עבודה זו מומנה על ידי מענקים לLKM-K מהמוסד הלאומי לבריאות / מכון הלאומי לסרטן (R01CA129822 וR01CA140995). ד&quot;ר מדינה-Kauwe מודה ג ריי, מ &#39;M-Kauwe וד Revetto להמשך תמיכה.

1. משלוח מערכתי בvivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מספיק HerDox עם תמיסת מלח סטרילית להשוות 0.2 מ&quot;ל של מינון מ&quot;ג / ק&quot;ג 0.004 של HerDox לכל זריקה למשך 6-8 גידולים בשבוע ישנים נו / נו עכברי נושאים הבילטראליים תת עורי כנף עוקץ xenograft. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר בעדינות את תערובת HerDox לתוך מזרק אינסולין 3/10 סמ&quot;ק המצויד במחט 29G, הימנעות בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה היא מושרה על ידי חשיפת isoflurane קצרה בחדר אינדוקציה מצויד בהדחת מערכת גז (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את התערובת כולה לוריד הזנב של עכבר הרדים (0.2 מ&quot;ל להזרקה). הזרקת IV יכולה גם להתבצע בעכבר מאופק, ללא הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על זריקות באותו העכבר במשך שישה ימים רצופים נוספים, פעם ביום. </li></ol> 2. דימות פלואורסצנטי בvivo ההצטברות של HerDox הקרינה בגידולים יכוליםלהתגלות על ידי ביום האחרון של זריקה (יום 7) באמצעות imager multimode. ההליכים המפורטים להלן כרוכים בשימוש במערכת המאקרו תאורה וזיהוי מותאמת אישית (איור 1) 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Multimode בImager האופטי vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פליטת bandpass מסנן (590 ננומטר ± 30 ננומטר) מתאימה לגילוי הקרינה דוקסורוביצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת ההרדמה ולאחר מכן למקם את עכבר לתוך תא ההרדמה (ספיקות חמצן:, ריכוז 0.5-1 ליטר / דקה isoflurane: 3-4% (או נמוך) מצוידות במערכת הדחה גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר מחדר ההרדמה לחדר ההדמיה של Multimode בImager האופטי vivo כאשר העכבר הוא מורדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח nosecone מעל האף של העכבר ולפתוח את הזרימה לנהל anesthe הרציףSIA במהלך רכישת תמונה (שיעורי זרימת חמצן: 0.5-1 ליטר / דקה, ריכוז isoflurane: 2-3% (או נמוכים יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות הקרינה באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד. </li></ol> 3. דימות פלואורסצנטי Ex vivo ניתן הדמיה HerDox הקרינה בגידולים ואיברים ספציפיים (כולל כבד, כליות, טחול, לב, ושרירי שלד) נבצרו מעכברים מורדמים ב24 שעות לאחר ההזרקה (יום 7) הסופית של HerDox. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל Multimode בImager האופטי vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פליטת bandpass מסנן (580 ננומטר ± 20 ננומטר) לגילוי הקרינה דוקסורוביצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ריתוך ארגון קריפטון לייזר ולמקם את מסנן bandpass עירור (488 ננומטר ± 10 ננומטר) בנתיב האופטי לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולי מקום ואיברים ספציפיים מסודרים על צלחת פטרי להדמיה הקאמרית OF Multimode בImager האופטי vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות הקרינה של רקמות באמצעות זמן חשיפה של 5-15 שניות. דוגמה לרכישת תמונת הקרינה ראשונית שמוצגת באיור 2 א. חזור על אותו באמצעות צלחת פטרי ריקה, שישמש כרקע (איור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח ועיבוד תמונה כולל תיקון רקע או התאמת ניגוד. דוגמה לתמונה תיקן מוצגת באיור 2 ג, וכתוצאה מחיסור של איור 2b מהאיור 2a. </li></ol> 4. בConfocal ההדמיה באתרו של גידולים בהדמית confocal אתר מאפשר זיהוי וניתוח של הצטברות גידול HerDox ברמה התאית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ לייקה confocal SPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אור לייזר ננומטר 488 לעירור של אורכי גל דוקסורוביצין ופליטה (560-620 ננומטר) לדוקסורוביציןגילוי הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אובייקטיבי 40X או 63X וטיפת שמן טבילה בעדשה האובייקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ גידולים טריים מעכברים שקיבלו בעבר מורדמים טיפולי HerDox ומדומים, כמתואר בהליך 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולים מניחים על צלחת פטרי על קרח, כדי למנוע השפלה רקמות, ולאחר מכן להעביר את הגידולים לתא דלתא T להדמית confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות confocal של גידולים בעומקי מוקדים רציפים (גודל צעד: 1 