Name: the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis
Uploaded: 2013-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di funzionamento a BAV dal morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC) e degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR). GB è stato finanziato da una borsa di studio laureato CIHR. BAV sono i bambini con disturbi intestinali e del fegato (BAMBINO) presidente della Fondazione di Ricerca Pediatrica IBD e il Canada Research Chair in Gastroenterologia Pediatrica.

1. Preparazione di Citrobacter rodentium inoculo e sonda gastrica di topi <ol><li> Preparare e sterilizzare in autoclave Luria Bertani brodo (LB). </li><li> Ottenere vitale C. rodentium da uno stock di glicerolo congelata e striscia sulla piastra LB agar con un&#39;ansa sterile da inoculo o punta della pipetta. Incubare a 37 ° C per una notte. Inoculare 3 ml di brodo LB sterile in una provetta di coltura falcon con colonie dalla piastra LB utilizzando una ansa o punta della pipetta. Preparazione dell&#39;inoculo deve essere fatto utilizzando tecniche asettiche. </li><li> Incubare la C. cultura rodentium aerobiosi a 37 ° C per una notte in una incubazione banco agitatore a 200 rpm. Il brodo LB inoculato dovrebbe apparire torbida dopo la coltura durante la notte. </li><li> Usare una lampadina punta dell&#39;ago gastrica gavage attaccato ad una siringa da 1 ml per gavage ciascun topo con 100 microlitri della overnight C. rodentium cultura. Delicatamente collottola il mouse, impugnando saldamente la pelle flaccida sul suo collo e schienacon il pollice e le dita. Tirare indietro la testa dell&#39;animale con il dito indice per immobilizzare la testa e raddrizzare l&#39;esofago per l&#39;inserimento dell&#39;ago gavage. </li><li> Mantenere il mouse in posizione verticale e dirigere la punta dell&#39;ago bulbo gavage lungo il lato della sua bocca e sulla sua lingua. Delicatamente passare l&#39;ago lungo il tetto della bocca e farlo avanzare l&#39;esofago. In caso di resistenza che avverte durante questa procedura, rimuovere l&#39;ago gavage e reinserirla. </li><li> Lentamente iniettare 100 ml di inoculo batterico e rimuovere delicatamente l&#39;ago gavage. Monitorare la frequenza respiratoria e il comportamento del mouse dopo il ritorno alla sua gabbia. </li></ol> Note: <ul><li> Nelle fasi 2 e 3, anche preparare una provetta di coltura falcon utilizzando tecniche asettiche con 3 ml di brodo LB sterile per essere coltivate durante la notte per assicurare che non vi è alcuna contaminazione batterica del brodo stesso. Il brodo LB dovrebbe apparire chiaro dopo coltura durante la notte. </li><li&gt; Agitare delicatamente la coltura nel tubo falcon prima di caricare siringhe per gavage modo che una dose uguale di batteri è consegnato a ciascun topo, nel passaggio 4. </li><li> Durante la notte la cultura deve essere eliminata se è stato inoculato per oltre 24 ore. </li><li> Tutti C. infezioni rodentium e abitazioni di animali infetti deve essere effettuata in un impianto di livello di biosicurezza 2. </li></ul> 2. Misurazione del colon permeabilità epiteliale Barriera in C. rodentium topi infettati <ol><li> Misurare integrità della barriera in un punto temporale desiderato post-infezione. </li><li> Il giorno del saggio, preparare abbastanza 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano dissolto in tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione di 80 mg ml -1 per gavage ciascun topo con 150 microlitri e preparare la curva standard. </li><li> Scruff il mouse e sonda gastrica con 150 ml di FITC-destrano. Estrarre il cibo dalla gabbia in questo momento. </li><li> Anestetizzare topi 4 ore dopogavaging e raccogliere il sangue il più possibile (~ 450 microlitri) tramite