ברצוננו להודות לתומאס Lecuit (קו GFP :: sqh-Utrophin), מרכז מלאי בלומינגטון, ובנק Hybridoma המחקרים התפתחותית לחומרים כימיים. בנוסף, אנו מודים לכל חברי המעבדה צפר לדיונים וביקורת מועילים של כתב היד. מימון מהקרן הלאומי למדע MCB-1158527, וקרנות הזנק מאנטומיה ומחלקת ביולוגיה של תא, אוניברסיטת איווה תמכו עבודה זו. המכון הלאומי לבריאות predoctoral הדרכה גרנט בתרופתי המדעים T32GM067795 נתמך AJS. תמיכת אחסון נתונים סופקה על ידי ICTS, אשר ממומן באמצעות CTSA נתמך על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר והמרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, המכונים הלאומיים לבריאות, דרך גרנט UL1RR024979.

1. הכנת דרוזופילה לפני שלב בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך שמרים להדביק רטוב על ידי שילוב של 50 גרם של שמרים יבשים פעילים עם 90 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים עם מרית לשלב. תן לתערובת לעמוד במשך ~ 30 דקות לפני הערכת עקביות. העקביות צריכה להיות רק עבה מספיק כדי לדבוק בצד של בקבוקון לטוס אבל לא לרוץ למטה בצד. כדי להשיג את המרקם הרצוי ייתכן שיהיה צורך להוסיף עד 10 מיליליטר מים נוספים או כמות קטנה של שמרים יבשים. לאחסן במכל מכוסה ב 4 ° C. השמרים המאוחסנים יכולים לשמש ל~ 1-2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף &lt;זבובי 24 שעות ישנים מבוגרים (שני זכרים ונקבות) של גנוטיפים הרצויים ולשים אותם לתוך בקבוקון עם אוכל לטוס בתוספת ממרח שמרים רטוב מרוחה בצד של הבקבוקון. הטמפרטורה שבה נשמרים הזבובים תשתנה בהתאם לניסוי. בניסויים שיגרתי, זבובים נשמרים בטמפרטורת חדר. בעוד שניסויים שבהם הוא גןשביטוי יתר באמצעות מערכת UAS/GAL4 מאי 15 דורש שמירה על הזבובים 25 מעלות צלזיוס או יותר, על פי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את הזבובים עם כתם טרי של שמרים להדביק ביום למשך 2 ימים. הערה: כפי שהתפתחות זקיק מוסדרת היטב על ידי המצב התזונתי של נקבת הזבוב, זה חיוני כדי לספק לטוס עם השמרים להדביק עשיר המזינה לפחות 36 שעה לפני לנתיחה. </li></ol> 2. בידוד אמצע לסוף מבוים דרוזופילה זקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתקשורת כדי להגיע לטמפרטורת חדר (~ 30 דקות). אם הזקיקים המבוימים הולכים לשמש למבחני חוץ גופיית פיתוח, טרי להכין תקשורת IVEM (מדיה של גרייס חרקים, 10% בסרום שור העובר מומת חום, ו1x פניצילין / סטרפטומיצין). אם הזקיקים המבוימים הולכים לשמש לmRNA או בידוד חלבון להשתמש גם החרק של גרייס או מדיה IVEM. חשובה: טמפרטורת מדיה היא קריטית. אם התקשורת היא קרה זה יהיה לשנותגם אקטין וcytoskeletons microtubule ופיתוח בלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים בבקבוקון yeasted על ידי הזרקת גז CO 2 ומקום 3-5 זבובים נשיים על כרית לטוס תחת CO 2. חשוב: אל תשאיר יותר נשים מאשר יכול להיות גזור בתקופת זמן 10 דקות על משטח לעוף כמו חשיפה ממושכת לCO 2 יכול לגרום לעקרות ומוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא גם אחד של צלחת 9-spot עם תקשורת ולמקם אותו על גבי משטח כהה (חתיכת פרספקס השחור עובדת היטב). להתמקד ההיקף לנתח בתחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 5 מלקחיים דומון באמצעות להרים נקבה אחת ביד אחת (זה נעשה הכי טוב בעזרת היד הדומיננטית). זה בדרך כלל הקל ביותר להרים את הנקבה על ידי כנפיים, רגליים, חזה או למעבר בטן. להטביע את הנקבה בתקשורת מילאה היטב. התאם את המיקוד של המיקרוסקופ בהתאם לצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזוג נוסף של מלקחיים שנערכו בnondominant היד, לתפוס את הנקבה בקצה הקדמי של הבטןכך שהקצה האחורי ממוקם לכיוון היד הדומיננטית (איור 2 א). הקפד לשמור את הזבוב השקוע בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם היד הדומיננטית, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הציפורן במגזר פיגמנט האחורי ביותר 2 ולקרוע אותו משאר חלל הבטן (איורים 2 ב-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים ביד הדומיננטית, ללחוץ בעדינות את הקצה הקדמי של הבטן עד לשחלות לצוץ (איורים 2D-E). במידת צורך, הנח את המלקחיים בין שתי השחלות ולמשוך אותם אל מחוץ לגופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כך