이 작품은 Weihong 린에 연구 보조금 (NIH / NIDCD 009269, 012831 및 ARRA 관리 보충 NIH 보조금)에 의해 지원되었다. 우리는 특히 찍고 및 처리에있는 그의 기술 지원 UMBC에서 씨 팀 포드 감사합니다. 우리는 또한 찍고 자신의 장비 지원을 올림푸스 미국 주식 박사 다프네 베르크, UMBC에서 양 Chere 페티 니콜라스 McCollum에 감사하고 싶습니다.

1. 마우스 코 준비 우리는이 연구에서 성인 C57BL / 6 배경 마우스를 사용했습니다. 모든 동물 관리 및 사용 절차는 메릴랜드 대학 볼티모어 카운티의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인됩니다. 1.1 paraformaldahyde 고정 생쥐 코를 취득 <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> 그림 1. 마우스 두개골의 뼈 A :. 두개골의 등쪽보기 B :. 제거 하악과 두개골의 복부 볼 수 있습니다. 두개골은 40 일 오래된 마우스에서 준비되었다. 각각의 뼈가 더 나은 시각화를 위해 착색하는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol><li> 일에 따라 각각의 생쥐를 해결하기 위해 transcardially 붓는다린, 외.의 E 프로토콜 (2008) 16. 간단히 마우스는 3 % 파라 포름 알데히드가 포함 된 고정액 버퍼 인산 뒤에 0.1M 인산 버퍼 (PB, 30 ~ 50 ML)로 transcardially 관류 tribromoethanol (Avertin의 250 ㎍ / g 체중)와 깊이 마취 19 mM의 L-라이신 염산염, 0.23 % 나트륨 M-과 요오드 (약 35-50 ML). 하나는 동물의 재관류 35 조브 문서의 단계를 수행 할 수 있습니다. </li><li> 하악을 잘라 (또는 아래턱)과 머리에 피부를 제거하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 신체의 나머지 부분에서 전체 헤드를 분리합니다. </li><li> 미각을 제거합니다. 또한, 청소 및 통계 1A와 1B에 표시된 시료를 얻기 위해 두개골의 표면에 남아있는 결합 조직과 근육을 제거합니다. </li><li> 해부 현미경, 뇌와 후각 전구를 덮고있는 두개골 뼈를 제거합니다. 여분의 조직과 뼈를 잘라. 아니TE는 뇌와 코가 연결되어있는 확장 된 조직 준비를 위해, 단지 두개골의 뼈가 제거됩니다. 면역 실험을 위해, 조직은 1.5 시간 동안 후 고정 야간 25 % 자당과 (PBS) 식염수 버퍼 0.1M 인산 옮겨졌다. 비강 조직은 버퍼 자당 용액에 몇 번을 찍기로 해부를 통해 가습 보관해야합니다. </li></ol> 1.2 갓 안락사 쥐의 코를 취득 <ol><li> 개인 마우스는 깨끗한 케이지로 옮겨와 최종 흡입 후 자궁 전위 5 분으로 이어졌습니다 CO 2 가스에 노출되었다. 코 조직에 혈액을 줄이기 위해, 가슴을 열고 혈액을 배출 할 수 있도록 마음을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 25 % 자당을 가진 후 고정 및 cryoprotection 제외하고, 1.1.5 단계 1.1.2를 반복합니다. 시편은 가습 보관하고 Tyrode의 염분 함유 (mm 단위)로 유지해야한다 : 140 나CL, 5 KCl을, 1 MgCl 2, 1 염화칼슘 10 나의 피루 베이트 10 D-글루코오스, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-에탄 산 버퍼 (HEPES, pH를 7.4로 조정). 또는, 킴 와이프의 조각을 접어 해부하는 동안 시편 아래 Tyr​​ode의 솔루션과 장소를 흡수하고 때때로 세포와 조직의 생존을 유지하는 것이 가습 계속 Tyrode의 솔루션에 시험편을 찍어이나 조직에 어떤 해결책을 드롭 . </li></ol> 2. 앞니, 전방의 Vomer 및 상악골 뼈 제거 <ol><li> 복부 관점에서 시작합니다. vomer 뼈를 찾아 뼈의 복부 대부분을 깰 이빨 rongeur이나 집게를 사용하여 길이를 따라 vomer 뼈를 휴식. </li><li> 톱니 모양의 집게를 사용하여 부드럽게 vomeronasal 기관 (VNO)에서 떨어져 뼈 조각을 부지런히하여 vomer 뼈의 깨진 부분을 제거합니다. 참고, 이전 달보다 작거나 환경부에 관심이있는 경우에만 마우스를위한 두 인트PS는 생략 할 수 있습니다. </li><li> 집게로 단단히 머리를 잡아. 앞니와 두 개의 앞니와 vomer 뼈 사이의 상악 전치부의 관절 부위 모두의 앞 부분을 깰 수있는 rongeur를 사용합니다. </li><li> 최대 지느러미 광대뼈 판의 레벨로 광대뼈 아치 바로 전방 지역에서 오른쪽 상악의 복부 부분을 휴식. </li><li> 등의 견해 코 뒤집어. 지느러미 광대뼈 플레이트의 오른쪽 상악 전방을 깰 rongeur를 사용합니다. 광대뼈 플레이트의 전체 오른쪽 상악골의 전방이 느슨합니다. 