Este trabajo fue apoyado por becas de investigación (NIH / NIDCD 009269, 012831 y ARRA administrativos suplemento subvenciones NIH) a Lin Weihong. Agradecemos especialmente al Sr. Tim Ford en UMBC por su asistencia técnica en la grabación en vídeo y procesamiento. También queremos dar las gracias al Dr. Blumberg Daphne, la Sra. Chere Petty en UMBC y el Sr. Nicholas McCollum de Olympus America Inc. por su asistencia equipos de videograbación.

1. Ratón nariz Preparación Se utilizó adultos C57BL / 6 ratones de fondo en este estudio. Todo el cuidado de los animales y los procedimientos son aprobados por el Cuidado de Animales y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore. 1.1 La adquisición de la nariz de los ratones paraformaldahyde fijos <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Figura 1. Los huesos de un cráneo de ratón A:. Vista dorsal del cráneo B:. Vista ventral del cráneo con la mandíbula eliminado. El cráneo fue preparado a partir de un ratón viejo de 40 días. Huesos individuales son de color para una mejor visualización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol><li> Perfusión transcardially fijar ratones individuales después de the protocolo de Lin, et al., (2008) 16. Brevemente, los ratones fueron profundamente anestesiados con tribromoetanol (Avertin 250 mg / g de peso corporal), perfundido transcardialmente con tampón fosfato 0,1 M (PB, 30-50 ml), seguido de un tampón fosfato fijador que contienen 3% de paraformaldehído, 19 mM de L-lisina monohidrocloruro, y 0.23% m-peryodato sódico (aproximadamente 35-50 ml). También se pueden seguir los pasos en el artículo Jove para la perfusión animales 35. </li><li> Use un par de tijeras para cortar la mandíbula (o de la mandíbula inferior) y quitar la piel de la cabeza. </li><li> Separar toda la cabeza del resto del cuerpo. </li><li> Retire el paladar. También, limpiar y eliminar el tejido conjuntivo y el músculo restante sobre la superficie del cráneo para obtener la muestra se muestra en las Figuras 1A y 1B. </li><li> Bajo un microscopio de disección, quitar el hueso del cráneo que cubre el cerebro y los bulbos olfatorios. Se quita el exceso de tejido y huesos. Note, para la preparación del tejido extendida en la que el cerebro y la nariz permanecen conectados, sólo se eliminan los huesos del cráneo. Para los experimentos de inmunohistoquímica, el tejido fue después de la fijada durante 1,5 horas y se transfirió a 0,1 M tampón fosfato salino (PBS) con 25% de sacarosa durante la noche. Tejido nasal se debe mantener humidificado a lo largo de la disección por inmersión en la solución de sacarosa tamponada varias veces. </li></ol> 1.2 La adquisición de la nariz de los ratones recién sacrificados <ol><li> Ratones individuales se transfirieron a una jaula limpia y se expusieron a 2 de gas CO, que fue seguido por dislocación cervical 5 min después de que el último aliento. Para reducir la sangre en el tejido de la nariz, usar un par de tijeras para abrir el pecho y cortar el corazón para permitir que la sangre fluya. </li><li> Repita los pasos 1.1.2 al 1.1.5, excepto el post-fijación y crioprotección con un 25% de sacarosa. La muestra debe mantenerse humidificado y se mantiene con solución salina de Tyrode que contiene (en mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 1 de CaCl 2, piruvato de Na 10, 10 D-glucosa, y 10 N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanosulfónico tampón de ácido (HEPES, ajustado a pH 7,4). Alternativamente, doblar una pieza de Kimwipes, remojo con una solución de Tyrode, y el lugar por debajo de la muestra, mientras que la disección y, ocasionalmente, sumergir la muestra en la solución de Tyrode o soltar algo de solución sobre el tejido para mantenerlo humidificado para mantener la viabilidad de las células y tejidos . </li></ol> 2. Incisivo, anterior Vomer y hueso maxilar Removal <ol><li> Empezar desde un punto de vista ventral. Localice el hueso vómer y romper el hueso vómer largo de su longitud usando una gubia o fórceps de dientes para romper el ventral mayor parte del hueso. </li><li> Con unas pinzas dentadas, retire los segmentos rotos del hueso vómer por navegan suavemente los fragmentos de hueso de distancia desde el órgano vomeronasal (VNO). Tenga en cuenta, para los ratones de menos de un mes de edad, o si sólo está interesado en el Ministerio de Educación, estos dos steps se puede omitir. </li><li> Sostenga firmemente la cabeza con unas pinzas. Utilice la gubia para romper la parte delantera de ambos incisivos y la región articulado del maxilar anterior entre los dos incisivos y el hueso vómer. </li><li> Romper la porción ventral del maxilar a la derecha en la región justo anterior al arco cigomático hasta el nivel de la placa dorsal cigomático. </li><li> Dé la vuelta a la nariz de un punto de vista dorsal. Utilice la gubia para romper el anterior maxilar derecha de la placa cigomática dorsal. Todo el anterior maxilar superior derecho de la placa cigomática debe estar suelto. Utilice las pinzas finas para separar con cuidado el tejido nasal subyacente al maxilar, y