The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

הצהרת אתיקה: הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה באופן בלעדי כרוכות בעבודה עם melanogaster דרוזופילה ואינן כפופים לחוקים לרווחת בעלי החיים בגרמניה. .1 הכנת מדיה, כלים, וזבובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום שונה זמין מסחרי אבקת M3 צמיחה ללא אשלגן ביקרבונט 17. זהירות: מעצבן לעין ועור. מוסף הבינוני עם 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. השתמש בסרום שור עוברי נבדק חרקי תרבות מומתת חום וקבלת תוצאות הטובות ביותר. סינון הבינוני המלא (המכונה להלן כבינוני) באמצעות יחידת 0.2 מיקרומטר מסנן בקבוק העליון וחנות בaliquots ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, מסנן (פילטר קצה המזרק 0.2 מיקרומטר) הבינוני שוב כדי להסיר את משקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות מעכב למבחנים תרופתיים. Dissolve הכימיקלים בממס המתאים והחנות בaliquots. לדוגמא, להכין פתרון מניות של 28.69 חומצת anacardic מ&quot;מ (זהירות: ממגר את העין ואת העור) בdimethylsulfoxide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את הכלים לשיבוש אשכים גלמים גזורים ונתיחה של ציסטות בודדות. השתמש בשתי מחטים חדות ונוקשה, ולא זוג המלקחיים. כוח הנימים המתפתח בין שתי זרועותיו של זוג המלקחיים הופך את הנתיחה של ציסטות בודדות בכמויות קטנות של מדיום קשה מאוד. לדוגמא, השתמש בקצה של סיכת חרקים נירוסטה מוכנסת לתוך מחזיק חיסון לולאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לקבל את הגלמים כראוי בגיל, בערך זרע 10 בקבוקוני תרבות גדולים (צינורות עם 4 ס&quot;מ קוטר) עם מספר מספיק של זבובים בוגרים (בערך 40-60 זבובים). כדי לנתח את מתג HP, להשתמש זבובים להביע H2AvD-RFP וProtamineB-eGFP בדפוס אנדוגני 12,16,22. דגירה הבקבוקונים בתנאים סטנדרטיים ב25; מעלות צלזיוס למשך בערך 4-5 ימים עד זחילת זחלי instar השלישי ולהתחיל התגלמות על הקירות של הבקבוקונים 25. </li></ol> .2 סימון או איסוף לבן טרום גלמים להשיג גלמי 24-HR-ישנים לDissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את ההשפעה של כימיקלים מסוימים במתג HP, לנתח אשכים גלמים בקירוב 24 APF 12 שעות. כדי להשיג גלמים מבוימים, לקחת את בקבוקוני תרבות זבוב מוכנים עם pupating זחלים (ראה סעיף 1.4) ולזהות מראש גלמים לבנים רבים ככל האפשר. טרום גלמים במהלך השלב הראשון בהתגלמות מופיעים כחסר תנועה, שאינה האכלה, זחלים ולא קיצרו עם spiracles מופנה החוצה וגולם בצבע לבן. הגולם הופך שזוף בצבע חום בתוך 30 עד 60 דקות, דבר שמצביע על השלב הבא של פיתוח גלמי 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את עמדותיהם של טרום הגלמים עם סמן קבוע בצד החיצוני של הבקבוקונים. דגירה הבקבוקונים ב25 מעלות צלזיוס למשך בערך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין,לבחור מראש גלמים מהצד של צלוחיות עם מברשת קטנה טבולה בPBS חיץ. לאחר מכן להעביר את מראש הגלמים לצד השני של צינור תגובה 50 מ&quot;ל טרי ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך בערך 24 שעות. </li></ol></li></ol> .3 Dissection של גלמי אשכים בקירוב 24 שעות לאחר היווצרות הגולם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ כמה טיפות (בערך 80 μl כל אחת) של מדיום בתרבית תאי פלסטיק 10 סנטימטר או צלחת פטרי. בעזרת זוג