מיקרומטר, עובי: 20 מיקרומטר). דוגמה של רצף תמונות-נרכשו לאורך ציר Z-מוצגת באיור 3, פנל שמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע העצמה מקסימלית Z-הקרנה של תמונות. הקרנת העצמה המרבית של Z-מוערם תמונות מוצגת באיור 3, פנל ימני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מתכוון עוצמות הקרינה של העצמה מקסימלית Z - הקרנת תמונות. ממוצעת עוצמות הקרינה של תמונות מעל השדה הכללי של תצוגה היו לחשבד באמצעות ImageJ. </li></ol> 5. דימות ספקטרלי רציומטרי וניתוח הדמיה רפאים רציומטרי וניתוח מאפשר אפליה בין Dox הקרינה וautofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח בסריקת לייזר מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרכוש 15 תמונות של גידולי HerDox שטופלו ומטופל בעומק שצוין בטווח של 510-650 הרפאים ננומטר, עם גודל צעד של 10 ננומטר, ועירור ב 488 ננומטר אור באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מיקרומטר 100 של דוקסורוביצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה רפאים של פתרון דוקסורוביצין מיקרומטר 100 כדי להשיג את החתימה הספקטרלית הטהורה של Dox הקרינה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר). תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את החתימה הספקטרלית autofluorescence מג תמונהאופה (טווח ספקטרום: 510-650 ננומטר, גודל צעד: 10 ננומטר) שהושגה על ידי הדמיה רפאים של גידולים שלא טופלו. תוצאות אופייניות של רכישת תמונה מהדמית רפאים וכתוצאה מספקטרום הקרינה זממו כמו גרף מוצגים באיור 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר ארבע חתימות רפאים התייחסות (autofluorescence הטהור, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescence, 0.2. דוקסורוביצין 0.8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescence) באמצעות התכנית שפיתחנו 9. עקומה טיפוסית מראה ארבע חתימות רפאים התייחסות מוצגת באיור 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סיווג ספקטרלי של תמונות כפי שהוגדר על ידי החתימה ספקטראלית התייחסות דרך למדוד מרחק אוקלידי באמצעות התכנית שפיתחנו בעבר 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע unmixing רפאים ליניארית של דימויים אלה באמצעות תכנית רפאים unmixing (Plug-in בImageJ) פיתחנו 7, 10, לשם השוואה להדמית הרפאים ratiometric והניתוח. דוארxample של הפרדת הקרינה HerDox מautofluorescence ידי unmixing הרפאים יניארי מוצג באיור 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles.">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li><li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole.">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li><li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins.">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li><li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins.">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li><li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3PO,+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins.">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li><li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein:+implications+for+gene+transfer.">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li><li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles.">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463 (2012).</li><li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo:+Technology+Development,+Multiscale+Imaging,+and+Chemotherapy+Assessment.">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li><li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo.">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007 (2011).</li><li>Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomedical Optical Imaging. , (2009).</li><li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimode+optical+imaging+of+small+animals:+development+and+applications.">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li><li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+unmixing:+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo.">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418 (2009).</li><li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy.">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li></ol>