luego levante suavemente el fragmento óseo. </li><li> Repetir los pasos 2.4 y 2.5 para aflojar el incisivo izquierdo y el maxilar anterior izquierda y eliminarlos después de que el hueso nasal se ha eliminado. </li></ol> 3. Hueso Nasal y Dorsal Extracción de la placa cigomática <ol><li> Utilice el fórceps o dentada, las pinzas gubias para volvermover el resto de los huesos frontales justo caudal a los huesos nasales. Una vez retirada la pieza de hueso, la parte caudal del hueso nasal se puede agarrar con fórceps. </li><li> Usa las pinzas gubias para romper la porción anterior del arco cigomático, que está conectado a la placa cigomático. </li><li> Tome las pinzas finas en el borde lateral del extremo dorsal de la placa cigomático y estirar suavemente el hueso y retirarlo. Si el hueso no está suelta, la gubia para apretar suavemente para aflojar para su eliminación. </li><li> Utilice las pinzas finas o una hoja de afeitar para aflojar la sutura medial entre los huesos nasales derecha e izquierda. </li><li> Utilice el dentada fórceps para agarrar el extremo caudal del hueso nasal derecha. Suavemente mueva el hueso de lado a lado para separarlo de los tejidos subyacentes. Es útil para mover las pinzas a lo largo de la tercera caudal del hueso nasal para mover el lado del hueso a lado. Como se separa el hueso nasal, levante lentamente el hueso del extremo caudal. </li><li> Mientras que tque hueso nasal está ligeramente levantada, incline lateralmente el hueso para revelar un saliente lateral del hueso que se alinearon con el tejido epitelial respiratoria delgada. Use unas pinzas finas para liberar este tejido suavemente desde el hueso nasal. Continúe levantando el hueso nasal. Cuando el hueso está completamente separado del tejido subyacente, utilizar unas tijeras para cortar el hueso nasal en el extremo rostral. </li><li> Repita los pasos 3.1, 3.5 y 3.6 para la extracción del hueso nasal izquierdo. </li><li> Repetir los pasos 3.2 y 3.3 para el lado izquierdo de la nariz. </li></ol> 4. Lateral Extracción de la placa cigomática <ol><li> Retire la placa cigomática un lado a la vez. De cualquier placa cigomático puede quitar primero. </li><li> Desde un punto de vista ventral, romper el maxilar inferior hasta el arco cigomático hasta las vacaciones llega el arco cigomático. </li><li> Desde un punto de vista dorsal, agarra suavemente el arco cigomático y levante hacia delante y lateral. Si la placa cigomático está aún en cualquier tejido, tome la multafórceps y cortar suavemente las conexiones entre el tejido y el hueso. </li><li> Repita este procedimiento para la placa cigomático en el otro lado de la nariz. </li></ol> 5. Orbit Bone Removal <ol><li> Desde un punto de vista ventral, romper el hueso palantine entre los molares de la nariz. </li><li> Utilice la gubia para romper las 3 molares y el maxilar en cada lado de la nariz. </li><li> Romper y extraer todos los trozos gruesos restantes de hueso ventral y posterior a los cornetes en cada lado de la nariz. </li></ol> 6. Remoción del hueso etmoidal <ol><li> Romper cualquier porción del hueso etmoides que sobresale caudal a los cornetes. Esto es necesario para evitar la pérdida de tejido cornete cuando la eliminación de piezas finas de hueso etmoides que cubren los cornetes. </li><li> En el lado derecho de la nariz, coloque las pinzas finas en el borde anterior del hueso etmoides y retírela. Si una parte de los restos óseos, repetir este procedimiento hasta que todosel hueso delgada que cubre los cornetes se ha eliminado. Los huesos cornete no necesitan ser eliminados en la mayoría de las preparaciones. En ratones de edad avanzada, la placa cribiforme vuelve quebradizo. Si se necesita cryosectioning del tejido nasal, extraer pequeños trozos de la placa con unas pinzas finas para reducir el daño potencial causado por el hueso. </li><li> Repita el paso 6.2) para el lado izquierdo de la nariz. </li><li> Retire los fragmentos de huesos que quedan antes de la corte. Nota: en los animales de más de un año de edad, la región posterodorsal del hueso del tabique es algo grueso y duro. Se puede quitar esta parte mediante unas pinzas finas. Insertar la punta de las pinzas, a ambos lados del hueso para separar la parte dorsal de la médula tabique y el tejido epitelial de revestimiento. Use un par de pinzas para agarrar el hueso y mantener la muestra. Utilice otro par de pinzas para romper la parte superior del hueso de la parte cartilaginosa inferior del tabique y retírela. </li></ol><ol><li> Configure la bomba de vacío aspirador. </li><li> Coloque la nariz en un molde de inclusión. Sumerja la nariz en octubre los medios de comunicación. </li><li> Utilice una aspiradora para eliminar las burbujas de aire atrapadas en el tejido de la nariz. Este proceso puede tardar hasta 5 min. </li><li> Después de eliminar las burbujas de aire, ajustar el tejido en la orientación deseada. </li><li> Congelar los PTU y el tejido en el molde utilizando hielo seco. El tejido incrustado a continuación, se puede cryosectioned inmediatamente o se almacenó a -80 ° C para su uso futuro. </li></ol>