부드럽게 상악의 기초가 어떤 비강 조직을 분리하는 미세 집게를 사용하고 부드럽게 뼈 조각을 올립니다. </li><li> 왼쪽 앞니와 왼쪽 상악 전치부를 풀고 코 뼈가 제거 된 후 그들을 제거하는 단계 2.4 및 2.5를 반복합니다. </li></ol> 3. 코 뼈와 지느러미 광대뼈 플레이트 제거 <ol><li> 다시 톱니 모양의 집게 또는 rongeur를 사용하여코 뼈 바로 꼬리 정면 뼈의 나머지를 이동합니다. 뼈 조각을 제거한 후, 코 뼈의 꼬리 부분이 집게를 사용하여 파지 할 수 있습니다. </li><li> 광대뼈 플레이트에 연결되어있는 광대뼈 아치의 앞쪽 부분을 깨고 rongeur를 사용합니다. </li><li> 광대뼈 플레이트의 지느러미 끝의 측면 가장자리에 미세 집게를 타고 부드럽게 뼈를 뒤집어을 제거합니다. 뼈가 느슨한 경우, 제거를 풀어 부드럽게 클램프 rongeur를 사용합니다. </li><li> 왼쪽 및 오른쪽 코 뼈 사이의 중간 봉합을 느슨하게 미세 집게 또는 면도날을 사용합니다. </li><li> 오른쪽 코 뼈의 꼬리 끝을 그립하는 톱니 모양의 집게를 사용합니다. 부드럽게 조직을 기본 구분하기 위해 좌우로 뼈를 이동합니다. 그 옆에 뼈 측면 이동을위한 비강 뼈의 꼬리 세번째 따라 집게를 이동하는 데 유용합니다. 코 뼈가 분리로, 천천히 꼬리 끝에서 뼈를 들어 올립니다. </li><li> T가그는 코 뼈를 약간 들어 올려 얇은 호흡기 상피 조직 늘어서 뼈의 측면 outcropping 표시를 나타 내기 위해 측면으로 뼈를 기울이십시오. 부드럽게 비골에서이 조직을 해제하는 미세 집게를 사용합니다. 코 뼈가 들어 계속합니다. 뼈가 완전히 하부 조직에서 분리 될 때, 주동이의 끝에서 코 뼈를 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 왼쪽 코뼈를 제거하는 단계 3.1, 3.5 및 3.6를 반복합니다. </li><li> 단계 코의 왼쪽 3.2 및 3.3를 반복합니다. </li></ol> 4. 옆 광대뼈 플레이트 제거 <ol><li> 한 번에 광대뼈 플레이트 한쪽을 제거합니다. 어느 광대뼈 플레이트를 먼저 제거 할 수 있습니다. </li><li> 복부 관점에서, 휴식 광대뼈 아치에 도달 할 때까지 광대뼈 아치 열등 상악을 깰. </li><li> 등의 관점에서, 부드럽게 광대뼈 아치를 잡고 앞으로 측면 올립니다. 광대뼈 판은 여전히​​ 모든 조직에 연결되어있는 경우, 벌금을포셉 부드럽게 조직과 뼈 사이의 연결을 절단. </li><li> 코의 반대편에있는 광대뼈 플레이트를 반복합니다. </li></ol> 5. 궤도 뼈 제거 <ol><li> 복부 관점에서, 코의 어금니 사이 palantine 뼈를 휴식. </li><li> 코의 양쪽에 3 대구치와 상악을 깰 rongeur를 사용합니다. </li><li> 코의 양쪽 비갑개에 복부와 뒤쪽 뼈의 나머지 두꺼운 휴식 및 제거합니다. </li></ol> 6. 사골 뼈 제거 <ol><li> 비갑개에 꼬리 튀어 나온 사골 뼈의 일부를 휴식. 이 비갑개를 덮고있는 사골 뼈의 얇은 조각을 제거 할 때 비갑개 조직의 손실을 방지 할 필요가있다. </li><li> 코의 오른쪽 측면, 사골 뼈의 앞쪽 가장자리에 미세 집게를 놓고 조심스럽게 제거합니다. 뼈의 일부가 남아있는 경우, 모든 때까지이 절차를 반복비갑개를 덮고있는 얇은 뼈가 제거되었습니다. 비갑개 뼈 준비의 대부분 제거 할 필요가 없습니다. 세 생쥐에서 소공 질의 접시 취성됩니다. 비강 조직의 cryosectioning이 필요한 경우, 뼈에 의한 손상을 줄이기 위해 미세 집게로 접시의 작은 조각을 제거합니다. </li><li> 코의 왼쪽 측면 단계 6.2) 반복합니다. </li><li> 이전의 단면에 남아있는 뼈 조각을 제거합니다. 주 : 동물에서 더 중격 뼈의 살, posterodorsal 지역보다 다소 두껍고 단단하다. 하나는 미세 집게를 사용하여이 부분을 제거 할 수 있습니다. 심장의 뼈와 안감 상피 조직의 지느러미 부분을 분리하는 뼈의 양쪽에 집게의 끝 부분을 삽입합니다. 뼈를 잡고 시험편을 잡아 포셉 한 쌍을 사용합니다. 심장의 아래 연골 부분에서 위쪽 뼈 부분을 깨고 조심스럽게 제거 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. </li></ol><ol><li> 흡인기 진공 펌프를 설정합니다. </li><li> 임베딩 형에 코를 놓습니다. 10월 미디어 잠수함 코. </li><li> 코 조직 내에 갇혀있는 공기 방울을 제거하기 위해 진공을 사용합니다. 이 프로세스는 5 분 소요됩니다. </li><li> 기포를 제거한 후, 원하는 방향으로 조직을 설정합니다. </li><li> OCT를하고 드라이 아이스를 사용하여 금형 조직을 고정합니다. 내장 조직은 다음 즉시 cryosectioned 또는 -80 ° C 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. </li></ol>

