חקר תכונות תעלת יונים טבעיות באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי דורש גישה לתאים שבודדו באופן חריף. פרוטוקול זה מתאר שיטות לגישה למיוציטים קרדיווסקולריים בודדים מדגי זברה בגילאים שונים. פרוטוקול זה הוא חזק, פשוט, ניתן לשחזור בקלות, ומבודד מיוציטים קרדיווסקולריים מדגי זברה במצבם הטבעי עם תפוקה וכדאיות גבוהות יחסית.
כדי להתחיל, מעבירים את הדגים לתוך צלחת פטרי גדולה מלאה חלקית בחיץ פרפוזיה ומניחים אותה תחת מיקרוסקופ מנתח. החזיקו את הדג ביד הלא דומיננטית כשצד הגחון פונה להיקף הנתיחה. עם המלקחיים העדינים ביד הדומיננטית, יש לקרוע בעדינות את שרירי החזה והסנפירים של הדג כדי לחשוף את רקמות הלב וכלי הדם כולל אטריום, חדר ובולבוס עורקי.
משכו בעדינות את הבולבוס ארטריוסוס בקצה המצטלב של הבולבוס ארטריוסוס ואבי העורקים הגחוני. הפרידו בזהירות את הבולבוס ארטריוסוס מאבי העורקים על ידי צביטה של המלקחיים, איתור קצה האטריום לענפים הוורידיים המרובים המתכנסים. לאחר מכן, מורטים את קצה האטריום מהסינוס ונוס כדי לבודד את רקמות הלב וכלי הדם משאר הגוף.
כדי לנתח קרדיומיוציטים, למרוט את האטריום ואת החדר מתוך רקמת הלב וכלי הדם. בצע קרע עדין לתוך החדר באמצעות מלקחיים עדינים כדי לנקז דם עודף, אשר ניתן להבטיח כאשר רקמת הלב הופך מאדום בוהק לצבע סלמון חיוור. איחד את האטריום והחדר המבודדים לתוך צינור צנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר המכיל חיץ זליפה.
החלף את חיץ הזלוף בצינורות עם 750 מיקרוליטר של חיץ עיכול. מניחים את הצינורות על תרמושייקר ב 37 מעלות צלזיוס ו 800 סיבובים לדקה. אפשר עיכול של הרקמות עד שהם הופכים שקופים.
סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות במיניצנטריפוגה על ספסל ב 2, 000 פעמים G במשך שלוש עד חמש שניות ולהחליף את חיץ העיכול supernatant עם 750 microliters של חיץ עצירה. החלף בעדינות את חיץ העצירה ב-500 עד 750 מיקרוליטרים של חיץ פרפוזיה וטריפ את הרקמות 30 פעמים באמצעות פיפטה פסטר מלוטשת להבה כדי לפזר את התאים. לאחר מכן, בעדינות triturate את החדרים.
לדגימה אחידה, פיפטו בעדינות את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לבצע החייאה, לפני הוספת טיפה מהם למחקרים מתאימים. מלקטים את הבולבוס הבוגר מרקמות הלב וכלי הדם ומאגדים חמישה בולבוס ארטריוסוס לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל חיץ S1. החלף את S1 ב-400 מיקרוליטרים של חיץ S2 ואפשר עיכול פפאין של עורקי הבולבוס על תרמושייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-800 סיבובים לדקה למשך 20 דקות.
אפשרו לבולבוס המעוכל חלקית להתיישב למשך דקה אחת והחליפו את הסופרנטנט S2 ב-500 מיקרוליטרים של חיץ S3 המכיל קולגן. לעכל את הרקמות על תרמושייקר ב 37 מעלות צלזיוס ו 800 סיבובים לדקה במשך שלוש עד חמש דקות. סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות במיניצנטריפוגה על הספסל ב 2, 000 פעמים G במשך שלוש עד חמש שניות, ולהחליף את S3 supernatant עם 500 microliters של S1. יש לטרפד בעדינות את הרקמות הכדוריות כדי לפזר תאי שריר חלקים של כלי הדם.
צלחת פיזרה תאי שריר חלקים של כלי הדם על גבי כיסויי זכוכית בגודל מתאים. יש לשמור את תלושי הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי שהתאים יתחברו, ולהשתמש בהם בשש השעות הקרובות. מרדימים את העוברים.
לאחר מכן, לרכז את העוברים על ידי העברתם לצינור צנטריפוגה של חמישה מיליליטר, ולאחר מכן להסיר מדיה עודפת. לשטוף את העוברים עם שלושה מיליליטר של חיץ פרפוזיה קר פעמיים, ולאחר מכן להשעות אותם בשני מיליליטר של חיץ perfusion. באמצעות מנגנון בידוד הלב העוברי, למשוך מיליליטר אחד של העוברים לתוך המחט מיד לגרש אותם בחזרה לתוך הצינור.
מעבירים את העוברים המקוטעים דרך מסננת תאים בגודל 100 מיקרומטר המונחת במשפך. אסוף את הלבבות המסוננים בצינור צנטריפוגה נוסף של חמישה מיליליטר. מערבבים היטב את התסנין ומפרידים אליקוטים של מיליליטר אחד לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה את כל הצינורות על ספסל העליון minicentrifuge במשך חמש שניות ולהשליך את supernatant. לבצע resuspension סדרתי של גלולות בצינורות באמצעות מיליליטר אחד של חיץ perfusion. פיפטה עדינה של הלבבות למעלה ולמטה פעמיים לפני הוספת טיפה למחקרים מתאימים עבור תאים שבודדו מ-bulbus arteriosus, תאי השריר החלק של כלי הדם אושרו על ידי ביטוי tagln:EGFP.
עקבות מייצגים של הקלטות של פעילות תעלת אשלגן רגישה ל- ATP מקרדיומיוציטים מבודדים מוצגים כאן. הקלטות חד-ערוציות מוצלחות התקבלו במדבקות שנכרתו מהלבבות העובריים. מיוציטים חדריים הפגינו פוטנציאלים יציבים של ממברנה היפר-קוטבית, ופוטנציאלי פעולה היו מגורה באמצעות הזרקת זרם דרך פיפטה המדבקה.
מיוציטים פרוזדורים הציגו פוטנציאל פעולה ספונטני לירות. מאפיינים פוטנציאליים של פעולה מסוכמים כאן. בעת החלפת המאגרים במהלך דיסוציאציה cardiomyocyte, יש להקפיד כי רקמות העיכול אינם מופרעים.
פיצול רקמות צריך להתבצע רק על ידי טריטורציה פיפטה. במהלך העיכול הקולגן של רקמות הבולבוס, יש לבדוק רקמות צפות, מורחבות ושקופות בכל דקה. ברגע שפיצול הרקמות נראה לעין, להפסיק את העיכול.
לאחר בידוד התאים, ניתן לשמור אותם בחיים במשך שעות ולהשתמש בהם לניתוח אלקטרופיזיולוגי באמצעות טכניקות של מהדק טלאי. זה אפשר לנו, למשל, להראות שתעלות אשלגן רגישות ל-ATP ברקמות דגי הזברה האלה זהות במהותן לאלה שביונקים.