<ol><li>Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+ability+of+the+nose+to+warm+and+humidify+inspired+air%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air.</a> Rhinology. 45, 102-111 (2007).</li>
<li>Bjermer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nose+as+an+air+conditioner+for+the+lower+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">The nose as an air conditioner for the lower airways.</a> Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).</li>
<li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413, 211-218 (2001).</li>
<li>Bryant, B., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBryant%2C+B+%22Chemisthesis%3A+The+common+chemical+sense%22">Chemisthesis: The common chemical sense</a>. , 2nd, Wiley-Liss. (2000).</li>
<li>Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphometry+of+the+nasal+cavity+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice.</a> J. Anat. 135, 83-88 (1982).</li>
<li>Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+and+function+of+the+vomeronasal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organization and function of the vomeronasal system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).</li>
<li>Rodolfo-Masera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Su+l%27esquoestizenza+di+un+particulare+organo+olfacttivo+nel+setto+nasale+della+cavia+e+di+altri+roditori%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ital.+Anat.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori.</a> Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).</li>
<li>Levai, O., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+pattern+of+nerve+fibers+from+the+septal+organ%3A+DiI-tracing+studies+with+transgenic+OMP+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+biology%22%5BJournal%5D)">Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice.</a> Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).</li>
<li>Storan, M. J., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septal+organ+of+Gruneberg+is+part+of+the+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system.</a> J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).</li>
<li>Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+views+on+the+distinct+but+related+roles+of+the+main+and+accessory+olfactory+systems+in+responsiveness+to+chemosensory+signals+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Behav%22%5BJournal%5D)">Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice.</a> Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).</li>
<li>Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sense+of+smell%3A+multiple+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The sense of smell: multiple olfactory subsystems.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).</li>
<li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li>
<li>Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+substance+P-+and+CGRP-immunoreactive+nerve+fibers+in+the+nasal+epithelium+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents.</a> J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).</li>
<li>Papka, R. E., Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+substance-P-immunoreactive+nerves+with+the+murine+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa.</a> Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).</li>
<li>Baraniuk, J. N., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasonasal+reflexes%2C+the+nasal+cycle%2C+and+sneeze%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Allergy+Asthma+Rep%22%5BJournal%5D)">Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze.</a> Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).</li>
<li>Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM5-expressing+solitary+chemosensory+cells+respond+to+odorous+irritants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants.</a> J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).</li>
<li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+microvillous+cells+in+the+mouse+main+olfactory+epithelium+and+effect+of+acetylcholine+on+olfactory+sensory+neurons+and+supporting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells.</a> J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).</li>
<li>Finger, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solitary+chemoreceptor+cells+in+the+nasal+cavity+serve+as+sentinels+of+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+solitary+chemoreceptor+cell+responses+to+bitter+and+trigeminal+stimulants+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro.</a> J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).</li>
<li>Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+modeling+of+turbulent+and+laminar+airflow+and+odorant+transport+during+sniffing+in+the+human+and+rat+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose.</a> Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).</li>
<li>Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zonal+organization+of+odorant+receptor+gene+expression+in+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium.</a> Cell. 73, 597-609 (1993).</li>
<li>Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+segregation+of+odorant+receptor+expression+in+the+mammalian+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium.</a> Cell. 74, 309-318 (1993).</li>
<li>Fulle, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+guanylyl+cyclase+expressed+specifically+in+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).</li>
<li>Juilfs, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+olfactory+neurons+that+selectively+express+cGMP-stimulated+phosphodiesterase+%28PDE2%29+and+guanylyl+cyclase-D+define+a+unique+olfactory+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).</li>
<li>Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odors+detected+by+mice+deficient+in+cyclic+nucleotide-gated+channel+subunit+A2+stimulate+the+main+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system.</a> The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).</li>
<li>Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+two-+and+three-color+fluorescent+RNA+in+situ+hybridization+of+the+main+and+accessory+olfactory+epithelia+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocyt%22%5BJournal%5D)">Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse.</a> J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).</li>
<li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).</li>
<li>Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeltaNp63+regulates+stem+cell+dynamics+in+the+mammalian+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).</li>
<li>Matthews, J. B., Mason, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+decalcifying+agents+on+immunoreactivity+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Histochem J. 16, 771-787 (1984).</li>
<li>Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+decalcification+agents+on+immunoreactivity+of+cellular+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens.</a> J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).</li>
<li>Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+store-mediated+signaling+in+sustentacular+cells+of+the+mouse+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium.</a> Glia. 57, 634-644 (2009).</li>
<li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+main+olfactory+system+in+social+recognition+of+major+histocompatibility+complex+peptide+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).</li>
<li>Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+responses+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+using+the+air-phase+electroolfactogram+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850(2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+neurons+expressing+transient+receptor+potential+channel+M5+%28TRPM5%29+are+involved+in+sensing+semiochemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).</li>
<li>Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114(2008).</li>
<li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ%3A+role+of+solitary+chemosensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924(2010).</li>
<li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+G-protein+%CE%B2%CE%B3+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84(2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí, hemos demostrado un procedimiento paso a paso para aislar el tejido olfativo y respiratoria intacta de la nariz del ratón mediante la eliminación secuencial de los huesos que rodean sin dañar el tejido de abajo. Se demuestra que la eliminación de hueso cuidadosa puede conservar incluso los tejidos más delicados en su totalidad. También compartimos la visión de las posibles modificaciones de esta técnica, en la que nos aislamos el cerebro y los tejidos nasales juntos para preservar la conexión nerviosa. E...