puntura cardiaca. Aggiungere il sangue ad una concentrazione finale del 3% acido citrato destrosio in una provetta da microcentrifuga per scoraggiare coagulazione. Eutanasia i topi e raccogliere i tessuti del colon in PBS per la conta batterica (passi 3,1-3,5) e in formalina al 10% per la fissazione dei tessuti e, infine, colorazione di immunofluorescenza (passi 4,1-4,8). </li><li> Centrifugare i campioni di sangue a 1000 xg per 12 min in una centrifuga a 4 ° C. Raccogliere il siero e diluire a 1/10 e 1/100 in PBS. Aggiungere 100 pl di ciascun campione a questi due diluizioni ad una piastra a 96 pozzetti in replicati. </li><li> Per preparare la curva standard, diluire l&#39;originale 80 mg ml -1 FITC-destrano usato per sonda gastrica i topi in PBS per le seguenti concentrazioni: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, e 0 mg / ml . Aggiungere 100 pl di ciascuna concentrazione di una piastra a 96 pozzetti in triplicato. </li><li> Quantificare la fluorescenza di ciascun campione utilizzando un fluorimetro a una eccitazione wavelength di 485 nm e 535 nm di lunghezza d&#39;onda di emissione. </li><li> Analizzare i dati grezzi tracciando la curva standard. Inserire i dati grezzi per ciascun campione nell&#39;equazione della linea generata dalla curva standard per determinare la concentrazione di FITC-destrano in ciascun campione. </li></ol> Note: <ul><li> Dal punto 4 in poi, tenere i campioni di sangue in ghiaccio e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Quando si misura l&#39;integrità della barriera epiteliale un punto di tempo, o prima, 7 giorni dopo l&#39;infezione è ottimale, in quanto gravi danni ai tessuti avviene dopo questo punto. Misurazione integrità della barriera prima che si verificano gravi danni permette di determinare le differenze massime di permeabilità durante C. infezione rodentium tra ceppi di topi. </li><li> Assicurarsi che topi di controllo non infettate sono anche testati per l&#39;integrità della barriera epiteliale. </li></ul> 3. Misura della carica batterica in tessuti di C. rodentium topi infettati <ol><li> Aggiungere 1 ml di PBS sterile unnd un metallo sterilizzato tallone ad un fondo tondo 2 tubi da centrifuga ml utilizzando una tecnica asettica. I singoli tessuti prelevati da ciascun animale sarà posto in tubi separati PBS. Pesare i tubi prima dell&#39;aggiunta del tessuto. </li><li> Rimuovere il cieco e colon dal mouse. Separare il cieco dal colon e spingere il contenuto luminale con una pinzetta. Aggiungere il contenuto in un tubo di PBS. Dopo aver separato le sezioni 0,5 centimetri dal colon distale e cieco per il 10% fissazione in formalina, aprì il colon rimanente e cieco longitudinalmente e lavare con PBS sterile prima di mettere i tessuti in tubi. </li><li> Pesare i tubi PBS con il tessuto e poi omogeneizzare i campioni utilizzando un battitore tallone per 6 min a 30 Hz. </li><li> Utilizzando tecniche asettiche, aggiungere 180 microlitri di PBS sterile per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 microlitri di ciascun campione omogeneizzato al primo pozzetto in ciascuna riga. Mescolare bene e diluire serialmente, aggiungendo 20 microlitri di ogni precedente e di ottenere diluizioni da 10 -1 (prima sill) a 10 -6. Piastra 10 microlitri di ogni diluizione di ciascun campione in triplicato su una lastra quadrata LB inferiore con una griglia. Incubare per una notte a 37 ° C. </li><li> Contare le unità formanti colonie (CFU), quindi la media dei 3 punti, e registrare la diluizione alla quale è stato contato ogni campione. Moltiplicare media di 50 CFU, come 20 pl del campione originale 1 ml è stato usato, e per il fattore di diluizione alla quale è stato contato il campione risultante in CFU / ml. Infine, dividere per il