המחבר, דניאל פרקש, הוא יו&quot;ר של הדמיה מולקולרית ספקטרלי. יש החוקרים שנותרו ללא אינטרסים מתחרים.

DOX הקרינה ניתן להבחין בvivo באמצעות imager multimode כאשר גידולים תת עורית. עם זאת, המינון טיפולי היעיל של HerDox (0.004 מ&quot;ג / ק&quot;ג) הוא מתחת לסף הגילוי לאחר מנה אחת. לעומת זאת, לאחר 7 זריקות יומיות (1x/day למשך 7 ימים), הצטברות הגידול והשימור של החלקיקים מספיק כדי לאפשר הדמיה של הקר?...

גידול במיקוד של כימותרפיה יש את הפוטנציאל לחסל את התאים סרטניים במינון נמוך יותר בהשוואה לתרופות לא ממוקדות, כי יותר מהטיפול יכול לצבור נמסר ליעד, ולא להפיץ לרקמה שאינה סרטנית. ככל שהמצב זה האחרון הייתי לדלל את היעילות של התרופה ולכן דורש מינונים גבוהים יותר כדי להיות יעילים, מיקוד גידול יש שני יתרונות טיפוליים ובטיחות מעל טיפול שאינו ממוקד סטנדרטי. מיקוד כימותרפיה ידי אנקפסולציה בחלקיקים עצמי התאספו מאפשר התרופה להישאר ללא שינוי כימי בניגוד לתרופות שמקושרות קוולנטית למולקולות מיקוד. כהצמדה כזו יש הפוטנציאל לשנות את הפעילות של שניהם בסמים ומיקוד המולקולה; הרכבה שאינה קוולנטיים מאפשרת עוצמה תרופה להישמר. הראינו בעבר שהרומן של שלוש מרכיב, מורכב עצמי התאספו, HerDox, מטרות HER2 + גידולים <em&gt; In vivo ומעורר אבלציה גידול בצמיחה תוך חוסך רקמה נורמלית, כולל הלב 1. HerDox נוצר דרך אינטראקציות שאינן קוולנטיים בין חלבון קולט מחייב תא החדירה, HerPBK10, והסוכן כימותרפיות, דוקסורוביצין (DOX), באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. HerPBK10 נקשר לקולטן גורם האנושי צמיחת אפידרמיס (שלה) ומעורר אנדוציטוזה קולטן בתיווך 2-4, תוך חדירת קרום endosomal נעשה באמצעות שילוב של אדנווירוס-נגזר פנטון בסיס חלבון capsid 4-6. תחום טעון חיובי בחלבון מאפשר לחומצת גרעין 4 מחייב, 5, שדרכו Dox-DNA intercalated יכול להיות מועבר למשלוח ממוקד. Electrophilic, עיבור, ואולי אינטראקציות oligomerization חלבון להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים כי הם יציבים בדם ומתחת לאחסון ממושך בטמפרטורות שונות 1. העדפת מיקוד אליה2 + תאים סרטניים הוא הקל על ידי זיקת יגנד המשופרת כאשר HER2 הוא גבוה. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי המשלוח מערכתי של הצטברות מועדפת HerDox תשואות בגידולים מעל הרקמה שאינה סרטנית ולא ממוקדים, בהשוואה ל1 Dox, וחדירה לתאי גידול in vivo 7. יש לנו ציינו שמשחרר HerDox Dox לאחר כניסת תא גידול, ומאפשר הצטברות Dox לתוך הגרעין 1. גידולים הצטברות מופיעה לתאם עם רמת הקולטן, כמו גידולים המבטאים-HER2 נמוכים יחסית לצבור פחות HerDox בהשוואה לאלו עם רמות גבוהות יותר יחסית 1 HER2. יתר על כן, ריכוז המוות של התאים היעיל מציג מתאם הפוך עם HER2 תצוגה בשורות תאים סרטניים המבטאות תא שטח שונה HER2 רמות 1. HerDox מפגין יתרון טיפולי ובטיחות מעל Dox לא ממוקד, לא כהריגת גידול מתרחשת במינון מעל 10 פעמים נמוכות יותר בהשוואה לuntarסמים וgeted מניב שום השפעה לרעה על גילוי לב (אקו וזוהה על ידי כתם היסטולוגית) או כבד (זוהה על ידי Tunel כתם) רקמה, בניגוד לDox לא ממוקד 1. למרות גזירתו מחלבון הקופסית נגיפית, HerPBK10 מפגין שום immunogenicity להבחין ברמות טיפוליות 2. ואילו נוגדנים קיימים מראש לכל אדנווירוס יכולים לזהות HerPBK10, הם לא הצליחו למנוע תא מחייב 2. נפח גידול נמדד לאורך הזמן הוא שיטה סטנדרטית של הערכת יעילות טיפולית של תרופות ממוקדות, וכבר מועסק להערכת היעילות הטיפולית של HerDox. להשלים עם גישה זו in vivo ההדמיה עוצמת הקרינה vivo לשעבר אפשר לנו להעריך טוב יותר את יעילות מיקוד 7. יש לנו משולב באופן ספציפי בתחום ההדמיה confocal באתרו של גידולים ניכרים עם ניתוח ספקטרלי של Dox הקרינה כדי לוודא שאין HerDoxלא נצבר רק בגידולי in vivo אבל חדרו לתוך תאים סרטניים וDOX מועבר לתוך הציטופלסמה לבין הגרעין 7. ניתוח ספקטרלי כמו כן אפשר לנו להבחין בין הקרינה Dox מautofluorescence 7. כאן אנו מדגימים בפירוט רב יותר את הגישה שלנו להערכת HerDox in vivo לאחר משלוח מערכתי, והכי חשוב, להערכת מיקוד באמצעות שיטות הדמיה multimode וניתוחים.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</th
 ></tr>
 <tr>
 <td >Fluorescence laser scanning confocal microscope</td>
 <td >Leica</td>
 <td >SPE</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In Vivo Optical Imager</td>
 <td>Spectral Molecular Imaging</td>
 <td>Multimode In Vivo Optical Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Doxorubicin-HCl</td>
 <td >Sigma-Aldrich</td>
 <td >D4035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Nude (NU/NU) mouse, female, 6-8 week</td>
 <td >Charles River</td>
 <td >Strain code 088</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >MDA-MB-435 human HER2+ tumor cells</td>
 <td >NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository</td>
 <td >0507292</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >3/10 cc insulin syringe U-100 with 29G x 1/2" Ultra-FineIV permanently attached needle</td>
 <td >BD</td>
 <td >309301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Delta T chamber </td>
 <td >Bioptechs </td>
 <td >04200417B</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