רחב של מלקחיים או מכחול טבול במדיום, לבחור את הגלמים בשלב APF 24 שעות מהבקבוקונים מודגרות (ראה סעיף 2). העבר את הגולם אחד לכל טיפה של מדיום בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה, להשתמש סטריאו מיקרוסקופ מצויד בפנס סיבים אופטיים. אין לחמם את האשכים מעל RT במהלך הנתיחה שכן הדבר עלול למנוע התפתחות תקינה בתרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח גלמים עם שני זוגות של מס &#39;5 מלקחיים. עם זוג אחד, לתפוס את הגולם לכל היותר האחורי שלהחלק (spiracles האחורי) ולהחזיק אותו בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את spiracles הקדמי עם זוג מלקחיים האחר ולפתוח את operculum גלמים בקצה הקדמי שלה. לקלף את המקרה גלמי לפחות עד חלק של בית החזה חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להחזיק את הגולם בעמדה של הקצה האחורי ביותר שלה. כדי לשחרר את הלחץ הפנימי של הגולם, להכניס את שני הידיים של זוג המלקחיים לאזור הראש של הגולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוע את הגולם הפתוח על ידי פתיחת המלקחיים ומרגשים המלקחיים בכיוון הקדמי. ודא כי הפתיחה שנוצרה עם תנועה זו היא גדולה ככל האפשר, בניסיון הראשון. למנוע נזק לגולם בקצה האחורי שלה לפני הלחץ כבר פורסם שכן הדבר עלול לגרום לאשכים נדחפו דרך הפתח הקטן באופן ישיר ולעתים קרובות ביותר ששבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שברגע שהגולם נפתח, הלחץ הפנימי שוחרר מהגולם לוחץ את agglomerates של תאי שומן בגוף ורקמות באמצעות laפתיחת rge באזור הראש. בדקו אם האשכים גלמים כבר דחפו מתוך הגולם עם החומר הזה; זה קורה בחלק מהמקרים. האשכים אינם מחוברים לכל רקמה אחרת ב24 APF שעות ולכן עלול להיות מגורש בקלות מהגולם 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע לוחץ גולם עם המלקחיים שכן הדבר עלול לגרום נזק לאשכים אם הם יישארו בגולם. להגדיל את גודל הפתיחה באמצעות זוג אחד של מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן החזק את הגולם בקצה האחורי ביותר שלה. סגור את הזוג האחר של מלקחיים ובעדינות פס החוצה את התוכן של הגולם מאחורי לקדמי כדי לשחרר את האשכים מהגולם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את האשכים על ידי משייכתם לקצה פיפטה 200 μl מראש לחתוך. נסה להעביר רק כמות קטנה מאוד של מדיום כדי להפחית את מספר תאי שומן בגוף הועברו עם האשכים. מניחים את האשכים לתוך מדיום בצלחת תרבות טרי. שטוף את האשכים כמה פעמים עם מדיום עד שרק תא בגוף כמה שומןים יישאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה חיה, להעביר אשכים למנת תרבות זכוכית תחתונה עם מדיום ולהשתמש מיקרוסקופ הדמיה הפוך. עבור מבחני תרופתיים, להמשיך בשלב 5. </li></ol> .4 Dissection של ציסטות נבט אונליין זכר והדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אשך גלמים אחד או יותר למנת תרבות זכוכית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סטריאו מיקרוסקופ עם תאורת סיבים אופטית ושתי מחטי נירוסטה (ראה סעיף 1.3) לנתיחה של ציסטות נבט אונליין גבריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מחט אחת, לנסות בזהירות כדי להצמיד אשך אחד בקדמי שלה או קצה אחורי. להחזיק אותו בעמדה. הכנס את המחט אחרת לאשך ולשבש את נדן האשך על ידי הזזת המחט לצדדים. רבים מציסטות ישוחררו מהאשך על ידי תנועה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להחזיק