peso del tessuto per determinare CFU / g. </li></ol> 4. La valutazione istologica e colorazione immunofluorescenza dei tessuti infetti Colon <ol><li> Raccogliere tessuti come nel passo 3,2. Tessuti Conservare in formalina durante la notte, poi lavare con etanolo al 70%. Incorpora tessuti in paraffina e tagliati 5 sezioni micron per la colorazione. Colorazione con ematossilina &amp; eosina per la valutazione istologica e procedere con i seguenti passi per la colorazione di immunofluorescenza. </li><li> Per Deparaffinare tessuti prima della colorazione, posto scorre inuna vaschetta di colorazione Coplin e mettere in 65 ° C bagnomaria per 10 min. Quindi, porre i vetrini in xilene per quattro lavaggi di 2 minuti ciascuna. Vetrini devono poi essere reidratato con due lavaggi di 5 minuti in etanolo al 100%, seguiti da un lavaggio 5 min in ciascuna delle seguenti: 95% di etanolo, 75% etanolo e dH 2 0. Questi lavaggi dovrebbe essere fatto in una cappa per evitare esposizione a vapori nocivi. </li><li> Immergere i vetrini nella vaschetta Coplin con pre-riscaldato tampone sodio citrato e poi posto in un vapore per 30 minuti, poi lasciate riposare per 30 min. Questo processo spezza le proteine ​​legami incrociati formate da fissazione in formalina recuperando potenziali siti antigenici. </li><li> Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Vetrini asciutti e zona marchio intorno al tessuto con una penna PAP per creare una barriera idrofoba, mantenendo i reagenti di colorazione localizzati sul tessuto. </li><li> Tessuto blocco per 1 ora a temperatura ambiente con tampone di bloccaggio (ad esempio α-siero di capra) in una camera umida immunocolorazione. </li><li> Diluire primanticorpo ary alla concentrazione desiderata con tampone di diluizione anticorpo. Versare tampone bloccante ed aggiungere 50-100 ml di anticorpo primario e tessuti. Incubare a 4 ° C durante la notte oa temperatura ambiente per 2 h. </li><li> Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Aggiungere 50-100 microlitri di anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione anticorpo ai tessuti e incubare a temperatura ambiente per 1 h al buio. Lavare con dH 2 O per 5 minuti, per tre volte. </li><li> Disidratare diapositive, aggiungere DAPI Prolong medio oro di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti. Visualizza vetrini al microscopio a fluorescenza. </li></ol> Note: <ul><li> PBS azide può essere sostituito con PBS preparata come alternativa per evitare la crescita batterica nel mezzo di lavaggio dal punto 4 in poi. </li></ul>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per lo studio di entrambi malattie infettive e colite nei topi. Questo modello unico consente la caratterizzazione di entrambe le risposte dell&#39;ospite, come pure le proprietà di batteri patogeni. La procedura descritta in questo particolare protocollo il successo nell&#39;uso di questo modello. Ci sono diversi passaggi critici di questo protocollo da tenere a mente quando si induce la colite e l&#39;analisi delle risposte. Primo, la preparazione di un nuovo C. overnight inoculo rodentium in brodo LB è richiesto per l&#39;infezione di topi successo. Come una dose di 10 8 -10 9 organismi è necessaria per infettare maggior parte dei ceppi di topi, se l&#39;inoculo viene lasciato nel shaker o sul banco a temperatura ambiente per lunghi periodi, non ci sarà sufficiente organismi vitali rimanenti nella cultura di indurre colite momento dell&#39;infezione. E &#39;anche importante per agitare l&#39;inoculo batterico primacaricamento della siringa per infezione, per garantire che ogni topo riceve una dose uguale di batteri. Quando si raccolgono su tessuti terminus dell&#39;infezione, la completa immersione dei tessuti del colon in