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R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neurons+expressing+transient+receptor+potential+channel+M5+(TRPM5)+are+involved+in+sensing+semiochemicals.">Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).</li><li>Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에, 우리는 아래 조직을 살려주는 동안 순차적으로 주변의 뼈를 제거하여 마우스 코에서 그대로 후각 및 호흡기 조직을 분리하기위한 단계별 절차를 보여 주었다. 우리는 조심 뼈 제거가 전체에서도 가장 민감한 조직을 보존 할 수 있다는 것을 보여. 우리는 또한 우리가 신경 연결을 유지하기 위해 함께 뇌와 코 조직을 모두 분리하는이 기술의 가능성 개조에 대한 통찰력을 공유 할 수 있습니...

포유류 비강은 조직과 별개의 기능을 제공 기관의 다양한 유형을 포함하고 있습니다. 비강은 폐에 그리고 밖으로 항공 여행을 할 수 상부 호흡기의 입구 부분을 차지합니다. 흡입 공기는 그것뿐만 아니라 청소를하거나, 자극성 및 독성 물질 및 전염성 미생물 2를 제거하는 필터링으로 온도와 습도 조절 1 거쳐 비강을 통해 전달합니다. 두 치료는 비강 상피와 땀샘과 혈관을 포함하여 피하 조직에 의해 수행과 하부기도와 폐를 보호하기 위해 중요합니다. 호흡 상피 방어의 역할뿐만 아니라, 비강 조직은 지나가는 공기에 화학 물질의 넓은 범위를 감지 후각과 삼차 시스템의 말초 감각기구를 포함합니다. 활성화되는 시스템에 따라, 코 화학 물질의 감각 감지 중 하나를 유도 할 수냄새, 자극, 또는 고통 3,4의 감각. 주변 후각 시스템은 복잡하고 비강 내에서 여러 해부학 적으로 분리 후각 감각 기관으로 구성되어 있습니다. 그 중에서도, 주요 후각 상피 세포 (MOE)는 설치류 5 비강 상피 세포의 약 45~52%을하게하고 후방 지역에 위치한 가장 큰 것입니다. anteroventral 지역에서 비중격의 각 측면을 따라 앉아 vomeronasal 기관 6로 알려진 관상 구조의 쌍입니다. Masera 7,8와 Gruneberg 신경절 9 중격 기관으로 알려진 후각 감각 뉴런의 두 개의 추가 작은 그룹, 각각 복부 중격과 비강 등의 항목 영역을 함께 상주합니다. 이러한 주변 장기 독특한 형태의 기능, 세포 마커 발현 및 생리 기능과 신경 상피가 포함되어 있습니다. 이들은 냄새의 수천을 감지절묘한 감도 10-12를 가진 분자. 후각 감각 기관뿐만 아니라, 비강도 다른 감각 시스템을 전시하고 있습니다. 그것은 peptidergic 삼차 신경 섬유는 비강 상피 세포, 특히 호흡기 상피 세포 13,14에 존재하는 것으로 알려져있다. 이러한 섬유의 일부는 자극과 독성 화학 물질을 감지하고 기침과 4,15 재채기 등의 보호 반사를 개시 할 책임이 있습니다. 자극성 악취 쓴 화합물은 또한 그 중 대부분은 삼차 신경 섬유 16-19로 떨어짐을하는 고독한 chemosensory 세포 (SCC에)의 최근에 발견 된 인구 감지 할 수 있습니다. 이 SCC에들은 또한 보호 기능에게 16-18를 제공 할 수 있다는 암시, 비강 및 vomeronasal 항목 덕트의 입구 영역에서 높은 밀도에 있습니다. 따라서, 비강 상피 기능, 형태 실질적으로 다를 수 있고, 세포 성분은에 따라해부학 적 위치. 