את האשך בעמדה עם מחט אחת. בעדינות פס החוצה ציסטות שנותרו מהאשך עם המחט אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציסטות נפרדות מצטברות או על ידי ג &#39;נטלמןly נע מחט לצדדים באמצעות המקבץ של ציסטות או על ידי העברת ציסטות לצלחת תרבות טרי עם מדיום באמצעות קצה פיפטה 200 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את צלחת התרבות למיקרוסקופ הדמיה הפוכה להדמית חיה של ציסטות בודדות. לפזר ציסטות שוב עם מחט במידת צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את השלב של ציסטות באמצעות שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בציסטה של ​​השלב הרצוי. לאשר מיקוד ומיקום של ציסטה לעתים קרובות במהלך ניסויי הדמיה יותר, כמו ציסטות לא לדבוק בתחתית צלחת התרבות ולכן נוטה לצוף מחוץ לפוקוס. הערה: ציפוי הצלחת עם פולי-L-ליזין לקיבוע פוגע בהתפתחות של ציסטות נבט אונליין מוקדם. במקום זאת, ניתן לבודד ציסטות בודדות. עם קצת תרגול, זה אפשרי לבודד ציסטה מסוימת על ידי בעדינות דוחף אותו עם המחט. זה יאפשר ההעברה של ציסטות בודדות לכת נפרדתמנות יור עם פיפטה פסטר זכוכית עם קצה מתמשך שנכנס לתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ. ציסטות בודדות לאחר מכן ניתן עברו בקלות במנות התרבות גם לאחר דגירה ארוכת הטווח. </li></ol></li></ol> .5 תרופתי Assay עם אשכי גלמים תמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא כל גם צלחת תרבית תאי 24 גם עם 500 μl של מדיום לניסוי אחד 12 משכפל. העברת אשך גלמים לכל אחד גם, באמצעות קצה פיפטה 200 μl מראש לחתוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק את קיומו של protamines באשכים המבודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. האשכים צריכים להיות חופשיים של אות ProtamineB-eGFP, אשר מציינת כי המתג של HP אינו חל בכל אחד מציסטות. החלף אשכים שכבר מראים ציסטות ProtamineB-eGFP חיוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל12 הבארות הראשונות, להוסיף 500 μl של מדיום המכיל תרכובת מעכב מדוללת (חומצת anacardic) כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי(150 מיקרומטר) ב 1 מ&quot;ל של מדיום בכל טוב. השתמש בבארות הנותרות כפקדים שלא טופלו; להוסיף 500 μl של מדיום עם אותה הכמות של ממס המשמשת כעם התרכובות מעכבת. הערה: אם תרכובות שונות וממסים המשמשים, זה יכול להיות יותר יעיל לשימוש לבד בינוני כשליטה ועל מנת לבחון את ההשפעה של הגדלת ריכוזי ממס בניסויים נפרדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שוב את קיומו של protamines באשכים מודגרות כפי שתואר לעיל. האשכים השליטה צריכים עכשיו להראות ציסטות אחד או יותר ProtamineB-eGFP חיוביות, המצביעה על מעבר דרך מתג HP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה עם טיפ 200 μl, להעביר את האשכים לשקופיות פולי-L-ליזין מצופה, להיערך סקווש וכתם עם נוגדני ניאון מתאימים כפי שתואר במקום אחר 12,27,28. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