un ampio volume di formalina al 10% è necessario per il fissaggio del tessuto adeguata a verificarsi. Si suggerisce che i tessuti è aggiunto formalina in una fiala da 5 ml, piuttosto che in provette da microcentrifuga come un rapporto di 10:1 di fissativo al tessuto è raccomandato. La corretta fissazione è essenziale per una successiva analisi istologica, nonché colorazione per immunofluorescenza di questi tessuti. E &#39;anche importante tenere presente che ceppi knockout differenti avranno vari risposte dopo induzione di C. rodentium colite. Quando infettare un nuovo ceppo per la prima volta, i topi devono essere strettamente monitorati per determinare un umano end-point per l&#39;esperimento, se necessario. Punti di tempo per l&#39;analisi di integrità della barriera epiteliale, cariche batteriche e istologia può essere definita in base alla risposta del mouseceppo di interesse per l&#39;infezione. Come placcatura di omogenati di tessuto su piastre LB per determinare carica batterica non è un metodo del tutto selettivo, l&#39;esecuzione di una PCR C. rodentium gene specifico colonie batteriche può essere fatto per differenziare C. rodentium da bacterialcolonies altri sulla piastra. Un&#39;altra opzione è quella di omogenati di tessuto sulla piastra agar MacConkey, poiché questo mezzo è più selettivo per C. rodentium di agar LB. Un approccio alternativo è quello di utilizzare un streptomicina resistente wild-type C. ceppo instead.Substitution rodentium con un ceppo resistente streptomicina comporta l&#39;induzione della colite stesso modello descritto in questo protocollo. Il vantaggio di utilizzare il ceppo resistente streptomicina è più facile per l&#39;analisi delle cariche batteriche, come omogenati di tessuto da queste infezioni possono essere piastrate su LB agar integrato con streptomicina piuttosto che agar LB sola. Questo evita il potenziale di crescita del commmicrobi ensal sul piatto, rendendo il processo di conteggio CFU più facile e più accurata. Un&#39;altra alternativa durante la misurazione cariche batteriche, è di incubare le piastre dopo placcatura diluizioni di omogenati di tessuto su agar LB sia a 37 ° C durante la notte oa temperatura ambiente per 2-3 giorni, con conseguente rallentamento della crescita batterica, prima del conteggio. Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di colite infettiva, così come i metodi utilizzati per caratterizzare C. rodentium infezione nei topi. Oltre a utilizzare questo modello per esaminare agenti patogeni-ospiti interazioni e le risposte immunitarie, può anche essere utilizzato per studiare come una infezione batterica può aumentare il rischio di cancro al colon. Questo può essere fatto esponendo C. rodentium infettato topi al azoxymethane cancerogeno, o studiando come l&#39;impatto delle infezioni sulla proliferazione delle cellule epiteliali, o sui geni coinvolti nella differenziazione delle cellule epiteliali o lo sviluppo del tumore 15. Noizione del modello di colite infettiva descritta in questo protocollo, i numeri di batteri può essere valutata a siti extra-intestinali, come i linfonodi mesenterici, della milza e del fegato. Numeri più alti in questi organi possono indicare che il ceppo di topo in prova è altamente suscettibile all&#39;infezione. Utilizzando la tecnica di immunofluorescenza colorazione descritta, un numero virtualmente infinito di meccanismi in risposta alle infezioni possono essere esplorati. Una volta familiarità con le tecniche descritte qui, il protocollo può essere modificato per raccogliere tessuti per misurare altri punti finali, come per l&#39;estrazione dell&#39;RNA e la valutazione dei livelli di espressione genica, di caratterizzare più accuratamente risposte a C. rodentium infezione.

