המכון הלאומי לבריאות גרנט DA024009, DK046367 &amp; T32DA007027.

כל הטיפול בבעלי החיים ופרוצדורות היו בהתאם ובאושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת וירג&#39;יניה. 1. הכנת coverslips הזכוכית פולי-D-ליזין וLaminin מצופה סטריליים ב24 גם צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנהלים לשלב 1 מבוצעים בתנאים סטריליים; מתחת למכסת מנוע, ועם חומרים כימיים סטריליים. coverslips זכוכית והמים deionized כפולים (DDH 2 O) צריכים להיות מעוקרים מראש. הכנת צלחות ניתן לעשות עד שבועיים לפני בידוד תא עצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, להשתמש במלקחיים סטריליים למקום coverslips זכוכית autoclaved ב12 בארות של צלחת 24 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מניית פולי-D-ליזין מבעוד מועד. הוסף 50 מ&quot;ל של ddH2O סטרילי עד 5 פולי-D-ליזין מ&quot;ג. וורטקס וחנות ב3 aliquots מ&quot;ל ב -20 ° C. הפשירי aliquots לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לריכוז סופי של מניית פולי-D-ליזין 1 מ&quot;ל לכל 25 ס&quot;מ 2: 80 פיפטה μlמניית של פולי-D-ליזין על גבי כל כוס coverslip (2 2 ס&quot;מ). תנו פתרון להתפשר על 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ואקום באמצעות פולי-D-ליזין ולשטוף coverslips 3x עם סטרילי DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחות להתייבש במשך לפחות שעה 2 מתחת למכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות עשויות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או - 20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לציפוי laminin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מניית laminin מבעוד מועד. הפשירי laminin על קרח ולשמור על קרח בעת השימוש. לדלל את ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל; לשים לב לריכוז הרבה, כל מגרש יהיה שונה. בהתאם לריכוז רב, כ 20 מיליליטר DDH 2 O יתווסף לכל בקבוקון של laminin. Aliquot (5 מ&quot;ל) ולאחסן ב -80 ° C. הפשירי aliquots על קרח לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מעיל עם 5 מיקרוגרם / 2 ס&quot;מ; laminin μl פיפטה 200 מניות laminin על כל coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון laminin על coverslips במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פתרון laminin שנותר ולשטוף coverslips פעם אחת עםDDH 2 O. הימנע מגירוד פני השטח של coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. </li></ol> 2. הכנה מראש של Neuron פתרונות בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון קרבס (מ&quot;מ: 118 NaCl, KCl 4.6, 1.3 אא 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 11 גלוקוז, ו2.5 CaCl 2). מקום 13.79 גרם NaCl (FW 58.44), 0.686 גרם KCl (FW 74.55), 0.312 גרם לאא 2 PO 4 (FW 120), .289 גרם MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 גר &#39;NaHCO 3 (FW 84.01), גרם גלוקוז 3.96 (FW 180.2), ו0.555 גרם CaCl 2 (FW 111) ב2 ליטר DDH 2 0. לצנן עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף תקשורת (F12 תקשורת עם 10% עוברי שור בסרום (FBS) ואנטיביוטיקה / antimycotic): לבקבוק 500 מ&quot;ל של F12 תקשורת, להוסיף 50 מ&quot;ל FBS ו5 מ&quot;ל של נוזל אנטיביוטי 100x / antimycotic (Gibco). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת נוירון enteric (Neurobasal מדיה עם B-27, L-גלוטמין,, Neurotr 2 מ&quot;מ 1% FBS 10 ng / ml, גליה נגזרפקטור ophic (GDNF), ונוזלי 100x אנטיביוטיקה / antimycotic). כדי להפוך את מניית GDNF, להוסיף 1 מיליליטר ddH2O לGDNF מיקרוגרם 10 ולהקפיא בחזרה ב50 aliquots μl, חנות ב -80 ° C. לבקבוקון 50 מ&quot;ל של תקשורת נוירון השלם, לשלב 47.5 מ&quot;ל Neurobasal מדיה, 50 מניות 1 מיליליטר B-27 (50x), 500 FBS μl, 500 μl 200 מ&quot;מ L-גלוטמין (Gibco) μl GDNF ו500 אנטיביוטי / μl נוזלי 100x antimycotic. תקשורת נעשית בקבוצות קטנות 50 מ&quot;ל על מנת להבטיח טריות GDNF וכדי למנוע זיהום של כמויות גדולות של תערובת תקשורת סלולארי יקרה זה. </li></ol> 3. קציר הכנת מקלעת שריר / Myenteric אורכית (LMMP) מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה צריכה להיות במקום לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. עכברים וובסטר שוויצרי למבוגרים במשקל מעל 25 גרם (בדרך כלל מעל 8 שבועות של גיל) הם שוכנו בקבוצות של 6 לפני ניסויים. רקמות משני עכברים המשמשות לבידוד של נוירונים enteric ileal וגליה ושלושה עכברים משמשיםבידוד של תאי מעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אזור ניתוח. אסוף את המספריים קטנים כירורגיות, מלקחיים זווית, צמר גפן, שלוש כוסות זכוכית 200 מ&quot;ל, ומוט זכוכית / פלסטיק (מכחול). ודא כי כל הציוד נשטפים ביסודיות ושטף לפני השימוש כדי למזער את הזיהום. צעד זה יכול להתבצע ביום שלפני הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פתרון