אי לנו אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול המובא מתאר שני יישומים שונים המבוססים הן על היכולת לנתח אשכים דרוזופילה וציסטות ניבט שורה אחת בשלב התפתחותי נתון ועל פיתוח vivo לשעבר של תאים ורקמות אלה בצלחת תרבות. יישום אחד הוא המניפולציה התרופתית של תהליכים חיוניים בהתפתחות זרע. חשוב לציין, זה מאפשר גישה ליצירת תאי זרע לאחר meiotic שאינו בקלות צבר באמצעות ניתוחים תפקודיים המבוססים על גנטיקה זבוב. היישום האחר הוא ההתבוננות המיקרוסקופית של חיים ופיתוח תאי נבט ואשכים. במיוחד יתרונות יישום זה מיכולתם של תאי דרוזופילה ואיברים בתרבות לשרוד ולהתפתח בRT ותחת אווירה רגילה. לפיכך, מיקרוסקופ הדמיה הפוך מצוידים בבמה מחוממת (חימום לטמפרטורת גידול סטנדרטי של 25 ° C) הוא מספיק כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים חי הדמיה. נוסףיותר, זני זבוב מהונדסים רבים לבטא חלבונים מתויג חלבון פלואורסצנטי עבור הדמיה חיה קיימות או ניתן להקים בקלות. כדי להשיג אשכים או ציסטות נבט אונליין גלמים של שלב התפתחותי מסוים, זה קריטי, כי אחד הוא מכיר את עיתוי פיתוח דרוזופילה. העיתוי המדויק לכל שלב עשוי להשתנות בין מעבדות, תנאי תרבות, ולעוף זנים ויש לקבוע באופן אמפירי. כפי שתואר לעיל, זה חשוב במיוחד עבור מבחני תרופתיים ש, למשל, לכוון את מתג HP. בניסויים כאלה, כדאי תמיד לבדוק לspermatids עם אות ProtamineB-eGFP לפני בדיקת המעכב בפועל משום שהעיתוי יכול להשתנות מעט אפילו בתוך אוכלוסייה אחת. בעקבות הפרוטוקול הנ&quot;ל צריך לאפשר הנסיין לנתח אשכים משלבי גלמים כבר באיברים שלמים חופשיים של רקמת שומן בגוף מצורף. אשכים אלה ועוד יותר מכך, מבודדים geציסטות rm-line הן מאוד שבירות. לפיכך, חשוב לפתח את המיומנות הידנית וניסיון דרוש לטיפול והעברת אשכים וציסטות באמצעות מלקחיים, מחטים, וטפטפות. במיוחד מחקרי מיקוד פיתוח של תא ניבט שלאחר meiotic meiotic ותחילת ירוויחו מזה. אמנם קל יחסית לנתח ציסטות של spermatids מאוחר עם שוטונים ארוכים מאשכים מבוגרים, שקשה להשיג שלבים מוקדמים יותר. לנתח ציסטות אלה מאשכי גלמים מוקדמים בעקבות פרוטוקול זה הוא הרבה יותר יעיל. זכור כי בזן זבוב רגיל, רק בערך 50% מהגלמים יהיו זכר. לכן, להכין לנתח לפחות כפליים גלמים כמספר האשכים הנדרשים. לחלופין, ניתן לזהות זחלי L3 גבריים באמצעות סטריאו מיקרוסקופ, כפי שניתן זיהו את האשכים איברים עגולים שקופים כמוטבעים ברקמות שומן בגוף לרוחב של הזחל שלם 23,34, ולאסוף אותם בצלוחיות תרבות טריות ש יכוללשמש כדי לבחור מראש גלמים לבימוי וניתוחים. כמו כן ניתן לזהות זכר מראש גלמים 35. שם לב ששני ציסטות נבט אונליין מבודדים ואשכי גלמים שלמים בתרבות רגישות לאור, כפי שכבר דווח בעבר גם 18. רגישות לאור זה עשויה גם להחזיק לכמה תרכובות כימיות המשמשות במבחנים תרופתיים. לכן, דרך טובה ביותר הוא לשמור על מנות התרבות של assay בחושך במהלך דגירה. כמו כן, בעת תכנון ניסויי הדמיה הזמן לשגות עם אשכים פיתוח ו, במיוחד, ציסטות בודדות, יש לזכור כי זמני חשיפה ארוכים מדי ו / או שיעורי דגימה גבוהים מדי עלולים לעכב התפתחות ex vivo. קצב הדגימה המתאים צריך להיקבע באופן ניסיוני. זיהום חיידקים ו / או פטרייתי ועל הצמיחה במנות התרבות מהווה בעיה חמורה. מנות תרבות נגועות בחיידקים רבים מדי אינן תומכות vivo לשעבר development של האשכים וציסטות. לכן, מדיום התרבות המתוארת מכיל פניצילין וסטרפטומיצין (ראה שלב 1.1), אבל במהלך דגירה ארוכת טווח, האנטיביוטיקה הללו עשויים להיפגע ופעילותם משום הפחתה. זה יכול להיות אחת הסיבות לזמן המוגבל של הישרדות (מקסימום. 