Infezione da batteri patogeni enterici innesca gastrointestinale (GI) infiammazione, nonché intestinale patologia e fisiopatologia, incluse diarrea e disfunzione barriera epiteliale intestinale. I meccanismi di virulenza di batteri patogeni che colonizzano il tratto gastrointestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici per difendersi contro tali infezioni sono poco conosciuti, ma recenti progressi nella modellazione di enterici infezioni batteriche hanno iniziato ad aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell&#39;intestino). La malattia di Crohn malattie infiammatorie dell&#39;intestino (CD) e UC sono malattie complesse di eziologia sconosciuta, caratterizzata da infiammazione cronica intestinale e danni ai tessuti. Molti modelli murini di infiammazione intestinale esistono, da infiammazione spontanea in ceppi geneticamente modificati, come IL10 - / - topi, alle sfide con composti chimici, come destrano solfato sodico (DSS) e dinitrobenzene solfonico (DNBS) 1. È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi presenti nei pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici 2, quindi lo studio dei modelli di colite infettiva offre anche notevoli potenzialità per definire potenzialmente patogeni ospitante . risposte a batteri enterici Citrobacter rodentium colite indotta è uno dei pochi modelli di colite infettiva che è stata ben caratterizzata 1,3, consentendo l&#39;analisi delle risposte dell&#39;ospite ai batteri enterici e ulteriore comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD; un passo essenziale per lo sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici. C. rodentium è un gram negativo fissaggio e effacing (A / E), murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla umana importantepatogeni enteropatogeno E. coli (EPEC) e enteroemorragica E. coli (EHEC) 3-8. La famiglia di una patogeni / E intimamente collegare alla membrana apicale della cellula ospite dell&#39;epitelio cecale e colon, formando un non-invasiva piedistallo struttura simile sulla cellula ospite. Sfida orale con C. rodentium di 10 8 -10 9 organismi produce un robusto modello di colite infettiva caratterizzata da iperplasia del colon o allungamento delle cripte, infiltrazione di cellule mononucleate immunitario e deplezione delle cellule calice 3,4. Il sito iniziale di colonizzazione, poche ore dopo la sfida, è la patch cieco, seguita dalla progressione verso il colon distale 2 o 3 giorni dopo l&#39;infezione 3. In ceppi di topi immunocompetenti, la clearance del patogeno viene raggiunto 3 a 4 settimane dopo l&#39;infezione 1,3,4. Tuttavia, molti ceppi geneticamente modificati, cioè gene carente o knockout (- / -) topi, sono stati trovati per visualizzare Increased suscettibilità alle infezioni con conseguenti danni esagerato e / o infezione e infiammazione cronica 9-14. L&#39;utilizzo di questo modello di colite infettiva in questi ceppi ad eliminazione diretta, molti mancano innate proteine ​​di segnalazione, è stato indispensabile nel rivelare proteine ​​ospite diverse integrali alla risoluzione di infezione intestinale e l&#39;infiammazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Luria Broth </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Aggiungere 25 g di polvere di LB 1L di acqua. Autoclave prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Fondo piatto quadrato con griglia </td><td> Pescatore </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr><tr><td> Falcon cultura tubo </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Lampadina punta dell&#39;ago gastrica gavage </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml siringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-destrano </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acido citrico </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Citrato di sodio </td><td> Pescatore </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> Pescatore </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Acido citrato destrosio </td><td></td><td></td><td> 20 mM di acido ctiric, 110 mM di citrato di sodio, 5 mM destrosio </td></tr><tr><td> Nero piastra a 96 pozzetti </td><td> Pescatore </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Perle di metallo (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina 10% </td><td> Pescatore </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> Flaconcino da 5 ml </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina </td><td> Pescatore </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Pescatore </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xilene </td><td> Pescatore </td><td&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin colorazione jar </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio citrato </td><td></td><td></td><td> Citrato di sodio 10 mM, Tween 20 0,05%, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Pap penna </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Pescatore </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio azide </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone di arresto </td><td></td><td></td><td> Siero di capra 2%, 1% BSA, 0,1% triton X-100, Tween 20 0,05%, 0,05% di sodioazide, 0,01 M PBS, pH 7.2, mix &amp; conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpo tampone di diluizione </td><td></td><td></td><td> 0,1% triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% di sodio azide, EDTA 0,04% </td></tr><tr><td> Tampone di arresto e anticorpi tampone di diluizione per tir </td><td></td><td></td><td> Ricette come sopra, ma senza aggiunta di detergenti (Triton X-100 e Tween 20) </td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro Antifade con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36.931 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Pescatore </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Agitatore da banco incubazione </td><td> Barnstead Lab Line </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorimetro </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microcentrifuga 22R</td><td></td></tr><tr><td> Piroscafo </td><td> Black &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di malattie infettive e colite, così come i metodi utilizzati per caratterizzare Citrobacter rodentium infezione nei topi. C. rodentium è un batterio gram negativo, murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla clinicamente importante enteropatogeno E. umana patogeni coli e E. enteroemorragica coli. Dopo infezione con C. rodentium, topi immunocompetenti soffrono di perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Istologicamente, allungamento cripta intestinale, infiltrazione di cellule immunitarie, e la deplezione delle cellule calice si osservano. Liquidazione di infezione è raggiunto dopo 3 o 4 settimane. Misurazione della barriera epiteliale intestinale integrità, carica batterica, e danno istologico a tempi diversi dopo l&#39;infezione, consentono la caratterizzazione dei ceppi di topi suscettibili all&#39;infezione. Il meccanismo di virulenzas con il quale batteri patogeni colonizzano il tratto intestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici che difendono contro le infezioni siano poco conosciuti. Pertanto l&#39;C. rodentium modello di infezione batterica enterica è uno strumento prezioso per aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell&#39;intestino). È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi visti in pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici. Pertanto, lo studio di modelli di colite infettiva offre un notevole potenziale per la definizione di risposta dell&#39;ospite potenzialmente patogeni per i batteri enterici. C. rodentium colite indotta da uno di questi modelli è raro che permette l&#39;analisi delle risposte di accoglienza per i batteri enterici, la nostra comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD;essenziale nello sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.