או להזיז את השחלות לבאר חדשה עם תקשורת טרי (איור 2F) או להסיר את הפגר למגבת Kimwipe או נייר. זה חשוב במיוחד אם זקיקים להיות מבודדים לפיתוח במבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עד 3-5 זוגות של השחלות היו מבודדים. הערה: כל השחלה מורכבת מ~ 16V ovarioles או שרשרות של זקיקים ברצף התבגרות. כל ovarioleהוא הכיל בתוך מעטפת שרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלחציים סיכה והמחטים מסופקות עימם, בעדינות לפרק את השחלה על ידי הפעלת המחטים בין ovarioles (איור 2G). לפעמים זה ישחרר את הזקיקים הבודדים גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ovarioles פרט והשלבים מורפולוגיים להבחין בקלות של התפתחות זקיק צריך עכשיו להיות גלוי (איור 2G, השחלה התגרתה מזה). עיין באיורים 1 ו 2H להבדלים מורפולוגיים שניתן להשתמש בם כדי להבדיל בין השלבים השונים. כדי לבודד זקיקים שנמצאים בovarioles שלם ועדיין בתוך מעטפת שרירים, להשתמש במחט לחוצה ovariole בקדמי של הזקיק שקדמו ובאחורי של הזקיק הבא הזקיק של עניין באופן מיידי. זה ישבור את מעטפת השרירים והזקיק של עניין משם כעת ניתן לחתוך מהזקיקים השכנים ללא פגיעה בו. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשלבים בודדים מופרדים, הזז את הזקיקים של עניין, באמצעות פיפטה זכוכית, לבאר חדשה עם מדיה חדשה. הדבר חשוב במיוחד כאשר מבודדים את הזקיקים להתפתחות במבחנה. הערה: חשוב לסחוט את הנורה פיפטה לפני הכניסה לתקשורת כדי למנוע בועות האוויר מהפיזור מחדש של הזקיקים של עניין לאורך כל כן. בנוסף, אם הזקיקים דבקים בפיפטה הזכוכית, פיפטה ניתן precoated עם 3% אלבומין בסרום שור (BSA) על ידי pipetting פתרון BSA מעלה ומטה מספר פעמים ושטיפה עם תקשורת לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמספיק זקיקים היו מבודדים, להמשיך בניסויים הבאים. </li></ol> 3. פיתוח במבחנה של S10B זקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד זקיקי S10B באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) בתקשורת IVEM. ודא שהזקיקים הם במהירות התרחקו מפסולת. כאשר זקיקים אלו ימשיכו להבשיל, זה important שS10Bs נאספים ל30-60 דקות ולאחר מכן הניח לתקשורת ההתבגרות של בחירה. הערה: S10B צריך להיות מכובד על זהירות מזקיקי S10A (איור 1 ג לעומת 1 ב &#39;), כפי שזקיקי S10A לא בוגרים בתקשורת ותרבות IVEM. בשני זקיקי S10B S10A ו, מחצית מהאורך מורכבת מתאי אחות ואת החצי השני הוא הביצית, אבל בS10B האורך של הזקיק הוא שווה לזה של זקיקי S14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר ~ 30 זקיקי S10B לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 24 גם. הערה: הקפד לוודא שכל הזקיקים מועברים הם S10B ולא הבשיל לS11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 μl של מדיה התבגרות לכל טוב, כלומר תקשורת IVEM בתוספת חומרים כימיים תרופתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה * זכוכית משך, להסיר כמה שיותר מדיה מהבאר (שלב 3.2) ככל האפשר, ובמהירות להוסיף מדיה התבגרות של בחירה. הערה: זה חיוני להשתמש פיפס זכוכית משךette כזקיקים מבוימים ניתן לקחת בקלות גם עם טפטפות זכוכית או טיפים פיפטה עם Pipetman. * כדי להפוך טפטפות משכה: 1) מחמם את החלק הדק של טפטפות בלהבה של מבער בונזן הארוכה, זכוכית רק עד שהזכוכית מתחילה להתרכך; 2) להעביר באופן מיידי את פיפטה מהלהבה ולמשוך אופקי כדי לצייר את פיפטה לתוך צינור עדין; 3) לשבור כדי ליצור נקודה עדינה. זהירות: השתמש בהגנה על העין שברי הזכוכית עשויים להתעופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1-3.4 לבארות רבות כמו הניסוי דורש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לזקיקים להתפתח ל&gt; 10 שעה ולהבקיע ההתקדמות התפתחותית בהיקף לנתח. הערה: ניסויים בדרך כלל הבקיע למחרת כדי לאפשר מספיק זמן לזקיקים להתפתח. S10B היא ~ 5 שעות, S11 הוא ~ 30 דקות, S12 הוא ~ 2 שעות, וS13 הוא ~ 1 שעות במשך ב25 C ° 1 ופיתוח בטמפרטורת חדר ייקח מעט יותר זמן. ניסויים דומים לזה שתוארו על זקיקי S10B יכולים להיותמבוצע באמצעות זקיקי S11-S13. </li></ol> 4. בידוד במה עבור הדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הזקיקים בשלב