72 hr) של ציסטות בתרבית שנצפו בעת השימוש בפרוטוקול לעיל. עם זאת, מסגרת זמן זה לא יכול להיות מורחב על ידי החלפה קבועה של מדיום התרבות במנות. אנו מסיקים כי גורמים אחרים עשויים להשפיע על ההישרדות בתרבות, כגון חוסר אותות צמיחה מרקמות אחרות של מערכת המין. מצד השני, התפתחות שלאחר meiotic היא מהירה יותר בדרוזופילה מאשר ביונקים. בדרוזופילה, spermiogenesis לוקח כ 90 שעה, ומתג HP מתרחש בין 50 ו60 שעות לאחר מיוזה 9,12. לפיכך, זמן ההישרדות הרגיל של כ 48 שעות הושגו עם פרוטוקול זה הוא גם מתאים למעקב תהליכים התפתחותיים מרכזיים בSPErmatogenesis, כגון חטיבות meiotic או מתג HP. למרות שניתן להימנע מזיהום חיידקים או פטרייתי על ידי שימוש בכלים ובתקשורת נקיים, הפרוטוקול המובא אינו עושה שימוש בתנאי עבודה סטריליים לחלוטין בגלל זבובים ולעוף אשכים כבר להכיל חיידקים כאשר העלו בתנאים סטנדרטיים. עם זאת, חלק מהיישומים של טכניקת תרבות זו עשויות להפיק תועלת מהזבובים גזורים או אפילו העלו בתנאים בקטריאלית (לפרוטוקולים, לראות 17,36,37). מבחני תרופתיים תלויים בשימוש בתרכובות כימיות הפועלות כמעכבים או מפעילים של אנזימים שונים. התרכובות נפוצות בניסויים כאלה לעתים קרובות שונים באופן נרחב ביעד הספציפי שלהם. כיתרון, זה מציע את הפוטנציאל למקד כיתות אנזים שלמות, למשל, עם p300 חומצת anacardic עיכוב / CBP, PCAF, וחברים של כובעים 38 משפחת MYST. החסרון של זה יכול להיות פוטנציאל מחוץ יעד או השפעות רעילות inducאד על ידי תרכובות כגון. לכן, בכל מתחם ששימש בassay עם אשכים או ציסטות גלמים צריך להיבדק לרעיל שלה והשפעה ספציפית בריכוזים שונים. יתר על כן, שינויים קלים בתנאי התרבות, ריכוז תרכובת או פעילות, ושינויים בחדירות התא עלולים להוביל לשונות של תופעות הנגרמים. לכן, יש צורך לפקח על ההצלחה של הטיפול בכל ניסוי. לדוגמא, כאשר אנו משמשים חומצת anacardic ב150 מיקרומטר, צפינו שונות קלות בכוחו של פנוטיפ עיבוי הכרומטין בין ולפעמים בתוך כמה אשכים, ואילו acetylation של H4 היסטון ירד באופן עקבי. מבחני תרופתיים עם האשכים דרוזופילה בתרבות היו בשימוש כדי לנתח מנגנונים של לפני ואחרי meiotic יצירת תאי הזרע 4,12,14,21. מאחר וקשה לגישה יצירת תאי זרע לאחר meiotic עם כלים גנטיים למקד שחקנים עם Essentiaפונקציות l מראש meiotic וmeiotic, גישה זו vivo לשעבר מהווה תחליף. יתר על כן, באופן עקרוני, השיטה יכולה להיות מותאמת לדופק מרדף ניסויים כדי לעקוב אחר ההתפתחות של תאי נבט שטופלו לאורך זמן. עם זאת, אנחנו עדיין לא נבדקו אפשרות זו. תוך שימוש באשכי גלמים מוקדמים הוא יתרון במבחנים תרופתיים. ראשית, המעטפת החיצונית הדק של האשכים גלמים הצעירים (בסביבות 24 שעות APF) עלולה לאפשר חדירות משופרות של תרכובות כימיות. שנית, כאשר לומדים את מתג HP שלאחר meiotic, האשכים גלמים גזורים ב24 APF שעה מקו זבוב protamine-להביע GFP מאפשרים קריאה ישירה של אם מתג HP הושפע או לא. נכון להיום, כמה פרוטוקולים לגידול vivo לשעבר של איברי דרוזופילה ורקמות כולל אשכים וציסטות נבט אונליין פותחו (למשל, לראות 4,14,17,20,39,40). מדיום הגידול ותנאים הכלליים המשמשיםבפרוטוקול המובא כאן הוקמו בשנת 1979 17. מערכת התרבות מאוחר יותר מותאמת להדמית in vivo של מנגנון אינדיבידואליזציה בציסטות לאחר meiotic מאוחר מבודדות מאשכים בוגרים 4. בעבר, יש לנו דיווח כי תנאים אלה תומכים גם בהישרדות ובידול של meiotic ותאי נבט שלאחר meiotic בשלב מוקדם בציסטות שלהם במשך כ 48 12 שעות. בניגוד למערכות תרבות אחרות 19 העיתוי ההתפתחותי שנצפה בתרבויות אלה היה כ בקנה אחד עם העיתוי שנקבע מדגימות קבועות (לפרטים, ראה 12). אותות הקרינה H2AvD-RFP