Esta labor fue apoyada por subvenciones de funcionamiento para BAV de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of Canada (CCFC) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). GB fue financiado por una beca de postgrado de CIHR. BAV es de Niños con Trastornos intestinales y hepáticas (CHILD) Cátedra Fundación de Investigación Pediátrica EII y la Cátedra de Investigación de Canadá en Gastroenterología Pediátrica.

1. Preparación del inóculo y Citrobacter rodentium sonda oral de ratones <ol><li> Preparar y esterilizar en autoclave caldo Luria Bertani (LB). </li><li> Obtener viable C. rodentium de una reserva de glicerol congelado y raya sobre la placa de LB agar con un asa de inoculación estéril o punta de pipeta. Incubar a 37 ° C durante la noche. Inocular 3 ml de caldo LB estéril en un tubo de cultivo Falcon con colonias de la placa de LB con un asa de inoculación o punta de la pipeta. Preparación del inóculo debe hacerse utilizando técnicas asépticas. </li><li> Incubar la C. cultura rodentium aeróbicamente a 37 ° C durante la noche en un agitador de incubación de sobremesa a 200 rpm. El caldo LB inoculados deben aparecer turbia después del cultivo durante la noche. </li><li> Use un bulbo con punta de aguja gástrico sonda unida a una jeringa de 1 ml a cada ratón por sonda con 100 l de la noche a la mañana C. rodentium cultura. Suavemente scruff el ratón, sujetando firmemente la piel suelta sobre su cuello y la espaldacon el pulgar y los dedos. Tire hacia atrás de la cabeza del animal con su dedo índice para inmovilizar la cabeza y estirar el esófago para la inserción de la aguja sonda. </li><li> Mantener el ratón en una posición vertical y dirigir la punta de la bombilla de la sonda de aguja a lo largo del lado de la boca y sobre la lengua. Suavemente pasar la aguja a lo largo del techo de la boca y hacerlo avanzar por el esófago. Si hay alguna resistencia que durante este procedimiento, retire la aguja sonda y vuelva a insertarlo. </li><li> Poco a poco se inyectan 100 l de inóculo bacteriano y retire suavemente la aguja sonda. Supervisar la tasa de respiración y comportamiento del ratón después de regresar a su jaula. </li></ol> Notas: <ul><li> En los pasos 2 y 3, también preparar un tubo de cultivo Falcon usando técnicas asépticas con 3 ml de caldo LB estéril que se cultivaron durante la noche para garantizar que no hay contaminación bacteriana del propio caldo. El caldo de LB debe ser transparente después del cultivo durante la noche. </li><li&gt; Agitar suavemente el cultivo dentro del tubo Falcon antes de cargar jeringas para sonda de modo que una dosis igual de bacterias se entrega a cada ratón, en el paso 4. </li><li> Cultivo de una noche se deben desechar si se ha inoculado durante más de 24 h. </li><li> Todas C. infecciones rodentium y el alojamiento de los animales infectados deben llevarse a cabo en un nivel de bioseguridad 2 instalaciones. </li></ul> 2. Medición de la permeabilidad del colon barrera epitelial en C. rodentium ratones infectados <ol><li> Medir integridad de la barrera en un punto de tiempo deseado después de la infección. </li><li> En el día del ensayo, preparar suficientemente 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano disuelto en tampón fosfato salino (PBS) a una concentración de 80 -1 mg ml a cada ratón por sonda con 150 l y para preparar la curva estándar. </li><li> Scruff el ratón y la alimentación forzada con 150 l de FITC-dextrano. Retirar los alimentos de la jaula en este momento. </li><li> Anestesie ratones 4 horas despuésgavage y recoger la mayor cantidad de sangre posible (~ 450 l) a través de punción cardíaca. Añadir la sangre a una concentración final de ácido-citrato dextrosa 3% en un tubo de microcentrífuga para disuadir la coagulación. Eutanasia a los ratones y recoger tejidos de colon en PBS para recuentos bacterianos (pasos de 3,1 a 3,5) y en 10% de formalina durante la fijación del tejido y, finalmente, la tinción de inmunofluorescencia (pasos desde 4,1 hasta 4,8). </li><li> Girar las muestras de sangre a 1.000 xg durante 12 min en una centrífuga a 4 ° C. Se recoge el suero y se diluye a 1/10 y 1 100 / en PBS. Añadir 100 l de cada muestra en estos dos diluciones a una placa de 96 pocillos en repeticiones. </li><li> Para preparar la curva estándar, se diluye la original de 80 mg ml -1 FITC-dextrano usado por sonda a los ratones en PBS a las concentraciones siguientes: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, y 0 g / ml . Añadir 100 l de cada concentración a una placa de 96 pocillos por triplicado. </li><li> Cuantificar la fluorescencia de cada muestra usando un fluorómetro a una excitación wavelength de 485 nm y 535 nm de longitud de onda de emisión. </li><li> Analizar los datos sin procesar mediante el trazado de la curva estándar. Introducir los datos brutos para cada muestra en la ecuación de la línea generada por la curva estándar para determinar la concentración de FITC-dextrano en cada muestra. </li></ol> Notas: <ul><li> A partir del paso 4 en adelante, mantener las muestras de sangre en el hielo y minimizar la exposición a la luz. </li><li> Cuando se mide la integridad de la barrera epitelial de