פרוטוקול זה מאפשר לבודד בהצלחה ותרבות סרטן ראשוני הקשורים פיברובלסטים מסרטן השד מורין, כדי לסנן חלקיקים חדשניים שנועדו למקד את הסביבה מיקרו הגידול. CAF ראשוני מייצג את המודל האמין והפיזיולוגי ביותר למחקרי במבחנה של סטרומה הגידול. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד להשיג תשואה אופטימלית.
כדי להתחיל, להכין תערובת עיכול עבור ניתוק הגידול, ולהשרות את רסיסי הגידול שלושה עד חמישה מילימטר בתמיסה לאחר סגירת הצינור בחוזקה. הפוך את הצינור, בודק שכל חתיכות הגידול נמצאות בתחתית הצינור לכיוון הכובע. לאחר מכן חברו את הצינור לדיסוציאר מכני בדיור הנכון, והפעילו תוכנית דיסוציאציה שתוכננה במיוחד לגידולים קשים.
לאחר הריצה, לנתק את הצינור, ומניחים אותו הפוך כדי לדגור על המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות עם רועד עדין. לאחר מכן לחבר מחדש את הצינור לדיסוציאר בדיור הנכון, ולהפעיל את תוכנית הניתוק עבור גידולים קשים פעמיים, להבטיח לא חתיכות רקמות גדולות להישאר בסוף ההליך. סנן את הדגימה באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרון בצינור 50 מיליליטר.
לאחר מכן לשטוף את המסנן עם 10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, resuspened הכדור במאגר PBE, המורכב PBS, 0.5% BSA, ושני EDTA מילימטרי, ולספור את התאים עם טריפאן כחול. תקן את מאגר כריכת הסרת התא המת על-ידי דילול תמיסה של מאגר חיץ מחייב 20X במים סטריליים מזוקקים כפולים.
לשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של חוצץ מחייב 1X וצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה התא עם 0.1 מיליליטר של חיידקים להסרת תאים מתים עבור עד 10 עד התאים השביעי, ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. במהלך הדגירה, הכינו מעמד מגנטי מתחת למכסה המנוע, ותלו עליו עמודי הפרדה פרומגנטיים, כשהקצוות מצביעים כלפי מטה.
ישילב את העמודים עם 0.5 מיליליטר של חוצץ כריכה קרה, ולחכות עד הפתרון זרם דרך. לאחר הדגירה, להוסיף 400 microliters של חוצץ כריכה קר חרוזים השעיית התא. לטעון את כל הנפח על העמוד ולאסוף את השפכים בצינור 15 מיליליטר.
לשטוף את העמודה ארבע פעמים עם 0.5 מיליליטר של חוצץ כריכה קרה, ולאסוף את השפכים הכולל באותו צינור. עבור דלדול של פיברובלסטים שאינם קשורים לסרטן, לסנן את השעיית התא באמצעות מסננת תאים 70 מיקרון לח עם PBS, וצנטריפוגה התאים. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 80 microliters של חוצץ PBE קר.
הוסיפו 20 מיקרוליטרים של קוקטייל דלדול פיברובלסט שאינו קשור לגידול. מערבבים היטב, ודגרים את המדגם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בחושך. במהלך הדגירה עם חרוזים, להכין עמודי דלדול פרומגנטיים על מעמד מגנטי.
ישיאב את העמודים עם שני מיליליטר של חוצץ PBE קר ולחכות עד הפתרון זרם דרך. לאחר הדגירה, להוסיף 400 microliters של חוצץ חרוזים השעיית התא. לטעון את כל הנפח על העמוד ולאסוף את השפכים בצינור 15 מיליליטר.
לשטוף את הטור פעמיים עם שני מיליליטר של PBE. אסוף את השפכים הכוללים לאותה שפופרת, וצנטריפוגה של השפכים. עבור הבחירה החיובית של פיברובלסטים הקשורים לסרטן, resuspend הכדור ב 80 microliters של חוצץ PBE קר.
ואז ב-20 מיקרוליטרים של חיידקי פיברובלסטים הקשורים לגידול, ודגרת הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך. במהלך הדגירה, להכין עמודות הפרדה פרומגנטית על מעמד מגנטי ולתוות אותם עם 0.5 מיליליטר של חוצץ PBE קר. לאחר הדגירה, להוסיף 400 microliters של PBE חרוזים השעיית התא.
טען את כל הנפח על העמוד, ותן לתאים ללא תווית לזרום לתוך צינור 15 מיליליטר. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של חוצץ PBE, ולאסוף את השפכים הכוללים באותה שפופרת. הסר את העמודה מהמגנט והצב אותו בצינור 1.5 מיליליטר.
הוסף מיליליטר אחד של PBE על העמודה, ומיד לדחוף את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים החוצה. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה התא בנפח מתאים של DMEM, ולזרוע את התאים בצלחת תרבית רקמות. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ, והניח את הלוח על 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לתאים לדבוק ולגדול.
הזרקת תאי לוציפראז 4T1 לתוך כרית השומן המאמרי של עכברים נקבות הובילה לצמיחה של מסת גידול לגילוי חמישה ימים לאחר ההשתלה. כדי למצוא חלון הקרבה המתאים לבידוד CAF, נדרשה פשרה אופטימלית בין גודל גידול גבוה יותר לבין הדמיית ביו-לומינציה מצד אחד, לבין כיב גידולים ונמקים מחד. היום ה-20 הוגדר כנקודת הזמן לייעל את התאוששות התאים, לאחר תהליך הבידוד.
נדרשו שני מעברים נוספים כדי לבודד את אוכלוסיית ה- CAFs, מלוח התאים המעשיים שנאספו, דלדול הפיברובלסטים הקשורים לגידול, והעשרת הפיברובלסטים הקשורים לגידול. תאי CAF חשפו מורפולוגיה גדולה בצורת ציר, אופייני לפיברובלסטים, והיו שונים מתאי גידול 4T1. ביטוי FAP בעקבות חמישה קטעים מאשרים כי תרבות CAF העיקרית שמרה על המאפיינים המקוריים שלה.
כאשר משך והטמפרטורה של הדגירה עם חיידקים לא נשמרו, שיבוטים עם מורפולוגיה שונה נמצאו בין התרבות המבודדת. תאים מזהמים אלה גדלו מהר יותר וניצחו על תרבות CAF העיקרית. CAFs מחייב עם אדם פריטין Hfn-FAP פונקציונלית ננו תרופה גדל באחד לאחד, וריכוזי שבר נוגדנים אחד עד חמש על ידי פי שלושה, לעומת HFN חשוף.
להיפך, עבור גידול 4T1 תאים, HFN חשוף הראה כריכה גבוהה יותר מאשר HFN פונקציונלי. כדי להגדיל את טומאת התשואה של CAF מבודד, לשמור על חוצצים קרים, לכבד את זמן הדגירה עם חרוזים, ולמשוך עד ארבעה גידולים לכל עמודה לפני שלב העשרה הסופי. CAFs מבודד יכול לשמש כדי לסנן מספר תרופות ננו מועמד במונחים של כריכה, ספיגה, ויעילות פרמקולוגית לפני שתמשיך עם ניסויים פרה-קליניים ב vivo.
בידוד CAF אפשר לנו לבדוק אם חלקיקים יכולים לשמש כדי למקד את microenvironment הגידול. ובכך לסלול את הדרך לטיפולים ממוקדים חדשים העובדים בסינרגיה עם כימותרפיה.