וprotamine-GFP יכולים לשמש כדי לחזות את הרכב המורפולוגיה והכרומטין הגרעיני של תאי הנבט בתרבות. מצאנו כי לזיהוי ברור של שלבי התפתחות בתרבות, זה יש יתרון על פני קריטריונים אחרים, כגון התפתלות של ציסטות. חשוב לציין, בפרוטוקול שהוצג אינו כרוך בתוספת של שלוחה זבובגורמי גדילת ract או אחרים מלבד סרום שור העובר. יתר על כן, אנו מציגים כאן, כי התנאים בקנה אחד עם ההדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חטיבות meiotic vivo לשעבר בתרבות. ניתן להשיג תמונות ברזולוציה סבירה במדיום קל לשימוש שתומך בפיתוח לטווח ארוך. זאת בניגוד לפרוטוקולים המאפשרים לטווח קצר (בערך 3 שעות) תצפיות בשמן Voltalef 41,42. הנהלים שתוארו לעיל לטיפוח וטיפול תרופתי של אשכים גלמים וציסטות נבט אונליין זכר יחידים הם להתאמה בקלות לרבה גנטית, אפיגנטיים, תא ביולוגי, או שאלות התפתחותיות שניתן לחקור ביצירת תאי זרע דרוזופילה. זה כולל במיוחד מחקר מתמקד בתאי גזע נבט אונליין. הוכח כי פיתוח תאי גזע יכול להיות מלווה הדמיה חיה של מבוגר מתורבת אשכי 20,43. עם זאת, תנועת הנפיחה של האשך הבוגר sheath מפריע לרכישת תמונה. לכן, גם הדמיה נעשה שימוש באשכים מקוטעים 43 או מספר ניסויי הדמיה שבוצעו יש להגדיל לדין וחשבון על מערכי נתונים איבדו 20. אשכים מוקדם גלמים (APF 24hr) עדיין לא סגורים עם תאי שריר. אפילו מעט אשכים מבוגרים (APF 36-45 hr) מופיעים כדי להראות כמה תנועות peristaltic (השוו איור 3 ווידאו נוסף 1). לכן, טיפוח אשכים גלמים צעירים כאיברים שלמים יכול לשמש כחלופה. יתר על כן, שולט פעם אחת, את היכולת לנתח אשכים גלמים וציסטות נבט אונליין מבודד סופו של דבר תאפשר ליישומים נוספים באמצעות ציסטות בודדות כמקור הומוגנית, אם כי אוכלוסייה קטנה, תא. לדוגמא, זה ובכך ניתן לבצע RT-qPCR לנתח את הרגולציה תעתיק של גנים ספציפיים בשלבים מוגדרים של יצירת תאי זרע, כפי שכבר הוכיחו <sup&gt; 15.

הפיתוח של תאי נבט זכר של מינים רבים הוא תהליך רציף. הוא מאופיין על ידי סדרה של אירועים מכריעים שמגיעה לשיאו ביצירת תאי הזרע מורפולוגית וepigenetically מאוד מיוחדים. בmelanogaster דרוזופילה, תאי גזע נבט אונליין בקצה של מתרס האשכים סימטרי להצמיח תאים חדשים גזע וspermatogonium, כלומר, תא הבת שמחויב להתמיינות (ראה איור 1 לסקירה) 1,2 . Spermatogonium עובר ארבעה סבבים של חטיבות המיטוטי ו, עם תחילתה של מיוזה, שלב של צמיחה מרשימה ופעילות תעתיק נקרא שלב spermatocyte. התאים שמקורם spermatogonium אחד להישאר מחוברים זה לזה ולהתפתח כחבילה העטופה מסונכרנת על ידי שני תאים סומטיים מבנה המכונים ציסטה. לאחר השלמת מיוזה, המורפולוגיה של תאי נבט הגבריים לחלוטיןארגון מחדש (מוצג באופן סכמטי באיור 1). בתחילה, spermatids העגול להאריך כדי ליצור את מבנה הראש הידרודינמית, ושוטון מתפתח. סופו של דבר, תאי הזרע מופרדים זה מזה על ידי מנגנון הנקרא אינדיבידואליזציה 3 מורכב, הקשורים לאפופטוזיס - 5. במינים רבים, כולל melanogaster דרוזופילה ומיני יונקים, השינויים מורפולוגיים של תאי הנבט מלווים בהתארגנות אפיגנטיים מדהימה של הכרומטין נבט אונליין הזכר הפלואידים, נקראים מתג היסטון לprotamine (מתג HP) 6 - 9. אולי כמעט כל היסטון הקנונים ומולקולות היסטון-variant רבים יוסרו DNA ומוחלפים על ידי חלבונים קטנים בסיסיים, protamines, וכתוצאה מכך מבנה nucleoprotamine הקומפקטי מאוד ספציפי להכרומטין זרע בוגר. מאפיינים כלליים של מתג HP הם tהוא