La cavidad nasal de mamíferos contiene varios tipos de tejidos y órganos que sirven para funciones distintas. La cavidad nasal constituye la parte de entrada de las vías respiratorias superiores, que permite el desplazamiento de aire dentro y fuera de los pulmones. El aire inhalado pasa a través de la cavidad nasal donde se somete a temperatura y humedad acondicionado 1, así como la limpieza o el filtrado para eliminar las sustancias irritantes y tóxicos y microorganismos infecciosos 2. Ambos tratamientos son realizados por epitelio nasal y los tejidos subepiteliales, incluyendo glándulas y vasos y son fundamentales para la protección de las vías respiratorias inferiores y los pulmones. Además de su papel en la respiración y la defensa epitelial, tejido de la nariz también contiene aparatos sensoriales periféricas de los sistemas olfativos y del trigémino, que detectan una amplia gama de sustancias químicas en el aire que pasa. Dependiendo de qué sistema se activa, la detección sensorial de productos químicos en la nariz puede obtener ya seaun sentido del olfato, irritación, o dolor 3,4. El sistema olfativo periférico es complejo y compuesto de varios órganos sensoriales olfativas anatómicamente separados dentro de la cavidad nasal. Entre ellos, el epitelio olfativo principal (MOE) es la más grande, lo que constituye aproximadamente el 45-52% del epitelio nasal en roedores 5 y está ubicado en la región posterior. En la región anteroventral, hay un par de estructuras tubulares conocidos como el órgano vomeronasal 6, que se sientan a lo largo de cada lado del tabique nasal. Dos pequeñas agrupaciones adicionales de las neuronas sensoriales olfativas, conocidos como el órgano septal de Masera 7,8 y el ganglio Gruneberg 9, residen a lo largo del tabique ventral y dorsal de la región de entrada de la cavidad nasal, respectivamente. Estos órganos periféricos contienen neuro-epitelial con características distintivas en la morfología, la expresión de marcadores de células y la función fisiológica. Juntos detectar miles de oloresmoléculas con exquisita sensibilidad 10-12. Además de los órganos sensoriales olfativas, la cavidad nasal también alberga otros sistemas sensoriales. Se sabe que las fibras del nervio trigémino peptidérgicas están presentes en el epitelio nasal, especialmente el epitelio respiratorio 13,14. Algunas de estas fibras detectar sustancias químicas irritantes y tóxicos, y son responsables de iniciar los reflejos protectores, tales como tos y los estornudos 4,15. Compuestos olorosos y amargo irritantes también pueden ser detectados por una población recientemente descubierta de células quimiosensoriales solitarios (SCC), muchos de los cuales están inervadas por fibras nerviosas del trigémino 16-19. Estos SCC se encuentran en mayor densidad en la zona de entrada de la cavidad nasal y de los conductos de entrada vomeronasal, dando a entender que ellos también pueden tener una función protectora 16-18. Por lo tanto, epitelio nasal puede diferir sustancialmente en función, la morfología y composición de las células en función de sulocalizaciones anatómicas. Incluso dentro de una única y especializada epitelio, hay diferencias regionales. El Ministerio de Educación es un ejemplo de ello. Las líneas MOE varios cornetes, que son complicados y las estructuras curvadas. Debido a ellos, diferentes regiones de la experiencia de diferentes tasas de flujo de aire del Ministerio de Educación y, por tanto, diferente de difusión y tasas de eliminación de moléculas de olor en el aire 20. Además, se sabe que las neuronas sensoriales olfativas (OSN) que expresan un receptor de olor que se encuentran en una de las cuatro zonas de eludido el MOE 21,22. ¿Cómo afecta esta diferencia ubicación es en gran parte no se conoce la respuesta de una OSN a odorantes. Además, algunas poblaciones OSN exhiben preferencia regional. OSN guanililciclasa-D (GC-C) que expresan tienen distribuciones zonales a favor de las regiones cul-de-sac de las ectoturbinates 23,24. Más recientemente, encontramos una subpoblación de OSN canónicas que expresa transitoria receptor potencial canal M5 (trpM5) y se localiza preferentemente en las regiones laterales y ventral 25. Estos resultados indican que MOE no es uniforme. Sin embargo, ¿cómo estas diferencias regionales afectan codificación olfativas no se entiende. Esto es en parte porque la investigación fisiológica a fondo de la MOE y la nariz ha sido limitado por la dificultad de obtener intacta epitelio nasal con organización anatómica conservado con los métodos actuales. El epitelio nasal son predominantemente rodeada por los huesos anteriores del cráneo, incluyendo el nasal, maxilar superior, palatino, cigomático, y los huesos etmoidales. En ratones adultos y otros modelos de roedores, estos huesos son duros y difíciles de eliminar sin dañar el tejido nasal estrechamente asociada, sobre todo los delicados cornetes. A menudo, la descalcificación de base química se utiliza para ablandar los huesos para permitir cryosectioning de los tejidos nasales para morfológica, inmunohistoquímica y estudios de hibridación in situ, sin embargo, depending de la edad del animal, el proceso de descalcificación puede durar durante la noche hasta 7 días 24,26-28. Este tratamiento también es limitada, ya que requiere el tejido sea fijador-preservada. Además, descalcificación química puede ser duro y afectar la inmunomarcación de algunos anticuerpos sensibles 29,30. Para los estudios fisiológicos, se requiere tejido vivo, y por lo tanto, estos experimentos se llevó a cabo a menudo en OSN aislados o rodajas MOE obtenidos a partir de los recién nacidos cuyos huesos del cráneo son delgados y blandos 17,31,32. Los estudios fisiológicos pueden también utilizar preparaciones todo el montaje por incisión de la cabeza 25,33,34, pero por lo general sólo la superficie medial de la nariz es de fácil acceso, lo que limita las grabaciones fisiológicas en otras áreas. Aquí se describe un método eficaz deshuesado, manual para preparar los tejidos nasales intactos con preservada organización anatómica original y morfología. Nos quitamos secuencialmente los principales huesos de la anteriorSe necesita cráneo bajo un microscopio de disección para exponer un epitelio nasal casi en su totalidad intacta, manteniendo los huesos cornete delgadas intacta a menos que los ratones son muy antiguo y cryosectioning. También extendemos el método para preservar la conexión entre los tejidos nasales y los bulbos olfativos, así como el resto del cerebro, facilitando así el examen simultáneo de ambos circuitos periféricos y centrales. Nuestro método se puede utilizar para preparar paraformaldehído-fijo, así como fresco, tejido nasal vivo. Por lo tanto, se espera que nuestro método para facilitar los estudios morfológicos, inmunohistoquímicos y fisiológica de la respiración, el olfato, y nasales daños y enfermedades.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Dissection&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501333</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 3 </td><td>WPI</td><td>503235</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont 55</td><td>WPI</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, Dumont AA</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11210-20</td><td></td></tr><tr><td>Specimen forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>WPI</td><td>501753</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors, Straight</td><td>Miltex</td><td>V95-304</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tissue embedding&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plastic embedding mold</td><td>VWR</td><td>15160-215</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator vacuum pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-960-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Section staining &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutral red</td><td>ACROS Organic</td><td>CAS 553-24-2</td><td>Nuclei staining</td></tr></tbody></table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

