Este trabajo fue apoyado por becas de investigación (NIH / NIDCD 009269, 012831 y ARRA administrativos suplemento subvenciones NIH) a Lin Weihong. Agradecemos especialmente al Sr. Tim Ford en UMBC por su asistencia técnica en la grabación en vídeo y procesamiento. También queremos dar las gracias al Dr. Blumberg Daphne, la Sra. Chere Petty en UMBC y el Sr. Nicholas McCollum de Olympus America Inc. por su asistencia equipos de videograbación.

1. Ratón nariz Preparación Se utilizó adultos C57BL / 6 ratones de fondo en este estudio. Todo el cuidado de los animales y los procedimientos son aprobados por el Cuidado de Animales y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore. 1.1 La adquisición de la nariz de los ratones paraformaldahyde fijos <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Figura 1. Los huesos de un cráneo de ratón A:. Vista dorsal del cráneo B:. Vista ventral del cráneo con la mandíbula eliminado. El cráneo fue preparado a partir de un ratón viejo de 40 días. Huesos individuales son de color para una mejor visualización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol><li> Perfusión transcardially fijar ratones individuales después de the protocolo de Lin, et al., (2008) 16. Brevemente, los ratones fueron profundamente anestesiados con tribromoetanol (Avertin 250 mg / g de peso corporal), perfundido transcardialmente con tampón fosfato 0,1 M (PB, 30-50 ml), seguido de un tampón fosfato fijador que contienen 3% de paraformaldehído, 19 mM de L-lisina monohidrocloruro, y 0.23% m-peryodato sódico (aproximadamente 35-50 ml). También se pueden seguir los pasos en el artículo Jove para la perfusión animales 35. </li><li> Use un par de tijeras para cortar la mandíbula (o de la mandíbula inferior) y quitar la piel de la cabeza. </li><li> Separar toda la cabeza del resto del cuerpo. </li><li> Retire el paladar. También, limpiar y eliminar el tejido conjuntivo y el músculo restante sobre la superficie del cráneo para obtener la muestra se muestra en las Figuras 1A y 1B. </li><li> Bajo un microscopio de disección, quitar el hueso del cráneo que cubre el cerebro y los bulbos olfatorios. Se quita el exceso de tejido y huesos. Note, para la preparación del tejido extendida en la que el cerebro y la nariz permanecen conectados, sólo se eliminan los huesos del cráneo. Para los experimentos de inmunohistoquímica, el tejido fue después de la fijada durante 1,5 horas y se transfirió a 0,1 M tampón fosfato salino (PBS) con 25% de sacarosa durante la noche. Tejido nasal se debe mantener humidificado a lo largo de la disección por inmersión en la solución de sacarosa tamponada varias veces. </li></ol> 1.2 La adquisición de la nariz de los ratones recién sacrificados <ol><li> Ratones individuales se transfirieron a una jaula limpia y se expusieron a 2 de gas CO, que fue seguido por dislocación cervical 5 min después de que el último aliento. Para reducir la sangre en el tejido de la nariz, usar un par de tijeras para abrir el pecho y cortar el corazón para permitir que la sangre fluya. </li><li> Repita los pasos 1.1.2 al 1.1.5, excepto el post-fijación y crioprotección con un 25% de sacarosa. La muestra debe mantenerse humidificado y se mantiene con solución salina de Tyrode que contiene (en mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1 de CaCl 2, piruvato de Na 10, 10 D-glucosa, y 10 N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanosulfónico tampón de ácido (HEPES, ajustado a pH 7,4). Alternativamente, doblar una pieza de Kimwipes, remojo con una solución de Tyrode, y el lugar por debajo de la muestra, mientras que la disección y, ocasionalmente, sumergir la muestra en la solución de Tyrode o soltar algo de solución sobre el tejido para mantenerlo humidificado para mantener la viabilidad de las células y tejidos . </li></ol> 2. Incisivo, anterior Vomer y hueso maxilar Removal <ol><li> Empezar desde un punto de vista ventral. Localice el hueso vómer y romper el hueso vómer largo de su longitud usando una gubia o fórceps de dientes para romper el ventral mayor parte del hueso. </li><li> Con unas pinzas dentadas, retire los segmentos rotos del hueso vómer por navegan suavemente los fragmentos de hueso de distancia desde el órgano vomeronasal (VNO). Tenga en cuenta, para los ratones de menos de un mes de edad, o si sólo está interesado en el Ministerio de Educación, estos dos steps se puede omitir. </li><li> Sostenga firmemente la cabeza con unas pinzas. Utilice la gubia para romper la parte delantera de ambos incisivos y la región articulado del maxilar anterior entre los dos incisivos y el hueso vómer. </li><li> Romper la porción ventral del maxilar a la derecha en la región justo anterior al arco cigomático hasta el nivel de la placa dorsal cigomático. </li><li> Dé la vuelta a la nariz de un punto de vista dorsal. Utilice la gubia para romper el anterior maxilar derecha de la placa cigomática dorsal. Todo el anterior maxilar superior derecho de la placa cigomática debe estar suelto. Utilice las pinzas finas para separar con cuidado el tejido nasal subyacente al maxilar, y