החוקרים מכירים במימון באמצעות משרד הגנת תוכניות בימוי congressionally מחקר רפואיים (# W81XWH-10-1-0445), מכונים לאומיים לבריאות (NIH R21 HL110056), ואיגוד לב אמריקאי (# 11SDG4890030).

1. הכנה ועיקור של חוצצים וסוכני מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 חיץ mM NaCl: ממס 4.383 גבישים גרם NaCl ב500 מיליליטר מי nanopure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Buffers pH: הכן מאגרי פוספט ב-pH 5.6, 6.2, 6.8, ו -7.4 על ידי ערבוב כמויות מתאימות של monobasic ופוספט נתרן dibasic. אם דגימות שלו תיבחנה בערכים נמוכים יותר (כלומר pH pH &lt;5.6) אז חיץ הולם יותר, כגון חיץ ציטרט, אמור לשמש. מתכוני חיץ זמינים, והתייחסות דוגמה כבר ספקה כאן 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל המאגרים שצוינו לעיל באמצעות מנגנון בקבוק עליון ואקום סינון ומחדש לבדוק pH של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20% טריטון X-100 (ביקורת חיובית): מערבבי 20 מ&quot;ל טהור טריטון X-100 ב 80 מיליליטר מי nanopure. מערבולת במרץ וsonicate לפזר. השאר בטמפרטורת חדר למשך לילה לפני השימוש. </li></ol> 2. הכנת אריתרוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג 25 מ&quot;ל של הדם frאום תורם אנונימי אנושי, נשאב היישר לתוך K צינורות Vacutainer 2-EDTA מצופים למניעת קרישה. </li></ol> הערה: כל הנהלים יש לקבל אישור מראש על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי המתאים (IRB), וvenipuncture ואיסוף דם חייב להיעשות על ידי phlebotomist מיומן כדי למזער את הסיכון לתורם. נהלי phlebotomy סטנדרטיים כבר פורסם במקום אחר 13. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דם ב 500 XG למשך 5 דקות, ורמות אות המטוקריט (אדום, שכבה תחתונה) ופלזמה (שכבה צהבהבה, עליונה) בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות דרך פלזמת micropipettor, להוסיף לאקונומיקה, והשלך לפסולת ביולוגית מסוכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צינור המטוקריט לקו מסומן (רמה המקורית של פלזמה) עם פתרון NaCl 150 מ&quot;מ. כובע ולהפוך כמה פעמים בעדינות לתערובת. צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.3-2.4 לשטוף תאי דם שוב. אז לשאוב supernatנמלה ולהחליף עם PBS ב-pH 7.4. הפוך לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול דם באופן שווה לארבעה צינורות, מתאים לכל רמת חומציות שתיבחן. תייג את הצינורות על פי כל pH שנבדק (5.6, 6.2, 6.8, 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות דם ב 500 XG למשך 5 דקות. סמן רמות על צינורות, ואז לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא כל צינור לקו מסומן בחיץ של pH המתאים (כמצוין ב2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל ייבל (אחד בכל רמת חומציות למבחן), ו49 מ&quot;ל של PBS pipet של pH המתאים לכל צינור חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אריתרוציטים (אותו pH) לתוך צינור מקביל ל1:50 דילול. חזותי לבדוק את הדם בדילול המלא, אשר אמור להיות עכור ויסתפק אם נותר באין מפריע. אם אין טפסי גלולה, תאים לי lysed. </li></ol> 3. התקנת תמוגה Assay 96 ובכן פלייט וכימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרוני מניות של כל סוכני אספקת התרופה הניסיוניים, ב20x הריכוז הסופי הרצוי להיבדק (Assayייקח 10 μl של סוכן משלוח סמים + 190 תאי μl מדולל דם אדום, שהובילו לדילול 1/20 של סוכן משלוח התרופה המקורי לתוך תערובת המבחן הסופית). מניות של 20, 100, ו 800 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מוצעות, וכתוצאה מריכוזי בדיקה סופיות של 1, 5, ו 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl Pipet של כל פתרון למניית V-תחתון צלחות 96-כן. לקבלת תוצאות אופטימליות, טען כל דגימה בשלושה עותקים או ארבע פעמים. </li></ol> הערה: על מנת להקל, מומלץ שצלחת נפרדת 96-גם צריכה להיות מוכנה לכל pH שנבדק, עם כל מדגם (בכל ריכוז) נטען בn = 3-4 לצלחת. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבארות בקרה חיוביות, להוסיף 10 μl של טריטון 20% X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבארות בקרה שליליות, להוסיף 10 μl של חיץ פוספט. השתמש במאגר באותו pH שנבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 190 μl Pipet של אריתרוציטים המדוללים (ראה 2.10) לכל באר, מה שהופך פתרון מניות תא בטוח נשארהומוגנית במהלך העברה. רמז: שימוש מרובים ערוצים פיפטה כדי לפשט משימה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת (אופציונלי: השתמש בהקפה ייקרה או נדנדה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות עבור 5 דקות ב 500 XG לאריתרוציטים השלמים הגלולה. הערה: בעת הסרת הצלחת מצנטריפוגה והובלתו לשלב הבא, יש לטפל בזהירות ולהיות בטוחים שלא לשבש את התא הגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet רב, להעביר 100 μl של supernatant מכל באר לתוך צלחת ברורה, עם תחתית שטוחה 96-כן. הערה: אם תא הגלולה מופרת בטעות לכל דוגמה (ו), אפשר מחדש סרכזת צלחת ולאחר מכן להמשיך בהעברת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ספיגת supernatants עם קורא צלחת. שים לב שטווח של אורכי גל יכול לשמש (400-541 ננומטר). </li></ol> הערה: קוראי צלחת שונים עשויים להיות נקודות רוויות ורגישויות שונות, ולכן הבחירה של אורך גל עבוריasurements תלויה אם או לא נתוני המוליזה מדגימות ניסיוניות ניתן מנורמלים אמינים נגד המוליזה מרבי הנגרמים על ידי טיפול חומר ניקוי. זה דורש מדידה מדויקת של ערכי ספיגה של דגימות בקרה החיוביות. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש ב-Microsoft Excel או תוכנת ניתוח נתונים דומה, מוצא את הממוצע של קריאות ספיגת הרקע מן דגימות בקרה השליליות להגדיר עבור כל רמת חומציות (שלב 3.4). לחסר ערך ספיגה זה רקע מכל המדגמים האחרים שנמדדו שבדרגת החומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רקע חיסור, למצוא את הספיגה הממוצעת של השליטה החיובית דגימות חומר ניקוי שטופל (שלב 3.3). אז לנרמל את כל נקודתי נתונים הניסיוניות לשווי ספיגה זה אומר, שאמור לייצג המוליזה של 100%. לבסוף, יש להכפיל כל ערך גם על ידי 100% כדי לחשב המוליזה% שחלו בכל פרט ופרט גם ביחס לשליטת חומר הניקוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme.">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li><li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery.">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li><li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Delivery+of+a+Proapoptotic+Peptide+via+Conjugation+to+a+RAFT+Synthesized+Endosomolytic.">Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic.</a> 7, 468-476 (2010).</li><li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals.">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li><li>Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+endosome-disruptive+peptides+on+gene+transfer+using+synthetic+virus-like+gene+transfer+systems.">The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).</li><li>Ratner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cells+Are+Sensitive+Detectors+of+Bacterial+Pore-forming+Toxins.">Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).</li><li>Saar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+A+comparative+membrane+toxicity+study.">Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study.</a> Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).</li><li>Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-mediated+gene+delivery:+a+mechanistic+study.">Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study.</a> The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).</li><li>Behr, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proton+Sponge:+a+Trick+to+Enter+Cells+the+Viruses+Did+Not+Exploit.">The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit.</a> CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).</li><li>Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data for Biochemical Research. , (1986).</li><li>Ernst, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied Phlebotomy. , (2005).</li><li>Bulmus, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pH-responsive+and+glutathione-reactive,+endosomal+membrane-disruptive+polymeric+carrier+for+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs.">A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).</li><li>Lackey, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolytic+Activity+of+pH-Responsive+Polymer-Streptavidin+Bioconjugates.">Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).</li><li>Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+pH-responsive+polymers+for+the+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs.">Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).</li><li>Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+and+synthesis+of+polymers+for+eukaryotic+membrane+disruption.">The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+endosomal+barrier+by+amphotericin+B-loaded+dual+pH-responsive+PDMA-b-PDPA+micelleplexes+for+siRNA+delivery.">Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery.</a> ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+local+delivery+of+siRNA+from+an+injectable+scaffold.">Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold.</a> Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).</li><li>Miozzari, G. F., Niederberger, P., H&#252;tter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+microorganisms+by+Triton+X-100.">Permeabilization of microorganisms by Triton X-100.</a> Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).</li><li>Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsaturated+Cationic+Ortho+Esters+for+Endosome+Permeation+in+Gene+Delivery.">Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).</li><li>Roth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Measurements+and+Rational+Materials+Design+for+Intracellular+Delivery+of+Oligonucleotides.">Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides.</a> Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).</li><li>Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-dependent+lysis+of+liposomes+by+adenovirus.">pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus.</a> Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).</li><li>Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+endosomal+escape+peptides+on+in+vitro+gene+delivery+of+polyethylene+glycol-based+vehicles.">The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles.</a> The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).</li><li>Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly(DL-lactide-co-glycolide)+nanoparticles:+implications+for+drug+and+gene+delivery.">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li></ol>

