de teste in vitro do músculo </td><td> Aurora Científico </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE fonte de luz </td><td> Schott-FOSTEC </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Angulares tesoura de dissecção </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Cabo de bisturi </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td> ferramenta de dissecação alternativo </td></tr><tr><td> Curvadas lâminas de bisturi # 12 </td><td> Ciência finaFerramentas </td><td> 10012-00 </td><td> ferramenta de dissecação alternativo </td></tr><tr><td> Tesoura osso </td><td> Belas Science Tools </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> S &amp; T sutura subordinação fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 00272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS fórceps - angular </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Tamanho sutura trançada de seda 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Fita médica </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de cetamina 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Dose final é de 80 mg / kg </td></tr><tr><td> Injecção TranquiVed (xilazina 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Dose final é de 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reativo laranja 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Componentes da solução Ringers </td><td></td><td></td><td> Solução é equilibrada com o gás de 95% de O2 e 5% de CO 2, pH final 7,4 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Concentração Final: 118 mM </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> A concentração final: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Di-hidrato de cloreto de cálcio </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> A concentração final: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> A concentração final: 1,2 mM </td></tr><tr><td> O sulfato de magnésio </td><td> JT Baker </td><td> 2500-01 </td><td> Concentração final: 0,57 mM </td></tr><tr><td> 4 - (2-hidroxietil) tuborazine-1-etanossulfónico (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Concentração final: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> A concentração final: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies

Crítico para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para a doença muscular são sensíveis e reprodutíveis avaliações fisiológicas da função muscular. Porque muitos ensaios pré-clínicos confiam em modelos de mouse para estas doenças, a função muscular isolado tornou-se um dos padrões para Go / NoGo decisões em movimento candidatos da droga para a frente em pacientes. Iremos demonstrar a preparação do extensor digitorum longus (EDL) e músculos do diafragma para testes funcionais, que são os músculos predominantes utilizados para estes estudos. A geometria do músculo EDL é ideal para preparações de músculo isolado, com dois tendões facilmente acessíveis, e um tamanho pequeno, que pode ser suportado por superfusão de um banho. O diafragma apresenta profunda patologia progressiva em animais distróficos, e pode servir como uma plataforma para avaliar muitas terapias potenciais contrariando fibrose, e promover a estabilidade fibromuscular. Protocolos para testes de rotina, incluindo isométrica e excêntricacontrações TRIC, será mostrado. Força isométrica fornece a avaliação da resistência, e as contracções excêntricas ajudar a avaliar a estabilidade do sarcolema, que é interrompida em diversos tipos de distrofias musculares. As comparações dos resultados esperados entre os músculos de tipo selvagem e os músculos distróficos também será fornecida. Estas medidas podem complementar as medições morfológicas e bioquímicas da homeostase do tecido, bem como a avaliação de animais inteiros da função muscular.

