תודה מיוחדת קריס נגאי וג&#39;ייסון דל ריו עבור תמיכתם ועזרתם בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה על ידי RO1 מענק GM070676 כדי SPG.

זנים של זבובים ניתן לרכוש מוגבר במעבדה. בהתאם לכמות של צלוחיות תסיסנית תרבות שהתקבלו, אחד צריך לעתים קרובות &quot;להעיף&quot; את צלוחיות תרבות, פעם בקבוקונים הגיע לקיבולת המרבית. הגברה נמשך עד כ 50 בקבוקונים תסיסנית תרבות מלאים. אחד ואז עושה &quot;לעוף כוסות&quot; עם 100 מ&quot;ל המשולשת כוסות (טוס קבלת כוס נדון בסעיף הבא). לאחר 24 שעות, השתמש עוברים מן כוסות אלו זרעים חדשים צלוחיות תסיסנית תרבות עם אוכל לטוס מודבקת בתחתית. בטמפרטורת החדר, הזמן צמיחה עוברים תסיסנית מעוברים לילה זבובים בוגרים מלא כ 8.5 ימים. עוברים זרע בוקעים לאחר 12-15 שעות לשלב הזחלים 1. הזחלים לגדול במשך כ 4 ימים השרה פעמיים לשלב הזחלים 2 ו 3, ב 24 ו 48 שעות לאחר הבקיעה. הזחלים ואז לתמצת לתוך pupariums ולהגיש מטמורפוזה 4 יום עד העולה מתוך tיורש במקרים גלמי 1. לאפשר גידול נוסף של כ 2-3 ימים של צלוחיות תרבות תסיסנית כדי להגדיל את כמות הזבובים בכל אחת. כאשר 400 בקבוקונים מלאים, לא תהיה כמות מספקת של זבובים במשך חמישים כוסות ההטלה (כ -1,000 נשים זבובים לכוס). זבובים צריכים זמן להסתגל לסביבה החדשה. בדרך כלל זה לוקח בערך יומיים שהם יהיו מוכנים למסירה, לאחר העברתם את הספלים. החלפת צלחות אגר יומי ישמור את כוסות לטוס נקי, המאפשרים זבובים לחיות זמן רב יותר. (הבנה נוספת של טיפול תסיסנית ו הגברה, עיין תסיסנית DB רוברטס &quot;: גישה מעשית 2). מקור טוב להשיג כמויות גדולות של עוברים תסיסנית הם כלובים האוכלוסייה 3, אשר זמינים באופן מסחרי. הרכבה ותחזוקה של כלובי האוכלוסייה ניתן לראות על פרק 5 ו 7 בספר תסיסנית melanogaster: Pשימושים ractical בתא ו 4 לביולוגיה מולקולרית. עם זאת, כלובים האוכלוסייה יקר וקשה לשמור. מאז כלובים האוכלוסייה יכול להכיל כמות בשפע של זבובים, שימוש של פחמן דו חמצני יש צורך להעברת והאכלה זבובים. כפי שצוין קודם לכן, פחמן דו חמצני מקטין את בריאותם של הזבובים, מה שגרם להם לא לשים גם כן. בקנה מידה קטן, 100 מ&quot;ל כוסות המשולשת ניתן להשתמש. עם חמישים כוסות 100 מ&quot;ל, 9 גרם של עוברי dechorionated ניתן להשיג. על מנת להסיר את הזבובים המתים, רסק שמרים בשימוש וזיהומים אחרים יצרנו לוכד כפולה מסננת שכבות עם רשת בגדלים שונים. אחת המלכודות מסננת חומרים לא רצויים כמו זבובים מתים תוך מתן אפשרות עוברים לעבור (350 מיקרון גודל הנקבוביות). החלק השני מכיל רשת (120 מיקרון גודל הנקבוביות), שאמור לתפוס עוברים תסיסנית וזיהומים אחרים יעברו דרך הרשת. 1. טוס הכנה גביע אוסף Embryo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעיףהזבובים מוגבר של צלוחיות מרובים לתוך בקבוקון פלסטיק ריק, עד כמות הזבובים הגיעו אף שעל גובה של הבקבוקון. לאחר מכן, להעביר אותם זבובים לתוך 100 מ&quot;ל ביצה אוסף כוס (כוס tricon עם ניילון רשת חלונות). שמור הקשה על כוס על משטח קשה כדי למנוע בריחה של זבובים, כאשר העברת זבובים. מכסים עם צלחת כוס רסק אגר המכיל שמרים ולאפשר 24-48 שעות של זמן התייצבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף צלחות אגר בין לילה חמישים כוסות לטוס ולשטוף את תוכן הצלחות אל לוכד מסננת בעזרת מברשת צבע נקייה ומים זורמים. הבשר עוברים בתוך מסננת בכמות גדולה של מים עד שכל הדבק את השמרים הוא נשטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate את העוברים ניקה על ידי שיקוע שלהם אקונומיקה 50% עבור 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים מזוקקים עד בהרחבה עוברים רופפים ריח אקונומיקה. לאחר מכן לייבש את רשת עם העוברים על ידי הצבתו על פי מתח AC מגבת לקפל מרובים. להעביר את העוברים אל בקבוקון נקי לרשום את המשקל. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. העובר homogenization והבהרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עוברים dechorionated ב Dounce homogenizer עם נפח 1.5 x מאגר קר כקרח החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם 5 משיכות עם העלי רופף. Aliquot homogenate לתוך צינורות צנטריפוגות נקיים. סרכזת ב g 15,000 דקות 40. ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לאסוף את הנוזל supernatant ברורה ללא שכבת השומנים העליון לבן או גלולה נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לנקות צינורות צנטריפוגות ו סרכזת ב g 50,000 למשך 30 דקות. ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וכתוצאה מכך במהירות גבוהה supernatant אסף כפי שהוסבר לעיל ניתן להשתמש מיד או יכול להיות הצמד קפוא ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li></ol> 3. Microtubule פלמור ו kinesin עקידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר supernatant קפוא במהירות גבוהה לטמפרטורת החדר. כדי לפלמר microtubules, הוסיפו GTP (0.3 מ&quot;מ) ו - טקסול (20 מיקרומטר) להתסיס בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בשאכר מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאגד kinesin, להוסיף 2.5 מ&quot;מ nonhydrolyzable ATP אנלוגי 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate (AMPPNP), ואחריה תסיסה 10 דקות בטמפרטורת החדר שאכר מסתובב. </li></ol> 4. ההפרש שקיעה של microtubules ו kinesin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקעים באמצעות כרית סוכרוז שווה נפח (סוכרוז 20% ו -10 טקסול מיקרומטר במאגר החילוץ) על ידי צנטריפוגה ב 23,000 גרם (sw41ti הרוטור, TLS-55) למשך 30 דקות. ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף גלולה ידי resuspension ב 10% של נפח homogenate המקורי במאגר מיצוי המכיל 10 מיקרומטר טקסול ו - 75 mM NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שקיעה עם עוד כרית סוכרוז שווה בנפח כמו בשלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות גלולה מן הכביסה מלח במאגר החילוץ 5% עם 20 מיקרומטר טקסול, 75 מ&quot;מ NaCl, 10 mM MgSO 4, ו 10 mM ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקעים ב 120.000 גרם (sw41ti הרוטור: 31,000 סל&quot;ד, TLS-55: 42,000 סל&quot;ד) במשך 20 דקות ב 4 ° C. איסוף supernatant (kinesin<html> חלק קטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו סינון צנטריפוגלי ב g 14,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. שחזור מדגם מרוכז לחזור סינון עם מסנן חדש לעיל במשך 30 דקות לאסוף את המדגם מרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay החלבון כדי לקבוע את הריכוז. בקצרה, בריכוזים שונים של חלבון ידוע (שור סרום אלבומין, BSA) היה מעורב עם נפח ידוע של ריאגנט ברדפורד ומדד צפיפות אופטית באורך גל 595nm. אז צפיפות אופטית לעומת תקן עקומת הריכוז הוקמה על מנת לחשב את ריכוז לא ידוע של מטוהרים חלק kinesin באמצעות צפיפות אופטית של מדגם זה נמדד בתנאים דומים לזה של דגימות BSA סטנדרטיים. ג&#39;ל אלקטרופורזה, כמו גם המערבי סופג בוצעה גם באמצעות כמות ידועה של kinesin מטוהרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Kinesin