אישור IRB: פרוצדורות הקשורות בבני אדם שאושרו על ידי מועצת המנהלים של האוניברסיטה ונדרבילט המוסדית הסקירה (IRB; פרוטוקול # 111251). אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פולימרים המגיבים לרמת חומציות או סוכנים אחרים שנועדו לתפקוד endosomolytic יכולים להיות מוקרן במהירות וביעילות על בסיס תמוגה של תאי דם אדומים בערכי pH נתקלו בendosome (איור 1; pH 6.8 - endosome מוקדם, pH 6.2 - endosome מאוחר, pH 5.6 - lysosome). 14-17 המוליזה חומציות תלויה נעשה שימוש כדי להק?...

אמנם יש מטרות פוטנציאליות רבות השפעה גבוהה טיפוליות בתוך התא, משלוח תאיים של סוכנים מהווה אתגר משמעותי. לעתים קרובות, תרופות, בעיקר ביולוגי, הם הפנימו על ידי תאים ונסחרים בשלפוחית ​​כי גם להוביל להידרדרות התכנים שלהם דרך מסלול Endo-lysosomal, או מועברים מדלת אחורית של התא דרך exocytosis. 1 בתהליך האחרון, pH הפנימי של השלפוחית ​​היא acidified לכ 5-6, המהווה את ה-pH האופטימלית לפעילות של אנזימים המתפקדים בתא זה, כגון Lysozyme 2. לאחרונה, מספר החומרים שתוכנן במיוחד כדי למנף את ההחמצה של endosomes להקל על הגשת cytosolic של המטען. אחת דוגמאות לגישה זו משתמשת, חלקיקי פולימר סינטטיים micelle ליבה שלהם הוא zwitterionic ותשלום ניטראלי ב pH הפיזיולוגי (כלומר 7.4). עם זאת, ב6.0 pH- 6.5, הפולימרים הפכו protonated ולרכוש מטען חיובי נטו שמערער ליבת micelle, ומגזרי הפולימרים נחשפו אינטראקציה עם ולשבש את קרום endosomal. פעילות זו הוכחה לקדם את בריחת endosomal של רפוי פפטידים וחומצות גרעין מבוסס, המאפשר להם לגשת למטרות cytosolic. 3,4 דוגמאות נוספות לשיטות שפותחו לתווך בריחת endosomal שישבש את מחסום הקרום כוללים פפטידים &#39;fusogenic&#39; או חלבונים שיכולים לתווך איחוי או היווצרות נקבובית חולפת בbilayer פוספוליפידים. 5 Homopolymers של חומצות אקריליק אלקיל anionic כגון פולי (חומצת propylacrylic) הם עוד גישה למד היטב, ובפולימרים אלו, מדינת protonation של חומצת carboxylic תליון מכתיבה מעבר לידרופובי, מדינת קרום מפריע בטווחי pH Endo-lysosomal. 6,7 מערכת מודל שימושית אחד לסינון התנהגות endosomolytic היא הדוארassay x vivo החומציות התלויה המוליזה. 8 במערכת מודל זה, הקרום הכדורי האדום משמש כתחליף לשומני קרום bilayer שמצרף שלפוחית ​​Endo-lysosomal. מודל הכללה זו נעשה שימוש על ידי אחרים כדי להעריך את התנהגות endosomolytic של פפטידים תא חודרים ומערכות אספקה ​​אחרות פולימריים גנים. 8-11 בניסוי זה, תאים אנושיים דם אדומים וחומרי בדיקה הם שיתוף מודגרות-בחוצצים בPHS המוגדר המחקים תאיות (7.4), מוקדם endosomal (6.8), ומאוחר Endo-lysosomal (&lt;6.8) הסביבות. כמות ההמוגלובין שפורסם במהלך תקופת הדגירה היא לכמת כמדד לתמוגה תאי דם אדומה, שמנורמלת לכמות ההמוגלובין פרסמה בדגימות