Os valores esperados para as forças isométricas do músculo EDL a partir de 12 semanas de idade, os animais são mostrados na Figura 1. Como os músculos mdx apresentam hipertrofia compensatória, força tetânica total pode ser maior em comparação com o músculo mdx idade controlos de tipo selvagem correspondentes. No entanto, uma medida mais apropriada da saída funcional é a força específica (Figura 2), em que a força é normalizado para a área da secção transversal para calcular este valor. Força específica depende da capacidade inerente funcional do músculo, em que a fraqueza nos músculos distróficos é mais aparente quando tanto a força absoluta e área da secção transversal são contabilizados. Em nossas mãos, músculos EDL de camundongos mdx gerar aproximadamente 20 - 25% mais baixas do que aquelas forças específicas de idade foram camundongos tipo selvagem 10-26 semanas de idade. Para o diafragma, apenas a força específica é relevante para comparações, porque a preparação é uma parte do músculo dependente da Dissection. Comparação da força específica entre o tipo selvagem e os músculos do diafragma mdx reflecte a patologia progressiva neste tecido. Saída de força isométrica diminui com a idade (Figura 3), de modo que aos 6 meses de idade, os músculos do diafragma de ratos mdx produzir mais do que metade do produto funcional do diafragma a partir de tiras de controles pareados por idade de tipo selvagem. Um exemplo de contracções excêntricas dos testes diafragma é mostrado na Figura 4. Com cada contracção subsequente excêntrico, produção de força diminui em tiras de membrana de ambos tipo selvagem (C57) e ratos mdx. No entanto, a perda de força é mais dramática em amostras de músculo do rato mdx, presumivelmente a partir da ausência de distrofina e suas proteínas associadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figura 1. Força tetânica isométrica no tipo selvagem e EDL mdx f músculos<html> camundongos rom 12 semanas de idade. Força absoluta pode ser maior em pareados por idade músculos mdx EDL devido à hipertrofia compensatória. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figura 2. Força isométrica tetânica normalizados por área seccional muscular é Força específico, e revela pressionada a capacidade funcional do músculo EDL a partir de ratos mdx em comparação com aqueles dos ratinhos de tipo selvagem. Traços são dos mesmos ratinhos como mostrado na Figura 1. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figura 3. A perda progressiva da capacidade de geração de força avaliada por força específica é mais aparente no diafragma de ratos mdx (barras vermelhas) em comparação com o tipo selvagem (C57 na linha azul). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. A perda de força em função do número de contração excêntrica para os músculos do diafragma a partir de 12 semanas de idade e C57 ratos mdx. Os dados são médias ± SEM para N = 4 músculos por genótipo.

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Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para o músculo patologia, bem como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Vamos demonstrar a preparação do extensor longo dos dedos e músculos do diafragma para testes funcionais. Protocolos para contrações isométricas e excêntricas será mostrado, bem como as diferenças de resultados entre os músculos distróficos, representando um estado patológico, e os músculos de tipo selvagem.

Avaliação Geração isométrica e excêntrica Força dos músculos esqueléticos Isolado de modelos murinos de Distrofias Musculares

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

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Research

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Biology

32.6K visualizações.  School of Dental Medicine, University of Pennsylvania. As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para o músculo patologia, bem como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Vamos demonstrar a preparação do extensor longo dos dedos e músculos do diafragma para testes funcionais. Protocolos para contrações isométricas e excêntricas será mostrado, bem como as diferenças de resultados entre os músculos distróficos, represe...

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Biologia

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

O Ex vivo Preparação microvasos isolada esquelético de Investigação da reatividade vascular

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triagem de Tecidos e Congelamento de modelos de doença do músculo esquelético

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Medidas de contratilidade no isolado músculos papilares de Investigação de Cardiac inotropia em Ratos

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been reported that skeletal muscle may increase the extraction of glucose from the blood by up to 50-fold during exercise compared to resting conditions. The increase in muscle glucose uptake during exercise and insulin stimulation is dependent on the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4) from intracellular compartments to the muscle cell surface membrane, as well as phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate by hexokinase II. Isolation and incubation of mouse muscles such as m. soleus and m. extensor digitorum longus (EDL) is an appropriate ex vivo model to study the effects of insulin and electrically-induced contraction (a model for exercise) on glucose uptake in mature skeletal muscle. Thus, the ex vivo model permits evaluation of muscle insulin sensitivity and makes it possible to match muscle force production during contraction ensuring uniform recruitment of muscle fibers during measurements of muscle glucose uptake. Moreover, the described model is suitable for pharmacological compound testing that may have an impact on muscle insulin sensitivity or may be of help when trying to delineate the regulatory complexity of skeletal muscle glucose uptake.
Here we describe and provide a detailed protocol on how to measure insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated soleus and EDL muscle preparations from mice using radiolabeled [3H]2-deoxy-D-glucose and [14C]mannitol as an extracellular marker. This allows accurate assessment of glucose uptake in mature skeletal muscle in the absence of confounding factors that may interfere in the intact animal model. In addition, we provide information on metabolic viability of incubated mouse skeletal muscle suggesting that the method&#160;applied possesses some caveats under certain conditions when studying muscle energy metabolism.

Intact regulation of muscle glucose uptake is important for maintaining whole body glucose homeostasis. This protocol presents assessment of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle when delineating the impact of various physiological interventions on whole body glucose metabolism.

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...