Durante un esperimento di infezione standard, i topi sono infettati con circa 2,5 x 10 8 UFC mediante sonda gastrica di 100 pl C. overnight rodentium cultura. Infezione di topi C57BL / 6 con C. rodentium risultati in perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Anche se un evento raro con C57BL / 6 topi, gli animali possono ammalarsi e richiedere euthanization. Pertanto, i topi devono essere monitorati per grado di perdita di peso e sintomi di disagio come pelliccia piloerect e postura ricurva, per determinare la misura in cui sono interessate ceppi diversi dall&#39;infezione. I risultati presentati nelle figure da 1 a 4 sono rappresentativi di un&#39;infezione fatto usando una coltura overnight preparato da uno stock di glicerolo congelata. A 7 giorni dopo l&#39;infezione, i topi sono stati anestetizzati e il sangue è stato raccolto mediante puntura cardiaca. Figura 1 mostra FITC-destrano misurata nel sierodi topi C57BL / 6, così come da Toll come topi knockout recettore 2 (TLR2), che sono stati precedentemente trovati esporre compromessa l&#39;integrità della barriera epiteliale durante l&#39;infezione 9. In presenza di un intatto barriera epiteliale intestinale, 4 kDa FITC-destrano è scarsamente permeabile attraverso questo strato. Pertanto, aumento dei livelli di FITC-destrano nel siero suggeriscono una compromissione della integrità della barriera epiteliale intestinale in corso di infezione permettendo a questa molecola a perdere tutta. Come controllo, i livelli sierici di topi infettati con gavaged FITC-destrano sono anche presentati. Di una settimana dopo l&#39;infezione, carica batterica nel colon sono stati trovati a picco intorno 10 9 UFC / g 3,4. Carica batterica può essere misurata in punti di tempo desiderato dopo infezione di confermare l&#39;infezione, nonché per valutare se i topi knockout diversi soffrono aumentato o diminuito oneri batteriche. Come C. rodentium è un patogeno che può luminale intimamente adhere a cellule epiteliali intestinali, carica batterica contenuto del lume, cieco, colon e tessuti può essere misurata. Figura 2 mostra tipici cariche batteriche misurati a 7 giorni post-infezione tessuti cecale e colon così come nel lume intestinale di C57BL / 6 topi. La maggior parte della patologia osservata durante C. rodentium infezione nei topi C57BL / 6 avviene nelle distali 2 cm di colon11. Macroscopicamente da 7 giorni post-infezione, un ispessimento della mucosa del colon e un accorciamento della lunghezza del colon si osserva, con poco danno palese visto in topi C57BL / 6. Normalmente durante l&#39;infezione, topi C57BL / 6 soffrono solo moderata infiammazione e patologia caratterizzata istologicamente da infiltrazione di cellule immunitarie, allungamento dei follicoli del colon e deplezione delle cellule goblet (Figura 3). Come si è visto nelle sezioni H &amp; E in figura 3, le risposte di accoglienza di montaggio di più duranteING infezione da C. rodentium. Per caratterizzare ulteriormente questi cambiamenti, colorazione di immunofluorescenza può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nelle proteine ​​di interesse, come ad esempio i marcatori di proliferazione, morte cellulare, o le risposte immunitarie innate e adattative. Colorazione per immunofluorescenza è prezioso anche in esame aspetti della risposta batterica, quali la sua localizzazione all&#39;interno del tessuto infetto. Un esempio di questa tecnica di colorazione, esaminando un host proteina Ki67 (rosso), un marcatore per la proliferazione cellulare e l&#39;C. rodentium proteina tir, verde, esaminare localizzazione batterica a 12 giorni post-infezione è presentato nella Figura 4. <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50222/50222fig1highres.jpg" /> Figura 1. Misurazione di siero FITC-destrano per valutare l&#39;integrità della barriera epiteliale. Topi sono statigavaged con 4 kDa FITC-destrano in condizioni non infetti e a 7 giorni dopo l&#39;infezione, in seguito alla quale siero FITC-destrano sono stati determinati i livelli. C57BL / 6 (WT) topi mostrano un trascurabile aumento FITC-destrano livelli sierici a 7 giorni post-infezione rispetto a condizioni non infetti. Al contrario, TLR2 - / - mice hanno notevolmente aumentato i livelli di FTIC-destrano nel siero rispetto al basale integrità suggerendo barriera gravemente compromessa in questo sforzo durante C. infezione rodentium, come è già stato dimostrato. <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50222/50222fig2highres.jpg"/> Figura 2. C. carico rodentium in lumen, cieco e del colon di C57BL infetti / 6 topi a 7 giorni dopo l&#39;infezione. Lumen, cieco, colon e nei tessuti sono stati raccolti, omogeneizzati, e placcato in serie-diluizione in agar LB. Ogni cIrcle rappresenta un singolo campione raccolto dai singoli animali. Le linee continue indicano la media geometrica, mentre le barre di errore verticali indicano SEM. <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50222/50222fig3highres.jpg"/> Figura 3. L&#39;analisi istologica dei danni causati da C. infezione rodentium. al 7 ° giorno post-infezione moderata infiltrazione delle cellule immunitarie, così come l&#39;allungamento delle cripte, deplezione delle cellule goblet e lieve edema si osserva rispetto al controllo del tessuto infetto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50222/50222fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50222/50222fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Colorazione di immunofluorescenza non infetto e il giorno 12 post-infezionezione tessuti di topi C57BL / 6. distale dei tessuti del colon è macchiato per la proteina Ki67 ospitante (rosso) e il C. rodentium proteina tir (verde).