aliquot חלק לתוך בנפחים קטנים של הריכוז הרצוי הקפאה בחנקן נוזלי הצמד לאחסן ב -80 ° C. </li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. נציג תוצאות באורך מלא kinesin תפקודית טוהרו מעוברים תסיסנית. איור 1 מתאר את הג&#39;ל צבעונית כסף מראה את שברים שונים במהלך טיהור. ליין 1 דוגמה של supernatant מהירות גבוהה לאחר בירור (שלב 2.5), מסלול 2 הוא דוגמה של גלולה לאחר בירור, ליין 3 דוגמה של supernatant אחרי שקיעה 1 עם כרית סוכרוז (שלב 4.1), ליין 4 דוגמה של גלולה אחרי שקיעה הראשונה, מסלול 5 הוא מדגם של supernatant אחרי שקיעה 2 (שלב 4.3), ליין 6 הוא דוגמה של גלולה אחרי שקיעה 2, ליין 7 דוגמה של גלולה של שקיעה הסופי (שלב 4.5), ליין 8 הוא מדגם kinesin מטוהרים, ליין 9 הוא מדגם kinesin מסונן מסלול 10 הוא הסמן. הלהקה מרוכז במסלול 8 ו - 9 בסביבות 115 KD הוא kinesin כבד שרשרת 1, אשר עולה בקנה אחד עם Figurה 1, ליין 8 של העיתון סקסטון שפורסם בשנת 1988 5. תרשים 2 מייצג את כתם המערבי ג של חלק מטוהרים kinesin לאתר באמצעות נוגדנים kinesin שרשרת כבדה. נוגדנים AKINO1, לא באופן משמעותי צולבות להגיב עם בני משפחה אחרים kinesin 6. שים לב, אם כי פרוטוקול התוצאה היא מקור טוב של kinesin תפקודית, בעוד חלק קטן מועשר על kinesin-1, ישנם מזהמים סביר, כולל פוטנציאל kinesins אחרים וחלבונים מוטוריים אחרים. הוצאנו מגוון של מזהמים קטנים יותר של סינון. ככל הסרת מנועים אחרים אשר לא יכול להיעשות על ידי גודל לבד, טיהור דומה למה שנעשה על ידי אחרים ללמוד kinesin 7, ואנו מאמינים כי הרוב המכריע של המנוע הפעיל kinesin-1, אבל טיהור משוכלל יותר שיאפשר סילוק מזהמים רכב פוטנציאליים, כמו שנעשה על ידי קול ואח&#39; 8 ו סקסטון et al. 9 </p&gt; Processivity של kinesin הוערך על ידי ב assay חוץ גופית microtubule מולקולה אחת מחייבת, כפי שמתואר בספרו של Scholey תחת הכותרת &quot;Assay תנועתיות עבור מוטורי חלבונים&quot; 10 ביתר פירוט. בקצרה, חרוזי פוליסטירן עם מנוע פעיל אחד הובאו במגע עם microtubule, בנוכחות להרוות (1 מ&quot;מ) ה-ATP. המנוע מחובר microtubule, והחל מתרחק ממרכז המלכודת לייזר. על עקירה מוגדרים מראש של חרוז ממרכז המלכודת (100 ננומטר) כוח קרן לייזר הפך באופן אוטומטי, מה שמאפשר המנוע ללכת יחד MT תחת עומס. הסרט מראה בקוטר 500 ננומטר חרוז עם kinesin אחד הולך בדרך MT. אורכו של המסך וידאו מתאים ל -20 מיקרומטר. איור 3 מייצג את התפלגות מדודה של לרוץ אורכי יחיד באורך מלא מולקולות תסיסנית kinesin, מטוהרים לפי הפרוטוקול המובא כאן. Exponentiאל לנכון ההפצה מספקת runlength הממוצע של kinesin אחת 1.55 ± 0.1 מיקרומטר ו 1.28 ± 0.12 מיקרומטר למדגם מסונן בלי פילטר בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 ג&#39;ל כסף מוכתם של שברים מטוהרים: מדגמים של חלק זה נוהלו ג&#39;ל 10%. 10 מיקרוגרם של חלבון נטען בנתיב זה. ליין 1 דוגמה של supernatant מהירות גבוהה לאחר בירור (שלב 2.5), מסלול 2 הוא דוגמה של גלולה לאחר בירור, ליין 3 דוגמה של supernatant אחרי שקיעה 1 עם כרית סוכרוז (שלב 4.1), ליין 4 דוגמה של גלולה אחרי שקיעה הראשונה, מסלול 5 הוא מדגם של supernatant אחרי שקיעה 2 (שלב 4.3), ליין 6 הוא דוגמה של גלולה אחרי שקיעה 2, ליין 7 דוגמה של גלולה של שקיעה הסופי (שלב 4.5), ליין 8 הוא kinesin מטוהריםלדוגמה, ליין 9 הוא kinesin מסוננים באמצעות 100 KD חתוכים Amicon אולטרה 0.5 מ&quot;ל מסנן צנטריפוגלי (Millipore, ארה&quot;ב). החיצים הכחולים מציינים את החלבונים אשר היו כמויות ירד חץ אדום עולה ריכוז kinesin בשל צעד סינון צנטריפוגלי שימוש בפרוטוקול זה. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="איור 2" /> . איור 2 חלק מטוהרים KHC מחק נוגדנים נגד אנטי kinesin: מדגם מטוהרים kinesin היה נתון אלקטרופורזה בג&#39;ל מחק (בקרום nitrocellulose) נגד הנוגדן העיקרי AKINO1-(1:1,000 ב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר ואחריו הדגירה ב חמור נגד ארנב נוגדנים (1:10,000 ב TBST) במשך שעה בטמפרטורת החדר. ערכת (chemiluminescent) ECL שימש לזהות את האות kinesin המוצג לעיל. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. </strong&gt; Runlength ומהירות של kinesin תסיסנית אחד באורך מלא: (א) ו - (ב) Runlength ומהירות מדגם kinesin מסוננים. (ג) ו - (ד) Runlength ומהירות מדגם kinesin בלי פילטר. איור 4. וידאו של תנועתיות kinesin. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג וידאו</a> .

<ol>
	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

המוח שור הוא חומר המוצא הנפוצה ביותר 11 לטהר באורך מלא kinesin, אם כי המוח Murine נעשה שימוש גם 12. החיסרון הגדול של שימוש במוח שור כמקור kinesin הוא הזמינות של חומר המוצא טרי: מטבחיים בדרך כלל נגיש, והמוח חייבים להיות טריים מאוד כדי להשיג kinesin פעיל. יתר על כן, רק במוחם של...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב או חומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אגר (מגורען) </td><td> דיג </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> דקסטרוז (D-גלוקוז) נטול מים </td><td> דיג </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי </td><td> בקטון </td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mm סגנון (פוליאסטר) 20/bag </td></tr><tr><td> תסיסנית תרבות בקבוקוני פלסטיק </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> המשולשת הגביע </td><td> Econo מעבדה בע&quot;מ </td><td> B700-100 </td><td> נפח: 100 מ&quot;ל, גודל: 58x72mm </td></tr><tr><td> שמרים </td><td> הכוכב האדום </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> ניילון Mesh </td><td> Genesse מדעי </td><td> 57-102 </td><td> 120 מ &#39;icron גודל הנקבוביות </td></tr><tr><td> ניילון Mesh </td><td> חלקים קטנים </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> פייפס </td><td> סיגמא </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> פייפס </td><td> סיגמא </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> דיג </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> סיגמא </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (נטול מים) </td><td> דיג </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> סיגמא </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> סיגמא </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotonin </td><td> סיגמא </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> אלפני </td><td> סיגמא </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> סיגמא </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> טקסול </td><td> סיגמא </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP אנלוגי 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate </td><td> סיגמא </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ה-ATP </td><td> סיגמא </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon אולטרה מסננים צנטריפוגליות: 0.5 מ&quot;ל, 100kD מנותקים, 8 לארוז </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