קרבס על קרח ואת הבועה עם carbogen (חמצן 95%, 5% CO 2) במשך לפחות 30 דקות כדי לייצב את רמת החומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ציוד שונים וכימיקלים חמים לייצב בטמפרטורות רצויות; אמבט מים חום (ים) עד 37 מעלות צלזיוס צנטריפוגות מגניבה, עד 4 מעלות צלזיוס, מקום הפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) וטריפסין 0.5% באמבט מים (37 מעלות צלזיוס ). תקשורת נוירון השלמה ומדיה לשטוף צריכה להישאר בקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרח קר מקום 150 מ&quot;ל בעבע קרבס בשלוש כוסות זכוכית 200 מ&quot;ל שכותרתו &#39;מלוכלכת&#39;, &#39;נקי&#39;, ו &#39;LMMP&#39;. כוס בועה שכותרתו &#39;LMMP&#39; עם carbogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אישור מועדת אתיקה, להרדים מ &#39;ouse על ידי נקע בצוואר רחם או במשותף מחנק 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר בrecumbence הגבי על פני השטח, עור נקי כירורגית עם EtOH 70%, ולהרים את עור בטן באמצעות מלקחיים. בעזרת מספריים, חלל בטן פתוח ולחשוף את איברי עיכול פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האורך של מערכת העיכול על ידי הרמת חלק של מעי ומגלה לפדרו. חיתוך באמצעות לפדר עם מספריים כדי להסיר בעדינות ולפענח מעי ומעי גס, נזהר שלא למשוך לפדר מהמעי / המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר באורך המלא של מעי נפרם, הסר את המעי על ידי חיתוך דרך המעי הדיסטלי ולקיבת פרוקסימלי לcecum. הערה: הליך זה יכול גם להתבצע עם רקמת המעי הגס על ידי הסרת המעי הגס דיסטלי לcecum להפרוקסימלי ל פי הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות ניתן לחלוקה נוספת בין מעי גס הפרוקסימלי ודיסטלי, וjejenum, ומעי. שאר הליך זה יתייחס לבידוד של המעי; לאהוא התהליך זהה לבידודה של LMMP מעי גס. הנח את כל המעי במכל זכוכית עם הקרח הקר קרבס מסומן &#39;מלוכלך&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור כלי לניקוי המעי; בוטה מחט גדולה 20 G באמצעות אבן הגשה ולצרף אותו למזרק גדול (10 מ&quot;ל) המכיל קרח קר קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את צואה מהמעי על ידי חתך המעי לשלוש או יותר חתיכות גדולות. הסר סעיף ileal מהכוס ומניח את המחט הקהה לסוף פיסת ileal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות תריץ את קרבס דרך סעיף הבטן עד שכל החומר צואתי יוסר לתוך מיכל פסולת נפרד. הנח את הסעיף ניקה לתוך המכל של קרבס המסומן &quot;נקי&quot;. חזור על פעולה עד כל המעי הוא ניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר LMMP, לחתוך את המעי למקטעים קטנים, כ 4 - 2 ס&quot;מ. הנח קטע של מעי בפלסטיק או מוט זכוכית; מעי צריך להתאים מלבב, אבל לא יהיה רופף או מתוח (~ 2 מ&quot;מ). בגין הסרת LMMP בעדינות על ידי הסרת פיסות לפדר עדיין לצרףאד לדרכים (GI) במערכת העיכול באמצעות מלקחיים. למנוע את מערכת העיכול ממסתובב סביב מוט בעדינות על ידי הצמיד לצינור המוט באמצעות האגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד LMMP מהשריר מעגלי הבסיס; ראשון לשפשף בעדינות את הקצה של המלקחיים לאורך כל הקו שבו לפדר צורף, מלמעלה עד למטה של ​​המגזר, בעדינות יוצר פער בשריר האורכי. ואז בעדינות להקניט אחד את השריר האורכי באמצעות מקלון צמר גפן רטוב עם קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחיל בחלק העליון של הפער בשריר האורכי ולהקניט מרחק באמצעות שבץ האופקי הקל תוך הפעלת לחץ קל מאוד עד שהשריר האורכי רק מתחיל להיפרד מהשריר המעגלי; לעשות את זה לאורך כל הרצועה לאורך נקודת החיבור לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז בעדינות מתחיל לעקוף את צינור העיכול; נע מלמעלה למטה ובחזרה כמו השריר האורכי מופרד לאט מהשריר המעגלי כל הדרך סביב הצינור. כאשר שלם,LMMP יבוא ממני באופן טבעי את השארית של צינור העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים הרצועה דקה כתוצאה של שריר האורכי בכוס המסומנת &quot;LMMP &#39;. חזור על פעולה עבור כל המגזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל הרצועות של LMMP כבר נאספו מעכבר אחד, חזור על תהליך עבור כל עכברים אחרים בשימוש. יש לשטוף היטב את הכוסות &#39;מלוכלכות&#39; ו &#39;נקיות&#39; לפני השימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את LMMP 3x להסיר זיהום ביולוגי. מלא שלושה 2 מ&quot;ל אפנדורף צינורות עם הקרח הקר קרבס. מניחים את רצועות LMMP בצינור הספין הראשון במשך 30 שניות ב356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C. מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ולהעביר את רצועות LMMP לצינור מלא נקי קרבס הבא. חזור על תהליך זה עבור כל צינור הנותר. </li></ol> 4. תקציר LMMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון עיכול על ידי הצבת 13 מ&quot;ג collagenase סוג 2 ו 3 מ&quot;ג BSA בcarbogen-בעבע פתרון 10 מ&quot;ל קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגזרי מקום LMMP השטוף לפתרון עיכול וscis שימושsors כדי לגזור LMMP לחתיכות קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר LMMP למשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם שייקר בזמן שמבעבע בעדינות עם carbogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העיכול יושלם, לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ל8 דקות ב 356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאן ולהבא צריכים לעשות את כל ההליכים בתנאים סטריליים במכסת מנוע תרבית תאים! כל חומרים כימיים ומכלי צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להכין פתרון טריפסין 0.05% על ידי הצבת 1 מ&quot;ל חימם טריפסין 0.25% ו 4 מ&quot;ל חימם HBSS לתוך צינור תא 50 מיליליטר סטרילי תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. לא להשתמש בשואב אבק, זה כנראה יהיה למצוץ את התא גלולה עקב מהירויות נמוכות צנטריפוגה. מוציא בזהירות את התא גלולה והמקום לתוך צינור נקי עם 5 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את התאים בתמיסת טריפסין 0.05% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם הרעד במשך 7 דקות. לא תעלה על 7 ק&quot;מn טיפול טריפסין מוחלט או נוירונים יאבדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל טריפסין עם 10 מ&quot;ל של תקשורת לשטוף קרה אחרי 7 דקות של הטיפול בטריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ל8 דקות ב 356 x גרם. להסיר ולסלק תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, לאזן את קטע של רשת Nitex עיקור על גבי תא צינור 15 מ&quot;ל סטרילי תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. בעדינות תערובת תאי resuspend ידי triturating ב3 תקשורת נוירון שלמה מ&quot;ל. הימנע מיצירת בועות אוויר בשלב זה וכל הצעדים העתידיים שבו תערובת תא triturated. צריך לעשות את כל triturations בעדינות רבה. פתרון תא סינון דרך Nitex הרשת לתוך צינור 15 מיליליטר תרבית תאים הנקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: צינור תרבית תאים שווי ומניח במיקסר חולה בקירור (או כל מיקסר המספק סיבוב) עם גלגול והטיה עדינים למשך 30 דקות. שלב זה הוא אופציונלי, אך מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לאחר מיקסר חולה, להוסיף 2 תקשורת לשטוף קרה מ&quot;ל לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה (8 דקות, 356 XG). להסיר ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב-1,200 תקשורת נוירון המלאה μl. Triturate תאים בעדינות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק 1 מ&quot;ל. לא ליצור בועות אוויר. פיפטה לאט ובעדינות עד שרוב הגושים שבורים ותאים מושעים לנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 750 μl של מדיה מלאה לכל אחת מהבארות המכילות 12 coverslip זכוכית מצופה מראש ולהוסיף 100 μl של פתרון תא triturated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוירונים בתרבית תאי חממה ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מחצית התקשורת הסלולרי כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים הם מוכנים להקלטות אלקטרו לאחר 1 - 2 ימים בתרבות. </li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system:+A+second+brain.">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li><li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+lytic,+latent,+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons.">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li><li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li><li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig.">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li><li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig.">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li><li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia.">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li><li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation.">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li><li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels.">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li><li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities:+Introducing+the+neuro-gliopathies.">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li><li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+genetics,+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice.">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li><li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract.">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li><li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin.">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים גדולים קיימים.