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.

Il<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.4K Views.  BC Children's Hospital. Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.

Video: The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Un modello di topo per patogeni indotta infiammazione cronica a siti locali e sistemici

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Non invasiva Modello di neuropatogeno<em&gt; Escherichia coli</em&gt; L&#39;infezione neonatale nel ratto

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently host immune responses to microbial and environmental agents. Dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced colitis allows one to study the pathogenesis of IBD associated environmental triggers such as stress and diet, the effects of potential therapies, and the mechanisms underlying intestinal inflammation and mucosal injury. In this paper, we investigated the effects of dietary n-3 and n-6 fatty acids on the colonic mucosal inflammatory response to DNBS-induced colitis in rats. All rats were fed identical diets with the exception of different types of fatty acids [safflower oil (SO), canola oil (CO), or fish oil (FO)] for three&#160;weeks prior to exposure to intrarectal DNBS. Control rats given intrarectal ethanol continued gaining weight over the 5 day study, whereas, DNBS-treated rats fed lipid diets all lost weight with FO and CO fed rats demonstrating significant weight loss by 48&#160;hr and rats fed SO by 72&#160;hr. Weight gain resumed after 72&#160;hr post DNBS, and by 5 days post DNBS, the FO group had a higher body weight than SO or CO groups. Colonic sections collected 5&#160;days post DNBS-treatment showed focal ulceration, crypt destruction, goblet cell depletion, and mucosal infiltration of both acute and chronic inflammatory cells that differed in severity among diet groups. The SO fed group showed the most severe damage followed by the CO, and FO fed groups that showed the mildest degree of tissue injury. Similarly, colonic myeloperoxidase (MPO) activity, a marker of neutrophil activity was significantly higher in SO followed by CO fed rats, with FO fed rats having significantly lower MPO activity. These results demonstrate the use of DNBS-induced colitis, as outlined in this protocol, to determine the impact of diet in the pathogenesis of IBD.

DNBS/TNBS induced colitis offers an alternative and inexpensive method to study the pathobiology of inflammatory bowel disease. The protocol discussed in this paper outlines the successful application of DNBS to induce colitis in mice and rats and allows one to thoroughly study host-mediated intestinal responses.

DNBS / TNBS Colite Modelli: Fornire Insights Into malattia infiammatoria intestinale e gli effetti di grassi

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

Medicina

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and tumorigenesis. Many researchers have taken advantage of the colitis induced by Salmonella typhimurium for the studies on the early phase of inflammation and infection. However, only few reports are on the chronic infection in vivo. Mice with Salmonella persistent existence in the gastrointestinal tract allow us to explore the long-term host-bacterial interaction, signal transduction, and tumorigenesis. We have established a chronic bacterial infected mouse model with Salmonella typhimurium colonization in the mouse intestine over 6 months. To use this system, it is necessary for the researcher to learn how to prepare the bacterial culture and gavage the animals. We detail a methodology for prepare bacterial culture and gavage mice. We also show how to detect the Salmonella persistence in the gastrointestinal tract. Overall, this protocol will aid researchers using the bacterial infected mouse model to address fundamentally important biological and microbiological questions.