חלבונים רכב להעביר מטענים לאורך microtubules, ולהעביר להם תת הסלולר מיקומים ספציפיים. בגלל התחבורה שינה הוא הציע ביסוד מגוון רחב של מחלות ניווניות, הבנה המבוססת microtubule התחבורה המוטורית ורגולציה שלה סביר להניח בסופו של דבר להוביל גישות טיפוליות משופרים. Kinesin-1 הוא חלבון המנוע אוקריוטים הנעה בכיוון האנטרוגרד (בתוספת סוף) יחד microtubules (MTS), מופעל על ידי הידרוליזה של ATP. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט טיהור לבודד אורך פעיל kinesin מלא מעוברים תסיסנית, על מנת לאפשר שילוב של גנטיקה תסיסנית עם מחקרים biophysical מולקולה בודדת. החל עם כ 50 כוסות הנחת, עם כ 1000 נקבות בכל כוס, ביצענו אוספים לילה. זה סיפק כ 10 מ&quot;ל של עוברים ארז. העוברים היו אקונומיקה dechorionated (מניב כ 9 גרם של עוברי), לאחר מכן, ומעורים. AFהפרעה ter, homogenate הובהר באמצעות ספין במהירות נמוכה ולאחריה צנטריפוגה במהירות גבוהה. Supernatant הבהיר טופל GTP ו טקסול כדי לפלמר MTS. Kinesin היה משותק על polymerized MTS על ידי הוספת אנלוגי ATP, 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate בטמפרטורת החדר. לאחר kinesin מחייב, microtubules היו משקעים באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה דרך כרית סוכרוז. גלולה microtubule היה מחדש על תנאי, וזה תהליך חזר על עצמו. לבסוף, ה-ATP נוסף כדי לשחרר את kinesin מ MTS. צנטריפוגה במהירות גבוהה ולאחר מכן סובב את MTS, עוזב את kinesin ב supernatant. זה kinesin היה נתון סינון צנטריפוגלי באמצעות קיצוץ 100 KD את המסנן לטיהור נוסף, aliquoted, הצמד קפואים בחנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -80 ° C. SDS אלקטרופורזה בג&#39;ל המערבי סופג בוצעה באמצעות מדגם מטוהרים. פעילות מוטורית של דגימות מטוהרים לפני ואחרי שלב הסינון הסופי צנטריפוגליהוערך תוך שימוש ב assay במבחנה מולקולה בודדת microtubule. את השברים kinesin לפני ואחרי סינון צנטריפוגלי הראה processivity כפי שדווח קודם לכן בספרות. ניסויים נוספים נערכים על מנת להעריך את האינטראקציה בין kinesin וחלבונים תחבורה אחרים בנושא.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos at JoVE.com

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

זהו פרוטוקול לבודד אורך פעיל kinesin מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים על מולקולה בודדת מחקרים biophysical. אנחנו מראים איך לאסוף עוברי, להפיק את lysate העובר ולאחר מכן לפלמר microtubules (MTS). Kinesin מטוהרים על ידי משתק אותו על MTS, מסתובב כלפי מטה את kinesin-MT מתחמי ולאחר מכן משחררים kinesin מ MTS באמצעות תוספת ATP.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

isolation-and-purification-of-kinesin-from-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K Views.  University of California, Irvine. זהו פרוטוקול לבודד אורך פעיל kinesin מלא תסיסנית עוברים על מולקולה בודדת מחקרים biophysical. אנחנו מראים איך לאסוף עוברי, להפיק את lysate העובר ולאחר מכן לפלמר microtubules (MTS). Kinesin מטוהרים על ידי משתק אותו על MTS, מסתובב כלפי מטה את kinesin-MT מתחמי ולאחר מכן משחררים kinesin מ MTS באמ...

Video: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a &quot;Humanized&quot; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...