analysis of targeted viral protein nanoparticles delivered to her2+ tumors

Nanoparticle HER2 + גידול הממוקד, HerDox, מציג הצטברות גידול מועדפת ואבלציה גידול בצמיחה במודל חיה של סרטן HER2 +. HerDox נוצר על ידי הרכבה עצמית שאינם קוולנטיים של חלבון חדירת תאי גידול ממוקד עם סוכן כימותרפיה, דוקסורוביצין, באמצעות מקשר חומצות גרעין קטן. שילוב של electrophilic, עיבור, ואינטראקציות oligomerization להקל על הרכבה עצמית לחלקיקי ננומטר 10-20 עגולים. HerDox מציג יציבות בדם, כמו גם באחסון ממושך בטמפרטורות שונות. משלוח מערכתי של HerDox בתוצאות נושאות גידולים בעכברים במוות תאי גידול ללא תופעות לוואי לגילוי לרקמה שאינה סרטנית, כוללים לב והכבד (שעובר נזק מסומן על ידי דוקסורוביצין לא ממוקד). HER2 גובה מאפשר מיקוד לתאים המבטא את הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס האנושי, ומכאן גידולים HER2 רמות גבוהות מוצגות תערוכת הצטברות גדולה יותר של HerDox לעומת ביטויי תאיםלשיר רמות נמוכות יותר, הן במבחנה ובחי. הדמיה עוצמת הקרינה בשילוב עם ניתוח ספקטרלי confocal ואתרו אפשרה לנו לאמת בגידול vivo מיקוד וחדירה של תאי גידול של HerDox לאחר משלוח מערכתי. כאן אנו פירוט השיטות להערכתנו גידול מיקוד באמצעות ההדמיה multimode לאחר משלוח מערכתי.

איור 1 מציג את אב טיפוס בimager האופטי vivo, שנבנה לצורך רכישת תמונה תחת שיטות מרובות, כולל עוצמת הקרינה, רפאים, כל החיים, confocal 2 פוטונים, התוך חיוני, והדמיה פליטת אור. בנוסף, המצלמה מקוררת גבוהה רגישה וקווי לייזר בהספק גבוהים שולבו במערכת זו תשואות גבוהות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors at JoVE.com

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

מאמר זה מפרט את הנהלים לניתוח הדמיה אופטי של nanoparticle גידול הממוקד, HerDox. בפרט, שימוש מפורט של מכשיר ההדמיה multimode לאיתור גידול מיקוד והערכת חדירת גידול מתואר כאן.

ניתוח של חלבון נגיפי ממוקד חלקיקים מובא לHER2 + גידולים

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

analysis-targeted-viral-protein-nanoparticles-delivered-to-her2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K Views.  University of Southern California. מאמר זה מפרט את הנהלים לניתוח הדמיה אופטי של nanoparticle גידול הממוקד, HerDox. בפרט, שימוש מפורט של מכשיר ההדמיה multimode לאיתור גידול מיקוד והערכת חדירת גידול מתואר כאן.

Video: Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

מבוא טכניקת ממוקד אולטראסאונד הרס microbubble

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

חלבון קינאז C-דלתא מעכב פפטיד ניסוח באמצעות חלקיקי זהב

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...