מאוחר (S10B-14) המבטא את סמן פלואורסצנטי של בחירה באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) בתקשורת IVEM, נע במהירות זקיקים מפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז זקיקים של עניין לתוך מדיה חדשה ולאחר מכן להעביר על ידי פיפטה זכוכית לצלחת פטרי תחתון coverslip. תשמור על עצמך כדי להוסיף מדיה, כך שהוא מבעבע באזור התחתון coverslip אבל לא יגלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזמן לשגות סרטים ארוכים יותר, לפעמים יש צורך לשמור על לחות בתוך צלחת פטרי על ידי הוספת Kimwipe מופשלת, טבולה במים, לקצה הפנימי של צלחת פטרי. מניחים את המכסה על ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה על מיקרוסקופ הפוכה. החלטה מפורטת תדרוש מיקרוסקופיה confocal. זה הכרחי כדי לאזן את התדר של הדמיה, עוצמת התאורה, ואורך של הדמיה, זה צריך להיות באופן עצמאי הסתדר לכל ליטרכלי abeling ותהליך התפתחותי. </li></ol> 5. בידוד במה לmRNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד זקיקי שלב בודדים באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) עם או תקשורת של גרייס או IVEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את השלבים הבודדים של עניין לתוך בארות חדשות עם תקשורת; ניתן לאסוף שלבים מרובים בבת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור פעמים אוסף תחת 1 שעות. הזז את הזקיקים, באמצעות פיפטה זכוכית, ל1.5 מיליליטר צינורות microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את הצינור לזמן קצר במיני microcentrifuge כדי גלולה כל הזקיקים. בעזרת פיפטה משכה את הזכוכית (ראה שלב 3.4) להסיר בזהירות את כל אמצעי התקשורת. הערה: אם אתם משתמשים בmicrocentrifuge בגודל מלאים, לסובב את הזקיקים במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של Trizol 100 μl ולטחון ביד ל~ 20 שניות באמצעות העלי פלסטיק. ספין למטה במהירות מלאה בmicrocentrifuge ולעבור Trizol לנזהר שלא להפריע לכל ד pelleted צינור 1.5 microfuge מיליליטר חדשebris. חנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.1-5.5 עד מספיק זקיקים התקבלו לניסוי. באופן שיגרתי, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, ו~ 100 S14 זקיקים להניב ~ 10 מיקרוגרם של רנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו דגימות על קרח. משלב דגימות, לפי העניין, לצינור microfuge אחד ולהביא עד 800 μl Trizol הנפח. להמשיך עם בידוד RNA לפי הוראות היצרן. חשוב: זכור לDNase טיפול RNA הבודד עם DNase RNase ללא. </li></ol> 6. בידוד במה לסופג מערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים גוש חום ל100 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד זקיקי שלב בודדים באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) עם או תקשורת של גרייס או IVEM. הערה: יש צורך לקבוע באופן אמפירי כמה מזקיק בשלב מסוים יש צורך להתבונן בכל חלבון ספציפי. לחלבונים הביעו מאוד 1-3 זקיקי S10B / טוב מספיק כדי לראות את איתות חזקה על כתם מערבי. עם זאת, חשוב לעשותמדגם מייצג, לוקח זקיקים מנקבות מרובות. לפיכך, 15-20 זקיקים של שלב מסוים הם בדרך כלל שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז זקיקים, באמצעות פיפטה זכוכית, לצינור microfuge 1.5 מיליליטר. ספין בקצרה במיני microcentrifuge לגלולת הזקיקים (ראה שלב 5.4). מוציא בזהירות את כל התקשורת באמצעות פיפטה זכוכית משך (ראה שלב 3.4) ולהוסיף 50 μl של 1x PBS ו50 μl של חיץ 2x Laemmli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטחון ביד ל~ 20 שניות עם העלי פלסטיק. הערה: עלי פלסטיק ניתן לעשות שימוש חוזר לטחינת דגימות מערביות על ידי שטיפה והמעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את הדגימות עבור 10 דקות בגוש החום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל בקצרה על קרח וספין במהירות מלאה ל15 שניות בmicrocentrifuge. או מייד להעמיס על ג&#39;ל SDS-PAGE או חנות ב -20 ° C. שים לב: אם הדגימות מאוחסנות, לזכור להרתיח מחדש את הדגימות לפני העמסתי על ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח כתם מערבי בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. </li></ol>