ההחלפה של ההיסטונים הקנונית הראשונה לפי חלופות היסטון, לאחר מכן על ידי חלבוני מעבר, ולבסוף על ידי protamines. כל זה מלווה בכמה שינויים לסימנים אפיגנטיים, כגון עלייה ברמות acetylation של H4 היסטון רק לפני הסרת היסטון 7,10 - 12. רוב, אם לא כולם, של התהליכים הנ&quot;ל הם חיוניים לפיתוח זרע בוגר, פורה באופן מלא. זה נכון לא רק בדרוזופילה, אלא גם בבני אדם, כמו מניות יצירת תאי זרע של יונקים כמות ניכרת של דמיון עם 1,8,9 מערכת חסרת חוליות. לומד פיתוח ניבט תא זכרי הוא הקל מאוד במערכת מודל דרוזופילה. זבובים הם גנטיים נגישים ביותר. הדור של מוטציות, כמו גם את הקמתה של זנים לטוס לבטא גני היתוך או בונה התערבות RNA לוקחת מעט מאמץ. עם זאת, במחקר של יצירת תאי זרע לאחר meiotic, השימוש במוטציותכלים גנטיים פשוטים ד יכולים להגיע גבול. ביצירת תאי זרע דרוזופילה, שעתוק מפסיק כמעט לחלוטין עם כניסתו לחטיבות meiotic. לפיכך, יצירת תאי זרע לאחר meiotic מתבסס בעיקר על mRNAs translationally המודחק ומאוחסן מסונתזים בprophase meiotic מורחב 13 - 16. לכן, כלים כמו התערבות RNA או השימוש במוטציות שאינן מותנות אינם מתאימים ללימוד באופן ספציפי את תפקידי פוסט meiotic של מוצרי גן שגם למלא את הפונקציות חיוניות בהתפתחות תאי נבט מראש meiotic או meiotic. אחד יתרונות של דרוזופילה שניתן לנצל במקרים כאלה הוא היכולת של אשכים שלמים גזורים ואפילו ציסטות של תאי נבט לפתח vivo לשעבר במדיום תרבות 4,12,17 - 20. הנתיחה וטיפוח אשכים או ציסטות נבט אונליין מאפשר תצפית מיקרוסקופית לא רק של פיתוח נבט תאים בתאים חי, אךסימפוני השימוש במבחנים תרופתיים עם, למשל, מעכבים של אנזים מתחמים כגון acetyltransferases היסטון (כובעים), deacetylases היסטון (HDACs), topoisomerases, או פרוטאזום. לפיכך, ניתן לתפעל פונקציות האנזימטית במהלך יצירת תאי זרע לאחר meiotic ולעקוב אחר תוצאות התפתחותיות ללא קשר לפונקציות עובריים, טרום meiotic, או meiotic 4,12. במבחנים תרופתיים, נתחנו בעבר את לוקליזציה acetylation תלוי של חלבון bromodomain במהלך prophase meiotic כמו גם את הרלוונטיות של רמות acetylation היסטון עבור מתג HP אפיגנטיים ביצירת תאי זרע לאחר meiotic באמצעות מעכבים ספציפיים מיקוד כובעים וHDACs 12,21. מיקוד מתג HP במבחנים אלה התאפשר על ידי שימוש במתח זבוב שמבטא את הגנים ההיתוך histone2AvD-RFP וprotamineB-eGFP 12,22 בדפוסי אנדוגני, והתצפית שspermatids הראשון באשכי גלמים עובר דרך מתג HP בין 24 ו48 שעות 12 APF. הפרוטוקול המובא מתאר את הנתיחה של אשכים וציסטות מגלמי דרוזופילה, תנאי התרבות, וassay תרופתי עם אשכים גלמים שלמים. לצורך כך, אשכים גלמי בסביבות 24 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) הם גזורים (ראו איורים 1 ו -2). בשלב זה, האשכים לא יצרו קשרים לרקמות אחרות ומוקפים רק מעטפת חיצונית דקה, אשר מאפשרת חדירה טובה יותר על ידי תרכובות מעכב 23,24. האשכים הם איברי bean- או בצורת אגס שניתן לנקוט בקלות לתוך התרבות. אשכים אלה הם גזורים, תרבותיים, ושטופלו במעכבי ספציפיים. בהמשך לכך, ההשפעה של מעכבים מנוטרים באמצעות immunofluorescence ניתוחים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של ביטוי חלבון היתוך, ועל ידי השוואה של morphol הגרעיניogy של תאי הנבט שטופלו לזה של תאי נבט שלא טופלו. התנאים שהוצגו בפרוטוקול זה גם מאפשרים הדמיה חיה של פיתוח אשכים וציסטות נבט אונליין בתרבות.