luego levante suavemente el fragmento óseo. </li><li> Repetir los pasos 2.4 y 2.5 para aflojar el incisivo izquierdo y el maxilar anterior izquierda y eliminarlos después de que el hueso nasal se ha eliminado. </li></ol> 3. Hueso Nasal y Dorsal Extracción de la placa cigomática <ol><li> Utilice el fórceps o dentada, las pinzas gubias para volvermover el resto de los huesos frontales justo caudal a los huesos nasales. Una vez retirada la pieza de hueso, la parte caudal del hueso nasal se puede agarrar con fórceps. </li><li> Usa las pinzas gubias para romper la porción anterior del arco cigomático, que está conectado a la placa cigomático. </li><li> Tome las pinzas finas en el borde lateral del extremo dorsal de la placa cigomático y estirar suavemente el hueso y retirarlo. Si el hueso no está suelta, la gubia para apretar suavemente para aflojar para su eliminación. </li><li> Utilice las pinzas finas o una hoja de afeitar para aflojar la sutura medial entre los huesos nasales derecha e izquierda. </li><li> Utilice el dentada fórceps para agarrar el extremo caudal del hueso nasal derecha. Suavemente mueva el hueso de lado a lado para separarlo de los tejidos subyacentes. Es útil para mover las pinzas a lo largo de la tercera caudal del hueso nasal para mover el lado del hueso a lado. Como se separa el hueso nasal, levante lentamente el hueso del extremo caudal. </li><li> Mientras que tque hueso nasal está ligeramente levantada, incline lateralmente el hueso para revelar un saliente lateral del hueso que se alinearon con el tejido epitelial respiratoria delgada. Use unas pinzas finas para liberar este tejido suavemente desde el hueso nasal. Continúe levantando el hueso nasal. Cuando el hueso está completamente separado del tejido subyacente, utilizar unas tijeras para cortar el hueso nasal en el extremo rostral. </li><li> Repita los pasos 3.1, 3.5 y 3.6 para la extracción del hueso nasal izquierdo. </li><li> Repetir los pasos 3.2 y 3.3 para el lado izquierdo de la nariz. </li></ol> 4. Lateral Extracción de la placa cigomática <ol><li> Retire la placa cigomática un lado a la vez. De cualquier placa cigomático puede quitar primero. </li><li> Desde un punto de vista ventral, romper el maxilar inferior hasta el arco cigomático hasta las vacaciones llega el arco cigomático. </li><li> Desde un punto de vista dorsal, agarra suavemente el arco cigomático y levante hacia delante y lateral. Si la placa cigomático está aún en cualquier tejido, tome la multafórceps y cortar suavemente las conexiones entre el tejido y el hueso. </li><li> Repita este procedimiento para la placa cigomático en el otro lado de la nariz. </li></ol> 5. Orbit Bone Removal <ol><li> Desde un punto de vista ventral, romper el hueso palantine entre los molares de la nariz. </li><li> Utilice la gubia para romper las 3 molares y el maxilar en cada lado de la nariz. </li><li> Romper y extraer todos los trozos gruesos restantes de hueso ventral y posterior a los cornetes en cada lado de la nariz. </li></ol> 6. Remoción del hueso etmoidal <ol><li> Romper cualquier porción del hueso etmoides que sobresale caudal a los cornetes. Esto es necesario para evitar la pérdida de tejido cornete cuando la eliminación de piezas finas de hueso etmoides que cubren los cornetes. </li><li> En el lado derecho de la nariz, coloque las pinzas finas en el borde anterior del hueso etmoides y retírela. Si una parte de los restos óseos, repetir este procedimiento hasta que todosel hueso delgada que cubre los cornetes se ha eliminado. Los huesos cornete no necesitan ser eliminados en la mayoría de las preparaciones. En ratones de edad avanzada, la placa cribiforme vuelve quebradizo. Si se necesita cryosectioning del tejido nasal, extraer pequeños trozos de la placa con unas pinzas finas para reducir el daño potencial causado por el hueso. </li><li> Repita el paso 6.2) para el lado izquierdo de la nariz. </li><li> Retire los fragmentos de huesos que quedan antes de la corte. Nota: en los animales de más de un año de edad, la región posterodorsal del hueso del tabique es algo grueso y duro. Se puede quitar esta parte mediante unas pinzas finas. Insertar la punta de las pinzas, a ambos lados del hueso para separar la parte dorsal de la médula tabique y el tejido epitelial de revestimiento. Use un par de pinzas para agarrar el hueso y mantener la muestra. Utilice otro par de pinzas para romper la parte superior del hueso de la parte cartilaginosa inferior del tabique y retírela. </li></ol><ol><li> Configure la bomba de vacío aspirador. </li><li> Coloque la nariz en un molde de inclusión. Sumerja la nariz en octubre los medios de comunicación. </li><li> Utilice una aspiradora para eliminar las burbujas de aire atrapadas en el tejido de la nariz. Este proceso puede tardar hasta 5 min. </li><li> Después de eliminar las burbujas de aire, ajustar el tejido en la orientación deseada. </li><li> Congelar los PTU y el tejido en el molde utilizando hielo seco. El tejido incrustado a continuación, se puede cryosectioned inmediatamente o se almacenó a -80 ° C para su uso futuro. </li></ol>