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Establish a chronic bacterial infected mouse model with persistent Salmonella typhimurium colonization in intestine for 27 weeks.

Cronico Salmonella Modello mouse infetti

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

Biologia

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

This protocol outlines the cefoperazone mouse model of Clostridium difficile infection (CDI) using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Emphasis on clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol.

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice

Diversion colitis (DC) is a frequent clinical condition occurring in patients with bowel segments excluded from the fecal stream as a result of a diverting enterostomy. The etiology of this disease remains ill-defined but appears to differ from that of classical inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis. Research aimed to decipher the pathophysiological mechanisms leading to the development of this disease has been severely hampered by the lack of an appropriate murine model. This protocol generates a murine model of DC that facilitates the study of the immune system's role and its interaction with the microbiome in the development of DC. In this model using C57BL/6 animals, distal parts of the colon are excluded from the fecal stream by creating a distal colostomy, triggering the development of mild to moderate inflammation in the excluded bowel segments and reproducing the hallmark lesions of human DC with a moderate systemic inflammatory response. In contrast to the rat model, a large number of genetically-modified murine models on the C57BL/6 background are available. The combination of these animals with our model allows the potential roles of individual cytokines, chemokines, or receptors of bioactive molecules (e.g., interleukin (IL)-17; IL-10, chemokine CXCL13, chemokine receptors CXCR5 and CCR7, and the sphingosine-1-phosphate receptor 4) to be assessed in the pathogenesis of DC. The availability of congenic mouse strains on the C57BL/6 background largely facilitates transfer experiments to establish the roles of distinct cell types involved in the etiology of DC. Finally, the model offers the opportunity to assess the influences of local interventions (e.g., modification of the local microbiome or local anti-inflammatory therapy) on mucosal immunity in affected and non-affected bowel segments and the on systemic immune homeostasis.

Murine distal colostomy provides a murine model for human diversion colitis, a predominantly lymphocytic colitis in colon segment excluded from the fecal stream.

Murino colostomia distale, un nuovo modello di colite di diversione in topi C57BL/6

Diversion colitis (DC) is a frequent clinical condition occurring in patients with bowel segments excluded from the fecal stream as a result of a ...

A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn&#39;s disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis. Although anti-inflammatory therapies may help control inflammation, they have no efficacy on fibrosis and stenosis in CD. The pathogenesis of CD is not well understood. Current studies focus mainly on delineating dysregulated gut immune response mechanisms. While CD-associated transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis all represent mechanical stress to the gut wall, the role of mechanical stress in CD is not well defined. To determine if mechanical stress plays an independent pathogenic role in CD, a protocol of TNBS-induced CD-like colitis model in rodents has been developed. This TNBS-induced transmural inflammation and fibrosis model resembles pathological hallmarks of CD in the colon. It is induced by intracolonic instillation of TNBS into the distal colon of adult Sprague-Dawley rats. In this model, transmural inflammation leads to stenosis at the TNBS instillation site (Site I). Mechanical distention is observed in the portion proximal to the instillation site (Site P), representing mechanical stress but not visible inflammation. Colonic portion distal to inflammation (Site D) presents neither inflammation nor mechanical stress. Distinctive changes of gene expression, immune response, fibrosis, and smooth muscle growth at different sites (P, I, and D) were observed, highlighting a profound impact of mechanical stress. Therefore, this model of CD-like colitis will help us better understand CD&#39;s pathogenic mechanisms, particularly the role of mechanical stress and mechanical stress-induced gene expression in immune dysregulation, intestinal fibrosis, and tissue remodeling in CD.

The present protocol describes the development of a Crohn's-like colitis model in rodents. Transmural inflammation leads to stenosis at the TNBS instillation site, and mechanical enlargement is observed in the segment proximal to the stenosis. These changes allow studying mechanical stress in colitis.

Il

Riepilogo

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Capitoli in questo video

4D imaging multimodale di

Un modello di topo per patogeni indotta infiammazione cronica a siti locali e sistemici

Non invasiva Modello di neuropatogeno

DNBS / TNBS Colite Modelli: Fornire Insights Into malattia infiammatoria intestinale e gli effetti di grassi

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4

Cronico Salmonella Modello mouse infetti

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

Murino colostomia distale, un nuovo modello di colite di diversione in topi C57BL/6

Un modello di roditore indotto da TNBS per studiare il ruolo patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn