Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca (NIH / NIDCD 009.269, 012.831 e ARRA amministrative supplemento sovvenzioni NIH) a Weihong Lin. Noi in particolare ringraziamo il signor Tim Ford a UMBC per la sua assistenza tecnica in videoregistrazione e l&#39;elaborazione. Desideriamo inoltre ringraziare il Dott. Daphne Blumberg, la signora Chere Petty a UMBC e il signor Nicola McCollum da Olympus America Inc. per la loro assistenza materiale in videoregistrazione.

1. Topo Preparazione Naso Abbiamo usato adulto C57BL / 6 topi sfondo in questo studio. Tutte le cure e le procedure di animali sono approvati dalla cura degli animali e utilizzare i comitati (IACUC) della University of Maryland, Baltimore County. 1.1 Acquisire il naso da topi paraformaldahyde-fissi <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/> Figura 1. Le ossa di un cranio del mouse A:. Vista dorsale del cranio B:. Vista ventrale del cranio con la mandibola rimosso. Il cranio è stato preparato da un 40 giorni vecchio topo. Singole ossa sono colorati per una migliore visualizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50538/50538fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol><li> Profumato transcardially di fissare singoli topi a seguito di the protocollo di Lin, et al., (2008) 16. In breve, i topi sono stati anestetizzati profondamente con tribromoethanol (Avertin 250 mcg / g di peso corporeo), perfusi con transcardiaca 0.1M tampone fosfato (PB, 30-50 ml), seguito da un fosfato tamponata fissativo contenente 3% paraformaldeide, 19 mM di L-lisina monocloridrato, e 0,23% di sodio m-periodato (circa 35-50 ml). Si può anche seguire la procedura descritta in questo articolo JoVE per la perfusione degli animali 35. </li><li> Utilizzare un paio di forbici per tagliare mandibola (o mascella inferiore) e rimuovere la pelle sulla testa. </li><li> Separare l&#39;intera testa dal resto del corpo. </li><li> Rimuovere il palato. Inoltre pulire e rimuovere il tessuto connettivo e muscolare rimanente sulla superficie del cranio per ottenere il campione mostrato nelle figure 1A e 1B. </li><li> Sotto un microscopio dissezione, togliere l&#39;osso del cranio che copre il cervello e bulbi olfattivi. Tagliare il tessuto in eccesso e ossa. Note, per la preparazione dei tessuti prolungato in cui il cervello e il naso rimangono collegati, solo le ossa del cranio vengono rimossi. Per gli esperimenti di immunoistochimica, il tessuto era post-fissato per 1,5 ore e trasferito 0.1M tampone fosfato (PBS) con il 25% di saccarosio durante la notte. Nasale tessuto deve essere mantenuta per tutta la dissezione umidificato mediante immersione nella soluzione di saccarosio tamponata più volte. </li></ol> 1.2 Acquisire il naso da topi appena eutanasia <ol><li> Singoli topi sono stati trasferiti in una gabbia pulita ed esposti a gas CO 2, a cui è seguito dislocazione cervicale 5 minuti dopo l&#39;ultimo respiro. Per ridurre il sangue nel tessuto naso, usare un paio di forbici per aprire la cassa e tagliare il cuore per permettere al sangue di defluire. </li><li> Ripetere i passaggi da 1.1.2 a 1.1.5, tranne il post-fissazione e crioprotezione con il 25% di saccarosio. Il campione deve essere conservato e mantenuto umidificato con soluzione salina contenente Tyrode (in mm): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl 2, 10 Na piruvato, 10 D-glucosio, 10 e N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-etano tampone acido (HEPES, regolato a pH 7,4). In alternativa, piegare un pezzo di Kimwipes, immergerlo con la soluzione di Tyrode, e posto sotto il provino durante la dissezione e, occasionalmente, immergere il campione in soluzione del Tyrode o far cadere qualche soluzione sul tessuto per tenerlo umidificata per mantenere la vitalità delle cellule e dei tessuti . </li></ol> 2. Incisivo, anteriore Vomer e Mascella rimozione ossea <ol><li> Inizia da un punto di vista ventrale. Individuare l&#39;osso vomere e rompere l&#39;osso vomere lungo la sua lunghezza con un rongeur o pinze con i denti per rompere il ventrale maggior parte dell&#39;osso. </li><li> Utilizzando seghettate pinze, rimuovere i segmenti spezzati dell&#39;osso vomere per l&#39;esercizio di un&#39;attività delicatamente i frammenti ossei dal organo vomeronasale (VNO). Si noti, per i topi di meno di un mese, o anche solo interessati al MOE, questi due steps può essere saltato. </li><li> Tenere la testa saldamente con una pinza. Utilizzare il rongeur per rompere la porzione anteriore di entrambe incisivi e la regione snodato di mascella anteriore tra i due incisivi e l&#39;osso vomere. </li><li> Rompere la parte ventrale del mascellare superiore destra alla regione appena anteriormente al zigomatica fino al livello della piastra dorsale zigomatico. </li><li> Capovolgere il naso per un punto di vista dorsale. Utilizzare il rongeur per rompere il diritto mascellare anteriore della piastra zigomatico dorsale. Tutta la destra mascella anteriore del piatto zigomatico dovrebbe essere sciolto. Utilizzare i pinza sottile per separare delicatamente qualsiasi tessuto nasale alla base della mascella, quindi sollevare delicatamente via il frammento osseo. </li><li> Ripetere i passi 2.4 e 2.5 per allentare l&#39;incisivo sinistro e sinistro mascellare anteriore e togliere loro dopo l&#39;osso nasale è stato rimosso. </li></ol> 3. Osso nasale e Dorsale rimozione Piastra zigomatico <ol><li> Usate il forcipe o dentata il rongeur di rispostare il resto delle ossa frontali appena caudalmente ossa nasali. Dopo la rimozione di questo pezzo di osso, la parte caudale dell&#39;osso nasale può essere afferrato con pinze. </li><li> Utilizzare il rongeur per rompere la porzione anteriore dell&#39;arco zigomatico, che è collegato alla piastra zigomatico. </li><li> Prendete le pinza sottile sul bordo laterale della fine dorsale della piastra zigomatico e capovolgere delicatamente l&#39;osso e rimuoverlo. Se l&#39;osso non è allentata, utilizzare il rongeur per premere delicatamente per allentare la rimozione. </li><li> Utilizzare le pinze sottili o una lama di rasoio per allentare la sutura mediale tra destra e sinistra ossa nasali. </li><li> Utilizzare il seghettato pinze per afferrare l&#39;estremità caudale dell&#39;osso nasale destra. Spostare delicatamente l&#39;osso da un lato all&#39;altro per separarlo dalla base del tessuto. È utile per spostare la pinza lungo il terzo caudale dell&#39;osso nasale per spostare il lato dell&#39;osso a lato. Come separa l&#39;osso nasale, sollevare lentamente l&#39;osso dall&#39;estremità caudale. </li><li> Mentre tegli osso nasale è leggermente sollevato, inclinare l&#39;osso lateralmente per rivelare un affioramento laterali del midollo che è rivestito con sottile tessuto epiteliale respiratorio. Utilizzare una pinza sottile per rilasciare delicatamente il tessuto dall&#39;osso nasale. Continuare a sollevare l&#39;osso nasale. Quando l&#39;osso è completamente separato dal tessuto sottostante, usare le forbici per tagliare l&#39;osso nasale, alla fine rostrale. </li><li> Ripetere i punti 3.1, 3.5 e 3.6 per la rimozione di osso nasale sinistra. </li><li> Ripetere i punti 3.2 e 3.3 per il lato sinistro del naso. </li></ol> 4. Laterale rimozione Piastra zigomatico <ol><li> Rimuovere la piastra zigomatico un lato alla volta. O piastra zigomatico può essere rimosso per primo. </li><li> Da un punto di vista ventrale, rompere la mascella inferiore al zigomatica fino pausa raggiunge il zigomatica. </li><li> Da un punto di vista dorsale, afferrare delicatamente il zigomatica e sollevare in avanti e laterale. Se la piastra zigomatico è ancora attaccato a qualsiasi tessuto, prendere la multaforcipe e recidere delicatamente le connessioni tra il tessuto e l&#39;osso. </li><li> Ripetere per la piastra zigomatico sull&#39;altro lato del naso. </li></ol> 5. Orbit rimozione ossea <ol><li> Da un punto di vista ventrale, rompere l&#39;osso Palatina tra i molari del naso. </li><li> Utilizzare il rongeur per rompere i 3 ei molari del mascellare su ciascun lato del naso. </li><li> Rompere e rimuovere eventuali pezzi rimanenti spessore di osso ventrale e posteriore alle turbinati su ciascun lato del naso. </li></ol> 6. Etmoide rimozione ossea <ol><li> Rompere qualsiasi parte dell&#39;osso etmoide sporgente caudale ai turbinati. Ciò è necessario per evitare la perdita di tessuto turbinate nel rimuovere pezzi sottili di osso etmoide coprono turbinati. </li><li> Per il lato destro del naso, posizionare i pinza sottile sul bordo anteriore dell&#39;osso etmoide e rimuoverla delicatamente. Se una porzione dell&#39;osso rimane, ripetere questa procedura finché tuttil&#39;osso sottile che copre i turbinati è stato rimosso. Le ossa turbinati non devono essere rimossi nella maggior parte delle preparazioni. In topi anziani, la lamina cribrosa diventa fragile. Se è necessaria criosezionamento del tessuto nasale, rimuovere piccoli pezzi della piastra con una pinza sottile per ridurre il potenziale danno causato dalla osso. </li><li> Ripetere il punto 6.2) per il lato sinistro del naso. </li><li> Rimuovere eventuali frammenti di ossa rimanenti prima del sezionamento. Nota: in animali più di un anni, la regione posterodorsal dell&#39;osso setto è alquanto denso e duro. Si può rimuovere questa parte con una pinza sottile. Inserire la punta della pinza in entrambi lato dell&#39;osso per separare la porzione dorsale del setto osseo e il tessuto di rivestimento epiteliale. Utilizzare un paio di pinze per afferrare l&#39;osso e tenere il campione. Utilizzare un altro paio di pinze per rompere la parte ossea superiore della porzione cartilaginea inferiore del setto e rimuoverla delicatamente. </li></ol><ol><li> Impostare la pompa del vuoto aspiratore. </li><li> Mettere il naso in uno stampo embedding. Immergere il naso in OCT media. </li><li> Utilizzare un aspirapolvere per rimuovere le bolle d&#39;aria intrappolate all&#39;interno del tessuto naso. Questo processo può richiedere fino a 5 min. </li><li> Dopo la rimozione di bolle d&#39;aria, il tessuto impostare l&#39;orientamento desiderato. </li><li> Congelare l&#39;ottobre e il tessuto nello stampo usando ghiaccio secco. Il tessuto incorporato può quindi essere cryosectioned immediatamente o conservato a -80 ° C per un uso futuro. </li></ol>

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	<li>Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+ability+of+the+nose+to+warm+and+humidify+inspired+air.">Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air.</a> Rhinology. 45, 102-111 (2007).</li><li>Bjermer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nose+as+an+air+conditioner+for+the+lower+airways.">The nose as an air conditioner for the lower airways.</a> Allergy. 54, 26-30 (1999).</li><li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents.">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413, 211-218 (2001).</li><li>Bryant, B., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).</li><li>Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+morphometry+of+the+nasal+cavity+in+rats+and+mice.">Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice.</a> J. Anat. 135, 83-88 (1982).</li><li>Halpern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+and+function+of+the+vomeronasal+system.">The organization and function of the vomeronasal system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).</li><li>Rodolfo-Masera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Su+l'esquoestizenza+di+un+particulare+organo+olfacttivo+nel+setto+nasale+della+cavia+e+di+altri+roditori.">Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori.</a> Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).</li><li>Levai, O., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+pattern+of+nerve+fibers+from+the+septal+organ:+DiI-tracing+studies+with+transgenic+OMP+mice.">Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice.</a> Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).</li><li>Storan, M. J., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septal+organ+of+Gruneberg+is+part+of+the+olfactory+system.">Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system.</a> J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).</li><li>Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+views+on+the+distinct+but+related+roles+of+the+main+and+accessory+olfactory+systems+in+responsiveness+to+chemosensory+signals+in+mice.">Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice.</a> Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).</li><li>Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sense+of+smell:+multiple+olfactory+subsystems.">The sense of smell: multiple olfactory subsystems.</a> Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+substance+P-+and+CGRP-immunoreactive+nerve+fibers+in+the+nasal+epithelium+of+rodents.">Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents.</a> J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).</li><li>Papka, R. E., Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+substance-P-immunoreactive+nerves+with+the+murine+olfactory+mucosa.">Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa.</a> Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).</li><li>Baraniuk, J. N., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasonasal+reflexes,+the+nasal+cycle,+and+sneeze.">Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze.</a> Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).</li><li>Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+solitary+chemosensory+cells+respond+to+odorous+irritants.">TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants.</a> J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).</li><li>Ogura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+microvillous+cells+in+the+mouse+main+olfactory+epithelium+and+effect+of+acetylcholine+on+olfactory+sensory+neurons+and+supporting+cells.">Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells.</a> J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).</li><li>Finger, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solitary+chemoreceptor+cells+in+the+nasal+cavity+serve+as+sentinels+of+respiration.">Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).</li><li>Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+solitary+chemoreceptor+cell+responses+to+bitter+and+trigeminal+stimulants+in+vitro.">Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro.</a> J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).</li><li>Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+modeling+of+turbulent+and+laminar+airflow+and+odorant+transport+during+sniffing+in+the+human+and+rat+nose.">Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose.</a> Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).</li><li>Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zonal+organization+of+odorant+receptor+gene+expression+in+the+olfactory+epithelium.">A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium.</a> Cell. 73, 597-609 (1993).</li><li>Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+segregation+of+odorant+receptor+expression+in+the+mammalian+olfactory+epithelium.">Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium.</a> Cell. 74, 309-318 (1993).</li><li>Fulle, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+guanylyl+cyclase+expressed+specifically+in+olfactory+sensory+neurons.">A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).</li><li>Juilfs, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subset+of+olfactory+neurons+that+selectively+express+cGMP-stimulated+phosphodiesterase+(PDE2)+and+guanylyl+cyclase-D+define+a+unique+olfactory+signal+transduction+pathway.">A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).</li><li>Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odors+detected+by+mice+deficient+in+cyclic+nucleotide-gated+channel+subunit+A2+stimulate+the+main+olfactory+system.">Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system.</a> The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).</li><li>Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+two-+and+three-color+fluorescent+RNA+in+situ+hybridization+of+the+main+and+accessory+olfactory+epithelia+in+mouse.">Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse.</a> J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).</li><li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice.">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).</li><li>Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaNp63+regulates+stem+cell+dynamics+in+the+mammalian+olfactory+epithelium.">DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).</li><li>Matthews, J. B., Mason, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+decalcifying+agents+on+immunoreactivity+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Histochem J. 16, 771-787 (1984).</li><li>Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+decalcification+agents+on+immunoreactivity+of+cellular+antigens.">Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens.</a> J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).</li><li>Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+store-mediated+signaling+in+sustentacular+cells+of+the+mouse+olfactory+epithelium.">Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium.</a> Glia. 57, 634-644 (2009).</li><li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+the+main+olfactory+system+in+social+recognition+of+major+histocompatibility+complex+peptide+ligands.">Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).</li><li>Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation.">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).</li><li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+responses+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+using+the+air-phase+electroolfactogram+recording.">Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).</li><li>Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+neurons+expressing+transient+receptor+potential+channel+M5+(TRPM5)+are+involved+in+sensing+semiochemicals.">Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).</li><li>Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM5-expressing+microvillous+cells+in+the+main+olfactory+epithelium.">TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium.</a> BMC Neurosci. 9, 114 (2008).</li><li>Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreception+regulates+chemical+access+to+mouse+vomeronasal+organ:+role+of+solitary+chemosensory+cells.">Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells.</a> PLoS One. 5, e11924 (2010).</li><li>Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+of+G-protein+&#946;&#947;+subunit+gene+transcripts+in+the+mouse+olfactory+sensory+epithelia.">Expression profile of G-protein &#946;&#947; subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui, abbiamo dimostrato una procedura passo-passo per isolare il tessuto olfattivo e respiratorio intatta dal naso mouse sequenzialmente rimuovendo le ossa circostanti, risparmiando il tessuto sottostante. Abbiamo dimostrato che un&#39;attenta rimozione ossea può conservare anche i tessuti più delicati nella loro interezza. Condividiamo anche spaccato eventuali modifiche di questa tecnica, in cui isolare sia il cervello e il tessuto naso insieme per preservare il collegamento nervo. Questo nuovo metodo fornisce un mez...