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R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí, hemos demostrado un procedimiento paso a paso para aislar el tejido olfativo y respiratoria intacta de la nariz del ratón mediante la eliminación secuencial de los huesos que rodean sin dañar el tejido de abajo. Se demuestra que la eliminación de hueso cuidadosa puede conservar incluso los tejidos más delicados en su totalidad. También compartimos la visión de las posibles modificaciones de esta técnica, en la que nos aislamos el cerebro y los tejidos nasales juntos para preservar la conexión nerviosa. E...

La cavidad nasal de mamíferos contiene varios tipos de tejidos y órganos que sirven para funciones distintas. La cavidad nasal constituye la parte de entrada de las vías respiratorias superiores, que permite el desplazamiento de aire dentro y fuera de los pulmones. El aire inhalado pasa a través de la cavidad nasal donde se somete a temperatura y humedad acondicionado 1, así como la limpieza o el filtrado para eliminar las sustancias irritantes y tóxicos y microorganismos infecciosos 2. Ambos tratamientos son realizados por epitelio nasal y los tejidos subepiteliales, incluyendo glándulas y vasos y son fundamentales para la protección de las vías respiratorias inferiores y los pulmones. Además de su papel en la respiración y la defensa epitelial, tejido de la nariz también contiene aparatos sensoriales periféricas de los sistemas olfativos y del trigémino, que detectan una amplia gama de sustancias químicas en el aire que pasa. Dependiendo de qué sistema se activa, la detección sensorial de productos químicos en la nariz puede obtener ya seaun sentido del olfato, irritación, o dolor 3,4. El sistema olfativo periférico es complejo y compuesto de varios órganos sensoriales olfativas anatómicamente separados dentro de la cavidad nasal. Entre ellos, el epitelio olfativo principal (MOE) es la más grande, lo que constituye aproximadamente el 45-52% del epitelio nasal en roedores 5 y está ubicado en la región posterior. En la región anteroventral, hay un par de estructuras tubulares conocidos como el órgano vomeronasal 6, que se sientan a lo largo de cada lado del tabique nasal. Dos pequeñas agrupaciones adicionales de las neuronas sensoriales olfativas, conocidos como el órgano septal de Masera 7,8 y el ganglio Gruneberg 9, residen a lo largo del tabique ventral y dorsal de la región de entrada de la cavidad nasal, respectivamente. Estos órganos periféricos contienen neuro-epitelial con características distintivas en la morfología, la expresión de marcadores de células y la función fisiológica. Juntos detectar miles de oloresmoléculas con exquisita sensibilidad 10-12. Además de los órganos sensoriales olfativas, la cavidad nasal también alberga otros sistemas sensoriales. Se sabe que las fibras del nervio trigémino peptidérgicas están presentes en el epitelio nasal, especialmente el epitelio respiratorio 13,14. Algunas de estas fibras detectar sustancias químicas irritantes y tóxicos, y son responsables de iniciar los reflejos protectores, tales como tos y los estornudos 4,15. Compuestos olorosos y amargo irritantes también pueden ser detectados por una población recientemente descubierta de células quimiosensoriales solitarios (SCC), muchos de los cuales están inervadas por fibras nerviosas del trigémino 16-19. Estos SCC se encuentran en mayor densidad en la zona de entrada de la cavidad nasal y de los conductos de entrada vomeronasal, dando a entender que ellos también pueden tener una función protectora 16-18. Por lo tanto, epitelio nasal puede diferir sustancialmente en función, la morfología y composición de las células en función de sulocalizaciones anatómicas. Incluso dentro de una única y especializada