La nariz de mamífero es un órgano de múltiples funciones con estructuras internas complejas. La cavidad nasal está llena de diversos epitelios, como el epitelio olfativo, respiratorias, y de células escamosas, que difieren notablemente en localizaciones anatómicas, morfología y funciones. En ratones adultos, la nariz está cubierto con varios huesos del cráneo, lo que limita el acceso experimental a las estructuras internas, especialmente las de la posterior tal como epitelio olfativo principal (MOE). Aquí se describe un método eficaz para la obtención de los tejidos nasales casi enteras intactas y con organización anatómica conservado. El uso de herramientas quirúrgicas bajo un microscopio de disección, que secuencialmente quitamos los huesos del cráneo que rodean el tejido nasal. Este procedimiento se puede realizar en ambos, cabezas de piel de ratón paraformaldehído-fijos y recién disecados. El procedimiento de deshuesado completo dura aproximadamente 20-30 min, que es significativamente más corto que el tiempo experimental requerido para convencional de química basadacalcificación. Además, se presenta un método fácil para eliminar las burbujas de aire atrapadas entre los cornetes, lo cual es crítico para la obtención de secciones horizontales o coronal o sagital delgadas intactas de la preparación del tejido nasal. Tejido nasal preparado usando nuestro método se puede utilizar para la observación de todo el montaje de todo el epitelio, así como morfológica, inmunocitoquímica, ARN la hibridación in situ, y los estudios fisiológicos, especialmente en estudios en los que la región específica de examen y la comparación son de interés.

El uso de este método, podemos obtener de manera fiable los tejidos nasales casi totalmente intacta. Figura 2A muestra una imagen de la muestra nasal adulto de una cabeza de paraformaldehído-fijo. En esta muestra, los cuatro órganos sensoriales sub-olfativas, como el Ministerio de Educación, órgano septal, el ganglio Gruneberg y VNO, están intactos. Además, el epitelio respiratorio y tejidos subepiteliales, como las glándulas y vasos, se conservan. Hemos utilizado con éxito este método en un n...

Watch this Scientific Journal Video about An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization at JoVE.com

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Un método eficaz para Deshuesado Manual Preparar Intact ratón tejido nasal con la organización anatómica Conservas

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

an-effective-manual-deboning-method-to-prepare-intact-mouse-nasal

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K vistas.  University of Maryland Baltimore County. 

Video: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Investigación

Neurociencias

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

Análisis de la importancia del tejido linforreticular nasofaríngeo asociado (NALT) en las respuestas de ratón a las vacunas

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

Inmunología e Infección

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparación de tejidos e inmunomanchación de tejidos craneofaciales de ratón y hueso no descalcificado

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Biología del Desarrollo

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Todo el montaje de etiquetado de los cilios en el sistema olfativo principal de ratones

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones de células definidas en el infarto agudo del tejido Rebanadas del ratón órgano vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.