La cavità nasale mammiferi contiene vari tipi di tessuti ed organi che servono funzioni distinte. La cavità nasale costituisce la porzione di imbocco del tratto respiratorio superiore, che permette di viaggiare aria dentro e fuori i polmoni. Aria inalata passa attraverso la cavità nasale dove subisce temperatura e umidità condizionata 1 così come la pulizia o filtrazione per rimuovere sostanze irritanti e tossiche e microrganismi infettivi 2. Entrambi i trattamenti sono effettuati da nasale epiteli e tessuti subepiteliali, tra cui le ghiandole e vasi e sono fondamentali per la protezione delle vie respiratorie inferiori e dei polmoni. Oltre al suo ruolo nella respirazione e difesa epiteliale, il tessuto nasale contiene anche apparati sensoriali periferici dei sistemi olfattivi e trigemino, che rilevano una vasta gamma di sostanze chimiche in aria che passa. A seconda del sistema è attivato, il rilevamento sensoriale di sostanze chimiche nel naso può suscitare siaun senso di odore, irritazione o dolore 3,4. Il sistema olfattivo periferico è complesso e costituito da diversi organi sensoriali olfattivi anatomicamente separate all&#39;interno della cavità nasale. Tra questi, il principale epitelio olfattivo (MOE) è la più grande, che costituisce circa il 45-52% degli epiteli nasali nei roditori 5 e si trova nella regione posteriore. Nella regione anteroventrale, vi è una coppia di strutture tubolari noti come vomeronasal organo 6, che siedono lungo ogni lato del setto nasale. Altri due piccoli gruppi di neuroni sensoriali olfattivi, noto come l&#39;organo del setto di Masera 7,8 e il ganglio Gruneberg 9, risiedono lungo il setto ventrale e la regione dorsale ingresso della cavità nasale, rispettivamente. Questi organi periferici contengono neuro-epiteli con caratteristiche di spicco nella morfologia, espressione marcatore della cella, e la funzione fisiologica. Insieme, essi rilevano migliaia di odorimolecole con squisita sensibilità 10-12. Oltre agli organi sensoriali olfattivi, la cavità nasale ospita anche altri sistemi sensoriali. E &#39;noto che le fibre del nervo trigemino peptidergico sono presenti nell&#39;epitelio nasale, specialmente l&#39;epitelio respiratorio 13,14. Alcune di queste fibre di rilevare sostanze chimiche irritanti e tossici e sono responsabili per l&#39;avvio di riflessi protettivi come tosse e starnuti 4,15. Composti odorosi e amaro irritanti possono essere rilevati anche da una popolazione di cellule recentemente scoperto chemosensoriali solitarie (SCC), molti dei quali sono innervate da fibre nervose del trigemino 16-19. Questi SCC si trovano a maggiore densità nella zona ingresso della cavità nasale e delle vie d&#39;ingresso vomeronasali, suggerendo che esse possono servire anche una funzione protettiva 16-18. Così, epiteli nasali possono differire sostanzialmente in funzione, morfologia e composizione delle cellule a seconda della lorosedi anatomiche. Anche all&#39;interno di un unico e specializzato epitelio, ci sono differenze regionali. Il MOE è un esempio. Le linee MOE vari turbinati, che sono complicate e arricciati strutture. Grazie a loro, diverse regioni delle esperienze diverse portate d&#39;aria MOE e, quindi, diversa diffusione e di clearance delle molecole di