בעלי חיים המשמשים פרוטוקול זה כבר מותאם לעכברים וובסטר שוויצרי. עם זאת, שיטה זו היא להתאמה בקלות ליונקים אחרים בינוני וקטנים כגון חולדות ולזנים אחרים של עכברים. יש לנו לבצע בהצלחה בידודים ראשוניים עם C57 עכברים וקולטניים μ-אופיואיד?...

מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצומה של עצבים וגליה שפועלת לכל האורך של מערכת העיכול (GI). ENS פונקציונלי שולט בכל ההיבטים של מערכת העיכול, כולל תנועת מעיים, קליטה / הפרשת נוזלים, תחושה של גירויים, וכו &#39;(לסקירה ראה 1). הוא מכיל מעל 500 מיליון נוירונים, יותר מאשר נמצא בחוט השדרה, והוא מכיל בכל כיתת מוליך עצבי במוח. יתר על כן, ENS הוא ייחודי בכך שהוא יכול לתפקד רפלקסיבי ללא קלט ממערכת העצבים המרכזית 2. הבנה של ENS היא קריטית, לא רק כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי הרגיל שלו, אבל כדי להבין את מעורבותה במגוון רחב של neuropathies אשר יכולה להיות מולדים (מחלת הירשפרונג של), שנרכשה (Chagas), משנית למחלת הברית (gastroparesis הסוכרתי), תרופה המושרה (תסמונת מעי אופיואידים), או עקב פציעה (ileus לאחר ניתוח) 1. בנוסף לכך, תאי עצב מעיים יכולים להיות מחדשservoir לזיהום נגיפי (אבעבועות רוח זוסטר) 3. בגלל דמיונה למוח ואת הרמות הגבוהות של סרוטונין במעיים, לעתים קרובות יש תרופות שנועדו לטיפול בליקויים במערכת עצבים מרכזיים תופעות לוואי בלתי רצויות על ENS 2. זה גם ראוי לציין כי neuropathies רבים כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון מראה שינויים תאיים דומים בתאי העצב, הרבה לפני ההופעה שלהם בתאי עצב מרכזיים המעיים, מה שהופך ENS מודל נגיש ללמוד פתוגנזה של מחלות אלו 4. לכן, הבנה מעמיקה של ENS היא הכרח בהבנת מצבי מחלה ומניעה / ניבוי תופעות לוואי תרופתי. הנוירונים של ENS נחקרו באופן מסורתי בחזיר באמצעות הכנות wholemount 5-7 או נוירונים בתרבית 8. למרות הקלות שבה ניתן ללמוד נוירונים בחיה הגדולה הזה, מודל זה יש מגבלות רבות, כוללחוסר של זנים מהונדסים גנטי, חוסר של חומרים כימיים ספציפיים למין זה, ואת העלות הגבוהה הקשורה עם ההזמנה ודיור נושאים אלה. יש ההתפתחות של מודל מערכת עצבים enteric עכברי את היתרון הייחודי של דפיקה שונות מתוך מערכות, מגוון רחב של שיטות אחרות שהוקמו, שניתן להשתמש בשילוב עם טכניקת תרבית התאים, ואת היכולת לספק אימות למודל חזיר גינאה . ENS מורכב משלושה plexi הפועלים אורך של מערכת העיכול: myenteric מקלעת החיצונית (בין השריר האורכי וחוזר) האחראית בעיקר לפעולות הנפיחה של המעיים, כמו גם plexi submucosal והרירי, ( מצא מתחת ובתוך הרירית, בהתאמה), אשר במידה רבה שולטת בקליטה / הפרשת נוזלים וזיהוי של גירויים 1. שיטה זו מתחילה בבידוד של הכנת מקלעת שרירים / myenteric האורך (LMMP) על ידי קילוףאת השכבה החיצונית של השרירים מערכת העיכול. כך יצמצם את הזיהום באופן דרמטי בנושאים שעולים כאשר השכבה הרירית מעורבת בבידוד. כתוצאה מכך, תהליך זה הוא אידיאלי ללימוד שליטה העצבית של תנועתיות ולא פעולות הפרשה של ENS. השיטה שהוצגה כאן תוצאות בתרבות מעורבת של תאי עצב וגליה מעיים. לפחות שני סוגים שונים של תאי עצב מבוססים על תצפיות בהווה ואלקטרו immunocytochemical קודמות 9. הנוכחות של גליה היא יתרון מאוד, כפי שהם לא רק סוג תא חשוב ללמוד בזכות עצמם, אבל הם תורמים להישרדות של תאי עצב enteric 10 ולשמור על ביטוי הקולטן מולדת על פני התא העצבי 11. יתר על כן, ליקויים של גליה enteric עלולים להוביל למצבים חריגים במערכת העיכול מחלות תנועתיות, טבע 12 &#39;נוירו gliopathies&#39;. לכן, תרבות ENS מוצגת כאן Results בכמה סוגי תאים כי הם בשלים לחקירה. היתרונות למתודולוגיה זו הם להקל על בידוד, דרישות כלי זולות, וזמן קצר כדי ללמוד את הטכניקה על ידי אנשי מעבדה מנוסים. מגבלות המתודולוגיה כוללות תשואה נמוכה כוללת של תאים מרקמות כרכים גבוהים והרחקה של נוירונים ENS מplexi הרירי וsubmucosal. הליך זה יהיה יתרון מאוד לחוקרים המתמחים באלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, תא בודד PCR, ושיטות אחרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12-545-82</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P6407- 5 mg</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:171px;">CELLTREAT</td>
			<td style="width:137px;">229124</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:171px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">354 232</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">ddH2O</td>
			<td style="width:171px;"> </td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;">Can prepare in lab </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">15 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">188261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">50 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">227261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP358-212</td>
			<td style="width:79px;">MW 58.44</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP366-500</td>