epitelio, hay diferencias regionales. El Ministerio de Educación es un ejemplo de ello. Las líneas MOE varios cornetes, que son complicados y las estructuras curvadas. Debido a ellos, diferentes regiones de la experiencia de diferentes tasas de flujo de aire del Ministerio de Educación y, por tanto, diferente de difusión y tasas de eliminación de moléculas de olor en el aire 20. Además, se sabe que las neuronas sensoriales olfativas (OSN) que expresan un receptor de olor que se encuentran en una de las cuatro zonas de eludido el MOE 21,22. ¿Cómo afecta esta diferencia ubicación es en gran parte no se conoce la respuesta de una OSN a odorantes. Además, algunas poblaciones OSN exhiben preferencia regional. OSN guanililciclasa-D (GC-C) que expresan tienen distribuciones zonales a favor de las regiones cul-de-sac de las ectoturbinates 23,24. Más recientemente, encontramos una subpoblación de OSN canónicas que expresa transitoria receptor potencial canal M5 (trpM5) y se localiza preferentemente en las regiones laterales y ventral 25. Estos resultados indican que MOE no es uniforme. Sin embargo, ¿cómo estas diferencias regionales afectan codificación olfativas no se entiende. Esto es en parte porque la investigación fisiológica a fondo de la MOE y la nariz ha sido limitado por la dificultad de obtener intacta epitelio nasal con organización anatómica conservado con los métodos actuales. El epitelio nasal son predominantemente rodeada por los huesos anteriores del cráneo, incluyendo el nasal, maxilar superior, palatino, cigomático, y los huesos etmoidales. En ratones adultos y otros modelos de roedores, estos huesos son duros y difíciles de eliminar sin dañar el tejido nasal estrechamente asociada, sobre todo los delicados cornetes. A menudo, la descalcificación de base química se utiliza para ablandar los huesos para permitir cryosectioning de los tejidos nasales para morfológica, inmunohistoquímica y estudios de hibridación in situ, sin embargo, depending de la edad del animal, el proceso de descalcificación puede durar durante la noche hasta 7 días 24,26-28. Este tratamiento también es limitada, ya que requiere el tejido sea fijador-preservada. Además, descalcificación química puede ser duro y afectar la inmunomarcación de algunos anticuerpos sensibles 29,30. Para los estudios fisiológicos, se requiere tejido vivo, y por lo tanto, estos experimentos se llevó a cabo a menudo en OSN aislados o rodajas MOE obtenidos a partir de los recién nacidos cuyos huesos del cráneo son delgados y blandos 17,31,32. Los estudios fisiológicos pueden también utilizar preparaciones todo el montaje por incisión de la cabeza 25,33,34, pero por lo general sólo la superficie medial de la nariz es de fácil acceso, lo que limita las grabaciones fisiológicas en otras áreas. Aquí se describe un método eficaz deshuesado, manual para preparar los tejidos nasales intactos con preservada organización anatómica original y morfología. Nos quitamos secuencialmente los principales huesos de la anteriorSe necesita cráneo bajo un microscopio de disección para exponer un epitelio nasal casi en su totalidad intacta, manteniendo los huesos cornete delgadas intacta a menos que los ratones son muy antiguo y cryosectioning. También extendemos el método para preservar la conexión entre los tejidos nasales y los bulbos olfativos, así como el resto del cerebro, facilitando así el examen simultáneo de ambos circuitos periféricos y centrales. Nuestro método se puede utilizar para preparar paraformaldehído-fijo, así como fresco, tejido nasal vivo. Por lo tanto, se espera que nuestro método para facilitar los estudios morfológicos, inmunohistoquímicos y fisiológica de la respiración, el olfato, y nasales daños y enfermedades.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