odore nell&#39;aria 20. Inoltre, è noto che i neuroni sensoriali olfattivi (OSN) esprimenti un dato recettore odore sono situati in una delle quattro aggirato zone del MOE 21,22. Come questa differenza di posizione influenza la risposta di un OSN per odoranti non è ampiamente noto. Inoltre, alcune popolazioni OSN mostrano preferenza regionale. OSN guanylyl ciclasi-D (GC-D)-esprimenti hanno distribuzioni zonali favorendo le regioni cul-de-sac delle ectoturbinates 23,24. Più di recente, abbiamo trovato una sottopopolazione di OSN canoniche che esprime transitoria recettore potenziale canale M5 (trPM5) ed è preferenzialmente situati nelle regioni laterali e ventrali 25. Questi risultati indicano che MOE non è uniforme. Tuttavia, come queste differenze regionali influenzano codifica olfattivi non è compreso. Questo è in parte perché accurata indagine fisiologica del MOE e il naso è stato limitato dalla difficoltà di ottenere intatta nasale epiteli con organizzazione anatomica conservata con i metodi attuali. La nasale epiteli sono prevalentemente circondato dalle ossa anteriori del cranio, compreso il naso, mascella, palatino, zigomatico, e le ossa etmoidali. In topi adulti e altri modelli di roditori, queste ossa sono dure e difficili da rimuovere senza danneggiare il tessuto nasale strettamente associata, in particolare dei turbinati delicati. Spesso, decalcificazione chimici a base viene usato per ammorbidire le ossa per consentire criosezionamento dei tessuti nasali per morfologica, immunoistochimica, e in studi di ibridazione in situ, tuttavia, dipending l&#39;età dell&#39;animale, il processo di decalcificazione può durare durante la notte fino a 7 giorni 24,26-28. Questo trattamento è limitata anche perché richiede tessuto fissativo essere conservato. Inoltre, decalcificazione chimica può essere dura e influenzare la immunomarcatura di alcuni anticorpi sensibili 29,30. Per gli studi fisiologici, è richiesta tessuto vivo, e, quindi, questi esperimenti sono spesso condotti su OSN isolate o fette MOE ottenuti da neonati le cui ossa del cranio sono sottili e morbidi 17,31,32. Studi fisiologici possono anche utilizzare i preparati montare tutto, dividendo la testa 25,33,34, ma di solito solo la superficie mediale del naso è facilmente accessibile, limitando le registrazioni fisiologiche su altre aree. Qui, descriviamo un efficace metodo di disossamento manuale per preparare i tessuti nasali intatte con conservato organizzazione anatomica e morfologia. Noi sequenziale rimuoviamo le principali ossa del anterioreè necessaria cranio sotto un microscopio dissezione per esporre un epitelio nasale quasi totalmente intatto, mantenendo le sottili ossa turbinati intatto a meno che i topi sono molto vecchi e criosezionamento. Abbiamo anche estendere il metodo per conservare la connessione tra i tessuti nasali e bulbi olfattivi, così come il resto del cervello, facilitando così esame simultaneo di entrambi i circuiti periferici e centrali. Il nostro metodo può essere utilizzato per preparare paraformaldeide-fisso, nonché fresco, tessuto nasale vivo. Così, il nostro metodo è previsto per facilitare gli studi morfologici, immunoistochimici e fisiologici della respirazione, l&#39;olfatto, e nasale danni e malattia.