			<td style="width:79px;">MW 74.55</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaH2PO4 .2H2O</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">S369-3</td>
			<td style="width:79px;">MW137.99</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">MgSO4</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M7506-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 120.4</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S6014-5KG</td>
			<td style="width:79px;">MW 84.01</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">glucose</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">D16-1</td>
			<td style="width:79px;">MW 180.16</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">CaCl22H2O</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">C5080-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 147.02</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">F12 media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">11330</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:137px;">110-001-101HI</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibiotic/antimycotic 100x liquid</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">15240-062</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Neurobasal A media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">10888</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">25030164</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)</td>
			<td style="width:171px;">Neuromics</td>
			<td style="width:137px;">PR27022</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">8940</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-812-41</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">23-400-101</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">250 ml Graduated Glass Beaker</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-100-250</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 L Glass Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-500-2000</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Plastic rod (child&#39;s paint brush)</td>
			<td style="width:171px;">Crayola</td>
			<td style="width:137px;">05 3516</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">Carbogen</td>
			<td style="width:171px;">Airgas</td>
			<td style="width:137px;">UN 3156</td>
			<td style="width:79px;">5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">10 ml Leur-lock Syringe</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">309604</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">305167</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:171px;">Worthington</td>
			<td style="width:137px;">LS004174</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:291px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">American Bioanalytical</td>
			<td rowspan="2" style="width:137px;">AB00440</td>
			<td rowspan="2" style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-864-252</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Nitrex Mesh 500 &#181;M</td>
			<td style="width:171px;">Elko Filtering Co</td>
			<td style="width:137px;">100560</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Pipette Set</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">21-377-328</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharpeining Stone</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">NC9681212</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:195px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td style="width:108px;">Nuaire</td>
			<td style="width:137px;">NU-425-400</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">10 L Shaking Waterbath</td>
			<td style="width:108px;">Edvotek</td>
			<td style="width:137px;">5027</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:283px;">Microcentrifuge 5417R</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">5417R</td>
			<td style="width:195px;">May use a single larger centrifuge with size adapters</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">Allegra 6 Series Centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">366816</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">HuluMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15920D</td>
			<td style="width:195px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Nuiare</td>
			<td style="width:137px;">NU-4750</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">Analytical Balance Scale</td>
			<td style="width:108px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:137px;">XS104</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse

מערכת העצבים enteric היא רשת עצומה של תאי עצב וגליה לאורכו של מערכת העיכול ששולטת תפקודי תנועתיות מערכת העיכול. הליך לבידוד והתרבות של אוכלוסייה מעורבת של תאי עצב וגליה ממקלעת myenteric מתואר. יכולות להישמר בתרבויות העיקריות במשך 7 ימים, עם קשרים המתפתחים בין תאי עצב וגליה. רצועת השריר האורכי עם myenteric מקלעת המצורפת הוא נגזל השריר המעגלי הבסיסי של המעי גס והעכבר או נתון לעיכול אנזימטי. בתנאים סטריליים, האוכלוסייה העצבית וגליה המבודדת נשמרות בתוך צנטריפוגה הבאה גלולה ומצופית על coverslips. בתוך 24-48 שעות, תוצאה neurite מתרחשת ויכול להיות מזוהה על ידי תאי עצב סמני הפאן עצביים. לאחר יומיים בתרבות, פוטנציאל פעולת אש נוירונים בודד כפי שנצפה על ידי מחקרי מהדק תיקון. יתר על כן, גליה enteric יכולה להיות גם identifמטען חבלה על ידי צביעת GFAP. רשת של נוירונים וגליה בפרד קרוב יוצרת בתוך 5 - 7 ימים. נוירונים מעיים יכולים להיות פרטני וישירות נחקרו באמצעות שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה, electrophysiology, הדמיה סידן, ותא בודד PCR. יתר על כן, ניתן לבצע הליך זה בבעלי חיים מהונדסים גנטי. מתודולוגיה זו היא פשוטה לביצוע ולא יקר. באופן כללי, פרוטוקול זה חושף את המרכיבים של מערכת העצבים enteric באופן מניפולציות בקלות, כך שאנו עשויים לגלות טובים יותר את הפונקציונליות של ENS במדינות נורמליות ומחלה.

<html> מייד לאחר הבידוד של תאים שמקורם LMMP, נוירונים וסוגי תאים אחרים לא יהיה מוכן מאליו. חיים, ניתן לראות תאים עגולים של הפנוטיפ לא ברור, כמו גם שאריות רקמה מברי רקמה מתעכלים חלקי ורקמות חיבור. סחופה זה לא עניין ויוסרה במידה רבה עם שינוי התקשורת הראשונה ביומיים. אל תנסו לנ?...

Watch this Scientific Journal Video about An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse at JoVE.com

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology, immunohistochemical,<em&gt; וכו &#39;</em&gt;.

<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

26.7K Views.  Virginia Commonwealth University. אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology, immunohistochemical, וכו '.

Video: An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

אפנון סביבתי של מספר המוח התיכון דופמין נוירונים בעכברים בוגרים

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...