La nariz de mamífero es un órgano de múltiples funciones con estructuras internas complejas. La cavidad nasal está llena de diversos epitelios, como el epitelio olfativo, respiratorias, y de células escamosas, que difieren notablemente en localizaciones anatómicas, morfología y funciones. En ratones adultos, la nariz está cubierto con varios huesos del cráneo, lo que limita el acceso experimental a las estructuras internas, especialmente las de la posterior tal como epitelio olfativo principal (MOE). Aquí se describe un método eficaz para la obtención de los tejidos nasales casi enteras intactas y con organización anatómica conservado. El uso de herramientas quirúrgicas bajo un microscopio de disección, que secuencialmente quitamos los huesos del cráneo que rodean el tejido nasal. Este procedimiento se puede realizar en ambos, cabezas de piel de ratón paraformaldehído-fijos y recién disecados. El procedimiento de deshuesado completo dura aproximadamente 20-30 min, que es significativamente más corto que el tiempo experimental requerido para convencional de química basadacalcificación. Además, se presenta un método fácil para eliminar las burbujas de aire atrapadas entre los cornetes, lo cual es crítico para la obtención de secciones horizontales o coronal o sagital delgadas intactas de la preparación del tejido nasal. Tejido nasal preparado usando nuestro método se puede utilizar para la observación de todo el montaje de todo el epitelio, así como morfológica, inmunocitoquímica, ARN la hibridación in situ, y los estudios fisiológicos, especialmente en estudios en los que la región específica de examen y la comparación son de interés.

El uso de este método, podemos obtener de manera fiable los tejidos nasales casi totalmente intacta. Figura 2A muestra una imagen de la muestra nasal adulto de una cabeza de paraformaldehído-fijo. En esta muestra, los cuatro órganos sensoriales sub-olfativas, como el Ministerio de Educación, órgano septal, el ganglio Gruneberg y VNO, están intactos. Además, el epitelio respiratorio y tejidos subepiteliales, como las glándulas y vasos, se conservan. Hemos utilizado con éxito este método en un n...

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Un método eficaz para Deshuesado Manual Preparar Intact ratón tejido nasal con la organización anatómica Conservas

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.9K vistas.  University of Maryland Baltimore County. 

Video: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Híbrido-Cut: un método de seccionamiento mejorada para muestras de tejido de la planta recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

Diferencia de potencial nasal para cuantificar el transporte de iones Trans epitelial en ratones

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

Aislamiento de intact eyeball para obtener tejido superficial ocular integral para el examen histológico y la inmunohistoquímica

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Aplicación del movimiento pasivo de la cabeza para generar aceleraciones definidas en las cabezas de roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts through the bite of infected arthropod vectors. To date, emerging or re-emerging epidemic rickettsioses remain a public health risk due to the difficulty in diagnosis, as diagnostic methods are limited and not standardized or universally accessible. Misdiagnosis resulting from a lack of recognition of the signs and symptoms may result in delayed antibiotic treatment and poor health outcomes. A comprehensive understanding of Rickettsia characteristics would ultimately improve clinical diagnosis, assessment, and treatment with improved control and prevention of the disease. 
Functional studies of rickettsial genes are crucial for understanding their role in pathogenesis. This paper describes a procedure for the electroporation of the Rickettsia parkeri strain Tate's Hell with the shuttle vector pRAM18dSFA and the selection of transformed R. parkeri in tick cell culture with antibiotics (spectinomycin and streptomycin). A method is also described for the localization of transformed R. parkeri in tick cells using confocal immunofluorescence microscopy, a useful technique for checking transformation in vector cell lines. Similar approaches are also suitable for the transformation of other rickettsiae.

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Electroporation is a rapid, broadly adopted method for introducing exogenous DNA into the genus Rickettsia. This protocol provides a useful electroporation method for the transformation of obligate intracellular bacteria in the genus Rickettsia.

Un método de electroporación para transformar Rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...