<ol>
	<li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filament+cables+in+Drosophila+nurse+cells+are+composed+of+modules+that+slide+passively+past+one+another+during+dumping.">Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping.</a> J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).</li><li>Horne-Badovinac, S., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transit:+epithelial+morphogenesis+in+the+Drosophila+egg+chamber.">Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber.</a> Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).</li><li>McCall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggs+over+easy:+cell+death+in+the+Drosophila+ovary.">Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary.</a> Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).</li><li>Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+shell+game:+patterning+genes+and+morphological+change.">The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change.</a> Trends Genet. 21, 346-355 (2005).</li><li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+II.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49, 411-424 (2006).</li><li>Tootle, T. L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pxt:+a+cyclooxygenase-like+facilitator+of+follicle+maturation.">Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation.</a> Development. 135, 839-847 (2008).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Fascin+is+a+novel+downstream+target+of+prostaglandin+signaling+during+actin+remodeling.">Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).</li><li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis.">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li><li>Bianco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+modes+of+guidance+signalling+during+collective+migration+of+border+cells.">Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells.</a> Nature. 448, 362-365 (2007).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flytrap,+a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster.">Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+eggshell+production:+identification+of+new+genes+and+coordination+by+Pxt.">Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt.</a> PLoS. One. 6, e19943 (2011).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li></ol>

אין מה לחשוף.

זקיק דרוזופילה מורכב ממספר קטן של סוגי תאים, מה שהופך אותו אידיאלי עבור שניהם המורפולוגיים וניתוחים מולקולריים. יתר על כן, בשל המבנה של השחלה, קל יחסית להשיג מספר גדול של שלבים מסוימים של התפתחות זקיק עם היקף ניתוחים נפוץ והכשרה מינימאלית. כמו כל שלב מייצג חלון ז?...

כל השחלה דרוזופילה מורכבת מ~ 16V ovarioles, או רשתות של תאי ביצה ברצף התבגרות או זקיקים. כל זקיק מורכב מביצית אחת, תאי אחות או תמיכה נגזרים שורת נבט 15, ו~ 650 תאים סומטיים מכונים תאי זקיק (איור 1 א). Oogenesis דרוזופילה מחולק ל14 שלבים מוגדרים מורפולוגית של פיתוח 1. בכל שלב של התפתחות זקיק הוא ציין פעמים רבות בתוך זבוב אחד, ולכן קל יחסית לבודד מספר ניכר של זקיקים בשלב מסוים. שלבי האמצע עד סוף של oogenesis (שלבי 10B-14) הם גם מתאימים במיוחד לבידוד במה (איור 1). בשלב 10B (S10B), הזקיק מוארך באופן מלא (כלומר אורכו שווה לזה של שלב 14 (זקיק S14), ראה איור 1 ואיור 2H) ומחצית מאורכו של הזקיק מורכב מתאי אחותואילו המחצית השנייה היא הביצית (איור 1 ג). בשלב זה תאי האחות עוברים שיפוץ אקטין דרמטי, חיזוק אקטין קליפת המוח ויצירת חבילות מקבילות של סיבי אקטין 2. במקביל, אוכלוסייה של תאי זקיק, המכונה תאים הצנטריפטלי, נודדים בין תאי האחות והביצית, ושתי קבוצות הגבי של תאי זקיק הופכות צוינו לעבור הגירה כדי ליצור את הנספחים הגבי, מנגנוני נשימה צינורי לעובר 3 . תאי האחות אז חוזה (S11), לוחץ תוכן cytoplasmic שלהם לתוך הביצית בתהליך הנקרא תא אחות השלכת, אשר מספק את הביצית עם הגורמים הדרושים לכך שכדי להשלים את העובר (1D איור). תאי האחות ואז לעבור תא מוות (S12-S13) 4, ותאי הזקיק מפרישים ודפוס קליפת הביצה 5 (האיורים 1E-G). לפיכך, בסוף oogenesis עשיר בהתפתחותיים חשובתהליכי morphogenetic ד. זקיקים מבודדים באמצע בשלב מאוחר (S10B-S14) יכולים לשמש למגוון מטרות, כולל ניתוחים מולקולריים. לדוגמא, ה-mRNA מזקיקים מבוימים יכולה להיות מבודד לRT-PCR, microarray, או RNA-seq ניתוחים. זה מאפשר להסתכל על ביטוי גנים בתוך חלון התפתחותית קצר, עם רק כמה סוגי תאים בהווה, ולקבוע כיצד ביטוי גנים שונה על ידי הפרעות או תרופתיות או גנטיות. גם בידוד שלב ניתן להשתמש להסתכל על חלבונים על ידי מערבי סופג. ניתוח כזה הוא חשוב משום שהוא מאפשר לכמת את רמת ביטוי החלבון בwild-type לעומת מוטציות בשלבים מסוימים. אמנם אפשר להשתמש immunofluorescent מנתח כדי להשיג תוצאות דומות, כימות של הקרינה היא חזקה פחות בשל הדרישות הקפדניות שכל הפיקסלים יהיו בתחום ליניארי של זיהוי 6. בנוסף, ניתוח כתם מערבי עשוי לספק מידע אחר, כגוןים אם החלבון הוא שונה או שהוא בא לידי ביטוי מאיזופורם אחו ספציפי posttranslationally. גם שלבים מבודדים יכולים לשמש לטיהור חלבונים נוספת, כוללים חלוקה או coimmunoprecipitation subcellular. גם בידוד זקיק בשלב מסוים יכול לשמש במבחני חוץ גופית פיתוח 7 וחייה הדמיה 8. זקיקי S10B-S13 מבודדים ימשיכו לפתח לS14 בתקשורת תרבות הפשוטה (ראה להלן). חשוב לציין כי זקיקי S10A לא להתקדם דרך תא אחות השלכת באמצעות תנאי התרבות שנדונו בכתב היד הזה. יש לנו בשימוש במבחני חוץ גופית פיתוח S10B להגדיר את התפקיד של פרוסטגלנדינים, שני פרמקולוגית וגנטי, בויסות שיפוץ אקטין באמצעות תא אחות השלכת ופיתוח לקריאה פסקי 7,9. בדומה לכך, בשלבים מאוחר יותר של התפתחות יכולים גם להיות מבודדים כדי לקבוע את ההשפעות של טיפולים תרופתיים או איש גנטיipulations על תהליכים מסוימים, כגון הגירה הצנטריפטלי תא, הגירת תוספת גב / היווצרות 10, ומוות של תאי אחות. מבחני מסוג זה יכול לשמש כדי לבצע מסכי אינטראקציה דומיננטיים או מבחני, למשל, בעוד heterozygosity למוטציות בPXT או fascin לבד אין להם השפעה על התפתחות S10B במבחנה, זקיקים מheterozygotes הכפול תא אחות תערוכת הטלת מומים ולחסום בפיתוח 9. בנוסף, בגלל S10B-13 יכולים להתפתח בתרבות, כל התהליכים המתרחשים בתקופה זו ניתן לצפות בזמן אמת הדמיה. הדמיה כזו יכולה להתבצע רק באמצעות אור מועבר (אם הוא מעוניין רק בשינויים במורפולוגיה ברוטו) או עם מיקרוסקופיה confocal באמצעות זבובים מהונדסים מבטא בדיקות או זקיקים מוכתמים בצבעי ניאון הדמיה לחיות. הדמיה חיה נמצאת בשימוש כדי לקדם את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו באופן משמעותי. אכן, לחיות לדמייןגרם של זקיקים בשלב מאוחר הרחיב את הידע של הגירת תוספת גב, דוגמא של tubulogenesis 10. אנו מצפים כי הדמיה חיה של תהליכים נוספים בשלב מאוחר, ובכלל זה אקטין דינמיקה בתא אחות השלכת, תספק תובנה חדשות אירועים התפתחותיים אלה. חשוב לציין כי בעוד S10A ושל התפתחות זקיק בשלבים מוקדמים לא ימשיכו להתפתח S14 בתרבות, בשידור חי הדמיה של אירועים המתרחשים באותם שלבים של התפתחות אפשרית באמצעות תנאי תרבות אלטרנטיביים 11-14 (ראה דיון ליותר מידע). כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבידוד זקיקים בשלב מאוחר גם עבור פיתוח במבחנה ולחיות הדמיה, או ניתוחים מולקולריים (mRNA ובידוד חלבון).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