un punto en el tiempo, o antes de los 7 días después de la infección es óptima, como el daño tisular grave se produce después de este punto. Medición de integridad de la barrera antes de que ocurra daño grave le permite determinar las diferencias en la permeabilidad máxima durante C. rodentium infección entre las cepas de ratón. </li><li> Asegúrese de que los ratones control no infectadas también se prueban para integridad de la barrera epitelial. </li></ul> 3. La medición de la carga bacteriana en tejidos de C. rodentium ratones infectados <ol><li> Añadir 1 ml de PBS estéril unand un metal tratada en autoclave de vidrio hasta un fondo redondo de 2 ml tubo de centrífuga mediante una técnica aséptica. Tejidos individuales de cada animal se colocó en tubos separados de PBS. Pesar los tubos antes de la adición del tejido. </li><li> Retire el ciego y el colon desde el ratón. Separe el ciego del colon y eliminar el contenido luminal utilizando fórceps. Añadir el contenido de un tubo de PBS. Después de separar secciones de 0,5 cm en el colon distal y el ciego para 10% de fijación con formalina, cortar y abrir el colon y el ciego restante longitudinalmente y lavar con PBS estéril antes de colocar los tejidos en tubos. </li><li> Pesar los tubos de PBS con el tejido y, a continuación homogeneizar las muestras usando un batidor de cuentas durante 6 min a 30 Hz. </li><li> El uso de técnicas asépticas, añadir 180 l de PBS estéril por pocillo a una placa de 96 pocillos. Añadir 20 l de cada muestra homogeneizada para el primer pocillo en cada fila. Mezclar bien y diluir en serie, la adición de 20 l de cada pozo anterior para obtener diluciones de 10 -1 (primerll) de 10 -6. Placa de 10 l de cada dilución de cada muestra por triplicado en una placa de fondo cuadrada LB con una rejilla. Incubar durante una noche a 37 ° C. </li><li> Cuente unidades formadoras de colonias (UFC), entonces el promedio de los 3 cuentas y registrar la dilución en la que se contó cada muestra. Multiplicar promedio CFU por 50, como 20 l de la muestra original de 1 ml se utilizó, y por el factor de dilución en la que se contó la muestra resultante en CFU / ml. Por último, se divide por el peso del tejido para determinar CFU / g. </li></ol> 4. Evaluación histológica y tinción de inmunofluorescencia de tejidos infectados Colon <ol><li> Recoge los tejidos como en el paso 3.2. Tienda de tejidos en formalina durante la noche, luego lavar con etanol al 70%. Insertar tejidos en parafina y se cortaron secciones de 5 micras para la tinción. Teñir con hematoxilina y eosina para la evaluación histológica y continúe con los pasos siguientes para la tinción de inmunofluorescencia. </li><li> Para Desparafinar tejidos antes de la tinción, se desliza en lugaruna cubeta de Coplin y poner en baño de agua 65 ° C durante 10 min. A continuación, colocar los portaobjetos en xileno durante cuatro lavados de 2 minutos cada uno. Diapositivas entonces debe ser rehidratado con dos lavados de 5 minutos en 100% de etanol, seguido de un lavado de 5 min en cada uno de los siguientes: 95% de etanol, 75% de etanol y dH 2 0. Estos lavados se debe hacer en una campana de humos para evitar la exposición a los vapores nocivos. </li><li> Colocar los portaobjetos en la jarra Coplin con pre-calentado tampón de citrato de sodio y entonces coloque en un vapor durante 30 min, a continuación, dejar reposar durante 30 min. Este proceso rompe la proteína enlaces cruzados formados por la fijación con formalina recuperación de sitios antigénicos potenciales. </li><li> Lavar con PBS azida durante 5 minutos, tres veces. Portaobjetos secos y de zona de marca alrededor del tejido con un bolígrafo PAP para crear una barrera hidrófoba, manteniendo los reactivos de tinción localizados en el tejido. </li><li> Bloque de tejido durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (por ejemplo, α-suero de cabra) en una cámara de humedad inmunotinción. </li><li> Diluir primanticuerpo ary a la concentración deseada usando tampón de dilución de anticuerpos. Retirar el amortiguador de bloqueo y añadir 50-100 l de anticuerpo primario a los tejidos. Incubar a 4 ° C durante la noche o a temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Lavar con PBS azida durante 5 minutos, tres veces. Añadir 50-100 l de anticuerpo secundario diluido en tampón de dilución de anticuerpo a los tejidos y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. Lavar con dH 2 O durante 5 min, tres veces. </li><li> Deshidratar diapositivas, añadir DAPI Prolongar medio Oro de montaje y colocar un cubreobjetos. Ver desliza debajo de un microscopio de fluorescencia. </li></ol> Notas: <ul><li> PBS azida puede estar sustituido con PBS recién preparado como una alternativa para evitar el crecimiento bacteriano en el medio de lavado de la etapa 4 en adelante. </li></ul>