<table border="1">
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

Il naso dei mammiferi è un organo multi-funzionale con le strutture interne complesse. La cavità nasale è rivestita con vari epiteli, come epiteli olfattivi, respiratori, e squamose che differiscono notevolmente in sedi anatomiche, morfologia e funzioni. In topi adulti, il naso è coperto con varie ossa del cranio, limitando l&#39;accesso sperimentale alle strutture interne, in particolare quelli del posteriore, come il principale epitelio olfattivo (MOE). Qui si descrive un metodo efficace per ottenere quasi tutto intatto e tessuti nasali con organizzazione anatomica conservata. L&#39;utilizzo di strumenti chirurgici sotto un microscopio da dissezione, abbiamo sequenziale rimuoviamo le ossa del cranio che circondano il tessuto nasale. Questa procedura può essere eseguita su entrambe le teste del mouse, dalla pelle paraformaldeide-fissi e appena sezionato. L&#39;intera procedura disossamento richiede circa 20-30 min, che è significativamente più breve del tempo richiesto per sperimentale convenzionale a base chimica decalcificazione. Inoltre, vi presentiamo un metodo semplice per rimuovere le bolle d&#39;aria intrappolate tra i turbinati, che è fondamentale per l&#39;ottenimento di sezioni orizzontali o coronale o sagittale sottili intatte dalla preparazione dei tessuti nasali. Tessuto nasale preparati usando il nostro metodo può essere utilizzato per tutta osservazione monte dell&#39;intero epiteli, nonché morfologica, immunocitochimica, RNA ibridazione in situ, e studi fisiologici, specialmente negli studi in cui regione specifica esame e confronto sono di interesse.

Usando questo metodo, si può attendibilmente ottenere tessuto nasale quasi completamente intatte. Figura 2A mostra un&#39;immagine esemplare adulto nasale da una testa paraformaldeide-fissa. In questo esemplare, tutti e quattro gli organi sensoriali sub-olfattive, tra cui il MOE, organo del setto, il ganglio Gruneberg e VNO, sono intatte. Inoltre, gli epiteli delle vie respiratorie e dei tessuti subepiteliali, come le ghiandole e vasi, sono conservati. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo in u...

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Un efficace manuale disosso metodo per preparare intatto il mouse tessuto nasale con organizzazione anatomica Conservato

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.9K Views.  University of Maryland Baltimore County. 

Video: An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Ricerca

Neuroscienze

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Miglioramento della preparazione e la conservazione di fette mouse ippocampo per una registrazione molto stabile e riproducibile di potenziamento a lungo termine

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Biologia dello sviluppo

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Immunologia e infezioni

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.