<table><tbody><tr><td>Anacardic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>172050</td><td>brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td></tr><tr><td>Anti-acetyl-Histone H4</td><td>Merck Millipore</td><td>06-598</td><td>brand: Upstate</td></tr><tr><td>AxioCam MRm&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver.Z1 inverted microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5-Inox forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optical&amp;nbsp; illuminator</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glass Bottom Microwell Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td><td>Dianova</td><td>711-175-152</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B1155</td><td></td></tr><tr><td>Inoculation loop or pin holder</td><td></td><td></td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td><td>Plano GmbH</td><td>N5018</td><td>In our hands both of these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td></tr><tr><td>Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td><td>Plano GmbH</td><td>N5014</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell plates, 24-wells</td><td>Becton Dickinson</td><td>351147</td><td>brand: Falcon</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>invitrogen</td><td>15070</td><td>brand: Gibco</td></tr><tr><td>Shields and Sang M3 Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S8398</td><td></td></tr><tr><td>Stemi SV6 binocular</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

במהלך יצירת תאי זרע ביונקים ובmelanogaster דרוזופילה, תאי נבט זכר לפתח בסדרה של תהליכים התפתחותיים חיוניים. זה כולל בידול מאוכלוסיית תאי גזע, הגברה mitotic, ומיוזה. בנוסף, בתאי נבט שלאחר meiotic לעבור תהליך דרמטי מורפולוגיים עיצוב מחדש, כמו גם שינוי תצורה אפיגנטיים גלובלית של הכרומטין-מתג היסטון לprotamine שורת הנבט. לומד את התפקיד של חלבון בתהליך יצור תאי זרע לאחר meiotic באמצעות mutagenesis או כלים גנטיים אחרים פגע לעתים קרובות על ידי עוברי חיונית, מראש meiotic, או פונקציות meiotic של החלבון הנחקר. פנוטיפ פוסט meiotic של מוטציה של חלבון כזה יכול להיות מוסתר על דרך לחסום התפתחות מוקדמת יותר, או הפרשנות של פנוטיפ יכולה להיות מסובכת. אורגניזם המודל תסיסנית מציע מעקף לבעיה זו: אשכים שלמים ואפילו ציסטות של תאי נבט גזורים מהגלמים מוקדם יכולות לפתח vivo לשעבר במדיום התרבות. תוך שימוש בתרבויות כזה מאפשר הדמיה מיקרוסקופית של תאי חיים נבט באשכים ושל ציסטות נבט אונליין. חשוב לציין, האשכים טיפחו ותאי נבט גם להיות נגישים למעכבים תרופתיים, וכך לאפשר מניפולציה של פונקציות האנזימטית במהלך יצירת תאי זרע, ובכלל זה שלבים שלאחר meiotic. הפרוטוקול המובא מתאר כיצד לנתח ולעבד את האשכים גלמים וציסטות נבט אונליין. מידע על התפתחות אשכים גלמים ותנאי תרבות ניתנת לצד נתוני ההדמיה מיקרוסקופ של אשכים חיים וציסטות נבט אונליין בתרבות. אנו גם מתארים assay תרופתי ללמוד יצירת תאי זרע לאחר meiotic, שהודגם על ידי assay מיקוד מתג היסטון לprotamine באמצעות חומצת anacardic מעכב acetyltransferase היסטון. בעיקרון, שיטת טיפוח זו יכולה להיות מותאמת לתת מענה רב oשאלות מחקר יס ביצירת תאי זרע לפני ואחרי meiotic.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment at JoVE.com

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.4K Views.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Video: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Neuroscience

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

בידוד תסיסנית melanogaster האשכים

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video