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P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4++T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li><li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt/&#946;-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and/or+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection.">Critical Roles of Notch and Wnt/&#946;-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection &amp; Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Citrobacter rodentium infección proporciona un modelo valioso para el estudio tanto de la enfermedad infecciosa y colitis en ratones. Este modelo único permite la caracterización de las dos respuestas del huésped, así como las propiedades patógenas de bacterias. Los pasos descritos en este detalle el protocolo del uso exitoso de este modelo. Hay varios pasos críticos en este protocolo a tener en cuenta cuando se provoque colitis y el análisis de las respuestas. En primer lug...

La infección por patógenos bacterianos entéricos desencadena gastrointestinal (GI) la inflamación, así como patología intestinal y la fisiopatología, incluyendo la diarrea y la disfunción intestinal barrera epitelial. Los mecanismos de virulencia de patógenos bacterianos que colonizan el tracto gastrointestinal de sus anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos, sin embargo, los avances recientes en la modelización de las infecciones bacterianas entéricas han comenzado a ayudar a nuestra comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Enfermedad de Crohn La EII (CD) y UC son enfermedades complejas de etiología desconocida, caracterizada por la inflamación crónica intestinal y daño tisular. Muchos modelos de ratón de inflamación intestinal existen, de la inflamación espontánea en cepas genéticamente modificados, tales como IL10 - / - ratones, a los desafíos químicas con compuestos, tales como sulfato de dextrano sódico (DSS) y dinitrobenzene sulfónico (DNBS) 1. Se ha hipotetizado que las inadaptadas respuestas crónicas inflamatorias presentes en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas 2, por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa también ofrece un potencial significativo para definir potencialmente patógena anfitrión . respuestas a bacterias entéricas Citrobacter rodentium colitis inducida es uno de los modelos raros de colitis infecciosa que ha sido bien caracterizado 1,3, lo que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas y una mayor comprensión de los mecanismos posibles de la patogénesis de la EII; un paso esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos. C. rodentium es una bacteria gram negativa adhesión y borrado (A / E), murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con el ser humano importantepatógenos enteropatógena E. coli (EPEC) y E. enterohemorrágica coli (EHEC) 3-8. La familia de patógenos A / E íntimamente adjuntar a la membrana de la célula huésped apical del epitelio cecal y colon, la formación de un no-invasivo pedestal-como la estructura de la célula huésped. Desafío oral con C. rodentium de 10 8 -10 9 organismos produce un robusto modelo de colitis infecciosa caracterizada por hiperplasia colónica o alargamiento de las criptas, la infiltración de células mononucleares inmune y el agotamiento de las células caliciformes 3,4. El sitio inicial de colonización, unas pocas horas después de la exposición, se encuentra en el parche cecal, seguida por evolución en el colon distal 2 a 3 días después de la infección 3. En cepas de ratones inmunocompetentes, el despacho del agente patógeno se logra 3 a 4 semanas después de la infección 1,3,4. Sin embargo, muchas cepas genéticamente modificados, es decir, gen deficiente o knockout (- / -) ratones, se han encontrado para mostrar increased susceptibilidad a la infección que resulta en daño exagerada y / o infección crónica y la inflamación 9-14. El uso de este modelo de colitis infecciosa en estas cepas knockout, muchos carecen de las proteínas de señalización innatas, ha sido indispensable en la revelación de varias proteínas de acogida integral a la resolución de la infección intestinal y la inflamación.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Caldo Luria </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Añadir 25 g de polvo LB a 1 litro de agua. Esterilizar en autoclave antes de usar. </td></tr><tr><td> Placa de fondo cuadrado con rejilla </td><td> Pescador </td><td> 08 a 757-11A </td><td></td></tr><tr><td> Falcon tubo de cultivo </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Bombilla con punta de aguja sonda gástrica </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml jeringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-dextrano </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> El ácido cítrico </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Citrato de sodio </td><td> Pescador </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrosa </td><td> Pescador </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido citrato dextrosa </td><td></td><td></td><td> 20 mM de ácido ctiric, citrato de sodio 110 mM, 5 mM de dextrosa </td></tr><tr><td> Negro de 96 pocillos </td><td> Pescador </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Cuentas de metal (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de formalina </td><td> Pescador </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml vial </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Pescador </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Pescador </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> Pescador </td><td&gt; HC700-1gal </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Tinción Coplin tarro </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de citrato de sodio </td><td></td><td></td><td> 10 mM citrato de sodio, 0,05% de Tween 20, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Pap pluma </td><td> Cedarlane </td><td> MU22 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de cabra </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Pescador </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio azida </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> El tampón de bloqueo </td><td></td><td></td><td> 2% de suero de cabra, 1% BSA, 0,1% de Triton X-100, 0,05% de Tween 20, 0,05% de sodioazida, 0,01 M PBS, pH 7,2, mezclar y almacenar a 4 º C. </td></tr><tr><td> Tampón de dilución de anticuerpo </td><td></td><td></td><td> 0,1% de Triton X-100, 0,1% de BSA, 0,05% de azida de sodio, 0,04% de EDTA </td></tr><tr><td> El tampón de bloqueo y tampón de dilución de anticuerpos para tir </td><td></td><td></td><td> Recetas Igual que el anterior, pero sin la adición de detergentes (Triton X-100 y Tween 20) </td></tr><tr><td> Prolongar Reactivo Antifade oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Pescador </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Benchtop incubación agitador </td><td> Barnstead Lab Line </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorómetro </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td> Buque de vapor </td><td> Negro &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

Este protocolo describe los pasos necesarios para producir un modelo robusto de enfermedades infecciosas y colitis, así como los métodos usados ​​para caracterizar la infección por Citrobacter rodentium en ratones. C. rodentium es un gram negativo, murino patógeno específico bacteriana que está estrechamente relacionado con la importancia clínica humana enteropatógena patógenos E. coli y E. enterohemorrágica coli. Tras la infección con C. ratones inmunocompetentes rodentium, sufren de pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Histológicamente, el alargamiento de cripta intestinal, infiltración de células inmunes, y la depleción de células caliciformes se observó. Aclaramiento de la infección se logra después de 3 a 4 semanas. La medición de la integridad de la barrera epitelial intestinal, la carga bacteriana, y daño histológico en diferentes puntos temporales después de la infección, permiten la caracterización de cepas de ratón sensibles a la infección. El mecanismo de virulencias por el cual las bacterias patógenas colonizan el tracto intestinal de los anfitriones, así como las respuestas específicas de acogida de defensa contra estas infecciones son poco conocidos. Por lo tanto el C. rodentium modelo de infección bacteriana entérica sirve como una herramienta valiosa para ayudar en la comprensión de estos procesos. Bacterias entéricas también se han vinculado a las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Se ha planteado la hipótesis de que las respuestas inflamatorias crónicas inadaptadas observados en los pacientes con EII se desarrollan en individuos genéticamente susceptibles tras la exposición anormal del sistema inmune de la mucosa intestinal de bacterias entéricas. Por lo tanto, el estudio de los modelos de colitis infecciosa ofrece un potencial significativo para la definición de las respuestas potencialmente patógenas de acogida a bacterias entéricas. C. rodentium colitis inducida es un modelo poco común que permite el análisis de las respuestas del huésped a las bacterias entéricas, ampliar nuestro conocimiento de los posibles mecanismos de la patogénesis de la EII;esencial en el desarrollo de nuevos tratamientos preventivos y terapéuticos.

Durante un experimento de infección estándar, los ratones se infectaron con aproximadamente 2,5 x 10 8 UFC a través de una sonda de 100 l C durante la noche rodentium cultura. La infección de ratones C57BL / 6 con C. rodentium resultados en pérdida de peso moderada y transitoria y diarrea. Aunque sucede rara con C57BL / 6 ratones, los animales pueden enfermarse y requerir la eutanasia. Por lo tanto, los ratones deben ser monitorizados para el grado de pérdida de peso y síntom...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Modelo: Estudiar Contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K vistas.  BC Children's Hospital. Citrobacter infección rodentium ofrece un valioso modelo para estudiar las infecciones bacterianas entéricas, así como respuestas inmunes del huésped y la colitis en ratones. Este protocolo describe la medición de la integridad de la barrera, la carga de patógenos y el daño histológico que permita la caracterización detallada de las contribuciones patógeno y del huésped a la colitis infecciosa murino.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modelo de cultivo primario de células Bursal de pollo Ex Vivo para estudiar la patogenesia de la enfermedad Bursal infecciosa Virus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...