בקרה חיוביות lysed עם חומר ניקוי. מהקרנת ספרייה קטנה של חומרי בדיקת הפוטנציאל endosomolytic, ניתן להסיק כי דגימות שמייצרות לא המוליזה ב-pH 7.4, אבל שולים גבוהים באופן משמעותיolysis ב-pH &lt;6.5, יהיה המועמדים היעילים וcytocompatible ביותר עבור משלוח סמים cytosolic. חומרים המתאימים לקריטריונים אלו יהיו צפויים להישאר אדישים ולא להרוס ללא הבחנה קרומי bilayer שומנים (כלומר שעלולה לגרום cytotoxicity) עד שנחשף לירידה ברמת החומציות המקומית בעקבות הפנמה לתאי אנדו-lysosomal. בפרוטוקול זה, אריתרוציטים מבודדים מתורם אנושי ושיתוף מודגרות-ב-pH 5.6, 6.2, 6.8, או 7.4 עם סוכני משלוח ניסיוניים endosomolytic סמים. אריתרוציטים שלמים pelleted, וsupernatants (המכיל המוגלובין שוחרר מאריתרוציטים lysed) מנותח לספיגה האופיינית למוגלובין באמצעות קורא צלחת (איור 1).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer צינורות </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 22-253-145 </td><td> לאיסוף דם </td></tr><tr><td> מחטי BD Vacutainer דם אוסף, 20.5-מד </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02-665-31 </td><td> לאיסוף דם </td></tr><tr><td> בעל / מחט מתאם Tube Vacutainer BD </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 22-289-953 </td><td> לאיסוף דם </td></tr><tr><td> BD מותג איזופרופיל אלכוהול מטליות </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-680-63 </td><td> לאיסוף דם </td></tr><tr><td> BD-Vacutainer אטקס חינם חוסם עורק </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02-657-6 </td><td> לאיסוף דם </td&gt; </tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית (conc.) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A144-500 </td><td> להתאמה של ה-pH של D-PBS. </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T8787 </td><td> ביקורת חיובית </td></tr><tr><td> PBS של Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene MF75 יחידת סטרילי פנוי בקבוק למעלה עם מסנן SFCA ממברנה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 09-740-44A </td><td></td></tr><tr><td> צלחות BD 96-כן, קלקר שטוח תחתית, רקמת תרבות מטופלים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08-772-2C </td><td> לצלחת קריאה בסוף הבדיקה. </td></tr><tr><td> צלחות BD 96-כן, קלקר עגולים תחתיות ורקמות התרבות טופלה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08-772-17 </td><td> לדגירה של תאי דם אדומים עם סוכנים ניסיוניים. </td></tr></שולחן&gt;

ex vivo red blood cell hemolysis assay for the evaluation of ph-responsive endosomolytic agents for cytosolic delivery of biomacromolecular drugs

bilayers פוספוליפידים שמרכיב שלפוחית ​​Endo-lysosomal יכול להוות מכשול למשלוח של תרופות ביולוגיות למטרות תאיות. כדי להתגבר על המכשול הזה, מספר נישאי תרופות סינטטיים כבר מהונדס באופן פעיל כדי לשבש את קרום endosomal ולספק סחורות לציטופלסמה. כאן, אנו מתארים את assay המוליזה, שיכול לשמש גם כמסך מהיר, תפוקה גבוהה ולפעילות cytocompatibility endosomolytic של מערכות אספקת סמים תאיות. בבדיקת המוליזה, תאים אנושיים דם אדומים וחומרי בדיקה הם שיתוף הדגרו בחוצצים בPHS המוגדר המחקים סביבות תאיות, מוקדם endosomal, ומאוחר Endo-lysosomal. בעקבות צעד צנטריפוגה לתאי דם אדומים שלמים גלולה, כמות ההמוגלובין משתחררת למדיום נמדדה spectrophotometrically (405 ננומטר לטווח דינמי הטוב ביותר). אז שיבוש תאי הדם האדום הוא לכמת אחוזים יחסית לשליטת samp החיוביles lysed עם חומר ניקוי. במערכת מודל זה קרום הכדורי האדום משמש כתחליף לשומני קרום bilayer שמצרף שלפוחית ​​Endo-lysosomal. התוצאה הרצויה היא המוליזה זניח ב-pH הפיזיולוגי (7.4) והמוליזה חזקה בטווח pH Endo-lysosomal מכ חומציות 5-6.8.

<html> בדרך כלל, את הסוכנים שמציגים התנהגות המוליטית חומציות תלויה אידיאלית יש את הפוטנציאל הגבוה ביותר למסירת cytosolic של תרופות, חומצות גרעין, או מולקולות ביו אחרות. זה בא לידי הביטוי על ידי סוכן # 1 כפי שהיא מתוארת באיור 2, אשר מציג המוליזה מינימאלי ב-pH 7.4, אך עלייה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs at JoVE.com

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Assay המוליזה יכול לשמש כמסך מהיר, תפוקה גבוהה של cytocompatibility &quot;מערכות אספקת סמים ופעילות endosomolytic למסירת מטען תאית. הבדיקה מודדת את השיבוש של קרום כדורי אדום כפונקציה של pH הסביבה.

Assay גופיים תא דם אדום המוליזה להערכת סוכני Endosomolytic pH המגיבים למשלוח cytosolic של סמי Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

ex-vivo-red-blood-cell-hemolysis-assay-for-evaluation-ph-responsive

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

34.0K Views.  Vanderbilt University. Assay המוליזה יכול לשמש כמסך מהיר, תפוקה גבוהה של cytocompatibility "מערכות אספקת סמים ופעילות endosomolytic למסירת מטען תאית. הבדיקה מודדת את השיבוש של קרום כדורי אדום כפונקציה של pH הסביבה.

Video: Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of disease or occurrence of serious complications. Ektacytometry uses laser diffraction viscometry to measure the deformability of red blood cells subject to either increasing shear stress or an osmotic gradient at a constant value of applied shear stress. However, direct deformability measurements are difficult to interpret when measuring heterogenous blood that is characterized by the presence of both rigid and deformable red cells. This is due to the inability of rigid cells to properly align in response to shear stress and results in a distorted diffraction pattern marked by an exaggerated decrease in apparent deformability. Measurement of the degree of distortion provides an indicator of the heterogeneity of the erythrocytes in blood. In sickle cell anemia, this is correlated with the percentage of rigid cells, which reflects the hemoglobin concentration and hemoglobin composition of the erythrocytes. In addition to measuring deformability, osmotic gradient ektacytometry provides information about the osmotic fragility and hydration status of erythrocytes. These parameters also reflect the hemoglobin composition of red blood cells from sickle cell patients. Ektacytometry measures deformability in populations of red cells and does not, therefore, provide information on the deformability or mechanical properties of individual erythrocytes. Regardless, the goal of the techniques described herein is to provide a convenient and reliable method for measuring the deformability and cellular heterogeneity of blood. These techniques may be useful for monitoring temporal changes, as well as disease progression and response to therapeutic intervention in several disorders. Sickle cell anemia is one well-characterized example. Other potential disorders where measurements of red cell deformability and/or heterogeneity are of interest include blood storage, diabetes, Plasmodium infection, iron deficiency, and the hemolytic anemias due to membrane defects.

Here we present techniques to measure red cell deformability and cellular heterogeneity by ektacytometry. These techniques are applicable to general investigations of red cell deformability and specific investigations of blood diseases characterized by the presence of both rigid and deformable red cells in circulation, such as sickle cell anemia.

מדידת ודפורמביליות והטרוגניות תא אדום בדם על ידי Ektacytometry

Decreased red cell deformability is characteristic of several disorders. In some cases, the extent of defective deformability can predict severity of ...