심지어 하나의 전문 상피 세포 내에서 지역적 차이가 있습니다. 환경부는 하나의 예입니다. 복잡하고 구조 말려 MOE 줄 다양한 비갑개. 따라서 그 때문에, 다른 MOE 경험을 다른 공기 유량 영역, 그리고 다른 확산 및 공기 냄새 분자 (20)의 제거율. 또한, 그것은 특정 냄새 수용체를 표현하는 후각 감각 뉴런 (OSNs)은 환경부 21,22의 영역을 우회 네 가지 중 하나에있는 것으로 알려져있다. 이 위치의 차이에 미치는 영향에 악취에 OSN의 반응은 대부분 알려져 있지 않다. 또한, 일부 OSN 인구는 지역의 환경 설정을 나타냅니다. Guanylyl cyclase의-D (GC-D) 표현 OSNs는 ectoturbinates 23,24의 막 다른 골목 영역을 선호 존의 분포가있다. 더 최근에, 우리는 (TR 일시적인 수용체 잠재적 인 채널 M5를 표현 정식 OSNs의 모집단을 발견PM5)과는 우선적으로 측면과 복부 지역 25에 위치하고 있습니다. 이러한 결과는 환경부가 균일하지 않습니다 나타냅니다. 그러나 이러한 지역적 차이는 후각 코딩에 어떻게 영향을 미치는지 이해되지 않습니다. 철저한 생리 환경부의 조사와 코는 현재의 방법을 사용하여 보존 해부학 적 조직 손상 비강 상피 세포를 얻기의 어려움에 의해 제한되어 있기 때문에이 부분에 있습니다. 비강 상피는 주로 비강, 상악, 라틴, 광대뼈, 그리고 사골 뼈를 포함하여 두개골의 앞쪽 뼈에 의해 둘러싸여 있습니다. 성인 마우스 및 기타 설치류 모델에서,이 뼈는 특히 밀접한 관련이 비강 조직, 섬세한 비갑개를 손상없이 제거하기 어렵고 어렵다. 종종, 화학 기반의 탈회는 면역, 형태, 및 현장 하이브리드 화 연구에서 비강 조직의 cryosectioning 수 있도록 뼈를 부드럽게하는 데 사용되지만, depen딩은 동물의 연령, 탈회 과정은 하룻밤 7 일에게 24,26-28을 지속 할 수있다. 그것은 조직이 정착 보존 할 필요하기 때문에이 치료는 제한됩니다. 또한, 화학 탈회는 가혹한 일부 민감한 항체 29,30의 immunolabeling의 영향을 미칠 수 있습니다. 생리 학적 연구에, 살아있는 조직이 필요하며, 따라서이 실험은 종종 고립 OSNs 또는 그 두개골 뼈 얇고 17,31,32 부드러운 신생아에서 얻은 MOE 조각에 실시하고 있습니다. 생리 학적 연구는 또한 분할 머리 25,33,34에게로 전체 마운트 준비를 활용할 수 있지만, 코의 내측 표면에 일반적으로 다른 영역에 생리 녹음을 제한, 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 여기, 우리는 보존 원래의 해부학 적 조직 형태로 그대로 비강 조직을 준비하는 효과적인, 수동 발골 방법을 설명합니다. 우리는 순차적으로 전방의 주요 뼈를 제거마우스가 아주 오래된 않는 얇은 비갑개의 뼈는 그대로 유지하고 cryosectioning 동안 거의 그대로 비강 상피 세포를 노출 해부 현미경 두개골이 필요합니다. 우리는 또한 이렇게 주변과 중앙 두 회로의 동시 검사를 촉진, 비강 조직과 후각 전구 사이의 연결뿐만 아니라, 뇌의 나머지 부분을 유지하기 위해 방법을 확장합니다. 우리의 방법은 파라 포름 알데히드 고정뿐만 아니라, 신선한, 살아있는 비강 조직을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리의 방법은 호흡, 후각, 그리고 비강 손상 및 질병, 형태 면역 및 생리 학적 연구를 촉진 할 것으로 예상된다.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