oogenesis דרוזופילה או התפתחות זקיק כבר בשימוש נרחב על מנת לקדם את ההבנה של תהליכים ביולוגיים התפתחותית ותא מורכבים. נייר שיטות זה מתאר כיצד לבודד זקיקי האמצע לסוף שלב (שלב 10B-14) ולנצל אותם על מנת לספק תובנות חדשות על האירועים המולקולריים ומורפולוגיים המתרחשים במהלך חלונות הדוקים של זמן התפתחותי. זקיקים מבודדים יכולים לשמש למגוון רחב של טכניקות ניסוי, כוללים במבחני חוץ גופית פיתוח, הדמיה לחיות, ניתוח ביטוי mRNA וניתוח כתם המערבי של חלבונים. זקיקים בשלב 10B (S10B) או במאוחר יהיו להשלים את הפיתוח בתרבות, זה מאפשר לשלב הפרעות גנטיות או תרופתיות עם פיתוח במבחנה כדי להגדיר את ההשפעות של מניפולציות כאלה על התהליכים המתרחשים בתקופות מסוימות של התפתחות. בנוסף, משום שזקיקים אלה מפתחים בתרבות, הם מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיה חיות, אשר לעתים קרובות לחשוף את המנגנונים חדשים שלתווך אירועים מורפולוגיים. גם זקיקים מבודדים יכולים לשמש לניתוחים מולקולריים. לדוגמא, שינויים בביטוי הגנים הנובעים מהפרעות גנטיות יכולים להיות מוגדרים עבור חלונות התפתחותיים ספציפית. בנוסף, רמת חלבון, יציבות, ו / או שינוי מצב posttranslational בשלב מסוים של התפתחות זקיק ניתן לבחון באמצעות כתם מערבי מנתח. לפיכך, בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה מספק מקור מידע עשיר לתהליכי שימור נרחב של פיתוח והמורפוגנזה.

כאשר מבודדים את שלבים מסוימים של התפתחות זקיק דרוזופילה זה הכרחי כדי להיות מסוגל להבחין במדויק את שלבי מורפולוגיים השונים. זה קצת מאתגר עבור S10A וS10B, כמו תאי האחות והביצית כל לקחת חצי אורכו של הזקיק בשלבים האלה (איור 1 ב בהשוואה ל1C). עם זאת, זקיקי S...

Watch this Scientific Journal Video about The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation at JoVE.com

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מולקולריים, כגון בידוד mRNA וחלבון.

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K Views.  University of Iowa Carver College of Medicine.  בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מו...

Video: The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

ביטוי ממוקד של ה-GFP ב זקיק השיער באמצעות אקס התמרה Vivo ויראלי

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...