포유 동물의 코는 복잡한 내부 구조를 가진 다기능 기관이다. 비강은 이러한 해부학 적 위치, 형태 및 기능에 크게 차이, 후각 호흡하고, 편평 상피 등 다양한 상피 세포에 늘어서있다. 성인 쥐에서 코는 특히 내부 구조, 주요 후각 상피 세포 (MOE)와 같은 후방 등의 사람들에게 실험적인 접근을 제한하는 각종 두개골 뼈 덮여있다. 여기에 우리가 보존 해부 조직과 거의 전체와 그대로 비강 조직을 얻기위한 효과적인 방법을 설명합니다. 해부 현미경 수술 도구를 사용하여, 우리는 순차적으로 비강 조직을 둘러싼 두개골 뼈를 제거합니다. 이 절차는 모두 파라 포름 알데히드 고정 갓 해부, 피부 마우스 머리에 수행 할 수 있습니다. 전체 발골 절차는 기존 화학 기반 데 필요한 실험 시간보다 훨씬 짧은 20 ~ 30 분 정도를 소요석회화. 또한, 우리는 비강 조직 준비에서 그대로 얇은 수평 또는 관상 또는 시상 부분을 얻기위한 중요한 비갑개 사이에 갇힌 공기 방울을 제거하는 쉬운 방법을 제시한다. 우리의 방법을 사용하여 준비 비강 조직은 특히 특정 지역과 관련된 검사와 비교가 관심의 연구에서, 전체 마운트 전체 상피 세포의 관찰뿐만 아니라, 형태 학적, 면역 세포, RNA 등의 현장 하이브리드 화, 그리고 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다.

이 방법을 사용하여, 우리는 신뢰성 거의 그대로 비강 조직을 얻을 수 있습니다. 그림 2A는 파라 포름 알데히드 고정 머리에서 성인 코 시편의 이미지를 보여줍니다. 이 시편에서, 환경부, 중격 기관, Gruneberg 신경절 및 VNO 등 네 가지 하위 후각 감각 기관은 그대로입니다. 또한, 호흡 상피와 같은 땀샘과 혈관 등의 피하 조직은 보존됩니다. 우리는 성공적으로 우리가 형태, 분포, 신경 신...

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.9K 조회수.  University of Maryland Baltimore County. 

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

조직학적 검사 및 면역 조직화학을 위한 통합 안구 표면 조직을 얻기 위한 손상되지 않은 안구의 분리

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

설치류의 머리에서 정의된 가속도를 생성하기 위한 수동 머리 움직임의 적용

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts through the bite of infected arthropod vectors. To date, emerging or re-emerging epidemic rickettsioses remain a public health risk due to the difficulty in diagnosis, as diagnostic methods are limited and not standardized or universally accessible. Misdiagnosis resulting from a lack of recognition of the signs and symptoms may result in delayed antibiotic treatment and poor health outcomes. A comprehensive understanding of Rickettsia characteristics would ultimately improve clinical diagnosis, assessment, and treatment with improved control and prevention of the disease. 
Functional studies of rickettsial genes are crucial for understanding their role in pathogenesis. This paper describes a procedure for the electroporation of the Rickettsia parkeri strain Tate's Hell with the shuttle vector pRAM18dSFA and the selection of transformed R. parkeri in tick cell culture with antibiotics (spectinomycin and streptomycin). A method is also described for the localization of transformed R. parkeri in tick cells using confocal immunofluorescence microscopy, a useful technique for checking transformation in vector cell lines. Similar approaches are also suitable for the transformation of other rickettsiae.

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Electroporation is a rapid, broadly adopted method for introducing exogenous DNA into the genus Rickettsia. This protocol provides a useful electroporation method for the transformation of obligate intracellular bacteria in the genus Rickettsia.

Rickettsia spp.를 Tick 세포주에서 형광 단백질 발현 셔틀 벡터로 형질전환하기 위한 전기천공 방법

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...