Sağlık Hibe DA024009 Ulusal Enstitüsü, DK046367 &amp; T32DA007027.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürlere uygun olarak ve Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. 24-yuvalı plakalar içinde steril Poli-D-lizin ve laminin kaplı cam lameller hazırlanması <ol><li> Adım 1 için tüm işlemler steril koşullarda yapılmaktadır, bir başlık altında ve steril reaktifler ile. Cam lamelleri ve çift deiyonize su (GKD 2 O) önceden sterilize edilmelidir. Tabak hazırlanması nöron izolasyonu önce iki hafta kadar yapılabilir. </li><li> Kaputun altında, bir 24 plaka 12 kuyu otoklava cam lamelleri yerleştirmek için steril forseps kullanabilir. </li><li> Vaktinden poli-D-lizin stok hazırlayın. 5 mg poli-D-lisin ile steril ddH2O 50 ml ilave edilir. -20 ° C&#39;de vorteks ve 3 ml alikotları mağaza Kullanmadan önce alikotları çözülme. </li><li> Pipet 80 ul: 25 cm2 başına 1 ml poli-D-lizin hazır bir son konsantrasyon için,Her bir cam lamel üzerine (2 cm 2) üstüne poli-D-lisin stoklar. Çözüm 10 dakika dinlendiriniz. </li><li> Poli-D-lizin kullanarak vakum çıkarın ve steril GKD 2 O. ile 3x lamelleri yıkayın </li><li> Plakaları başlık altında en az 2 saat kurumasını bekleyin. </li><li> Plakalar 4 ° C veya saklanabilir - 20 ° C laminin kaplama geçmeden önce. </li><li> Vaktinden laminin stok hazırlayın. Buz üzerinde laminin çözülme ve kullanım sırasında buz üzerinde tutmak. 50 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltilir; konsantrasyonu çok dikkat edin; her biri çok farklı olacaktır. Çok konsantrasyonuna bağlı olarak, yaklaşık 20 ml GKD 2 O laminin her flakon eklenecektir. -80 Alikot (5 mi) ve mağaza ° C Kullanmadan önce buz üzerinde hacimde çözülme. </li><li> 5 mg / cm 2 laminin ile kaplayın lamelleri, her lamel laminin stok pipet 200 ul. </li><li> 1 saat boyunca lamelleri, laminin çözelti inkübe edin. </li><li> Kalan laminin çözüm aspire ve bir kez lamelleri yıkayınGKD 2 O. Lamelleri yüzey kazıma kaçının. </li><li> Kadar iki hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın plakalar. </li></ol> 2. Nöron İzolasyon Çözümleri önceden hazırlanması <ol><li> (: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 25 NaHCO3, 11 glikoz ve 2.5 CaCl 2 NaH mM) Krebs çözeltisi hazırlayın. Yeri 13.79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO 4 (FW 120.4), 4.20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3.96 g glukoz (FW 180.2), ve 2 L GKD 2 0 içinde 0.555 g CaCI2 (FW 111). 4 ° C&#39;ye soğutun </li><li> Ortamı (% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik / antimikotik ile F12 ortamı) durulama hazırlayın: F12 ortamı 500 ml&#39;lik bir şişe için 50 ml FBS ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı (Gibco) ve 5 ml ekleyin. </li><li> Enterik nöron ortamı (Neurobasal B-27 içeren bir ortam, 2 mM L-glutamin,% 1 FBS, 10 ng / ml, gliyalden türevlenmiş Neurotr hazırlanmasıophic faktör (GDNF) ve antibiyotik / antimikotik 100x sıvı). GDNF stok yapmak için, -80 ° C de 10 mg GDNF için 1 ml GKD 2 O ekleyin ve 50 ul alikotları, mağaza geri dondurma Tam nöron bir ortam 50 ml&#39;lik bir şişe için, 47.5 mi Neurobasal bir ortam, 1 mi B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 ul 200 mM L-glutamin (Gibco) ve 50 ul stok GDNF ve 500 ul / antibiyotik kombine antimikotik 100x Sıvı. Medya GDNF tazelik sağlamak ve bu pahalı cep medya karışımı büyük miktarda kirlenmesini önlemek için küçük 50 ml gruplar halinde yapılır. </li></ol> 3. Fareler ile hasat boyuna kas / myenterik Pleksus (LMMP) hazırlanması <ol><li> Hayvan deneylerinde gerçekleştirmeden önce uygun ulusal ve kurumsal etik yerinde olmalıdır. 25 g (genellikle yaş 8 hafta boyunca) üzerinden ağırlığında Yetişkin Swiss Webster fareler önce deneylere 6 gruplar halinde yerleştirilmiştir. İki farelerden alınan dokular İleal enterik nöronlar ve glia izolasyonu için kullanılır ve üç farenin için kullanılırkolon hücrelerin izolasyonu. </li><li> Cerrahi alan hazırlayın. Küçük cerrahi makas, açılı forseps, pamuklu, üç 200 ml cam bardak ve cam / plastik çubuk (fırça) toplayın. Tüm malzemeleri iyice yıkanmış ve kontaminasyonu en aza indirmek için kullanmadan önce durulanır olun. Bu adım, deney bir gün önce gerçekleştirilebilir. </li><li> PH stabilize etmek için, en az 30 dakika karbojen (% 95 oksijen,% 5 CO2) buz ve kabarcık Krebs çözeltisi yerleştirin. </li><li> Istenen sıcaklıklarda stabilize etmek için çeşitli ekipman ve sıcak kimyasal açmak; 37 ile sıcak su banyosu (ler) ° 4 ° C&#39;de, bir yer Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve su banyosu içinde% 0.5 tripsin (37 ° C-C, serin santrifüj .) Komple nöron medya ve durulama medya buzdolabında kalmalıdır. </li><li> Yeri 150 ml buz gibi &#39;kirli&#39;, &#39;temiz&#39; ve &#39;LMMP&#39; etiketli üç 200 ml cam bardak içinde Krebs kabarmış. Kabarcık beher carbogen ile &#39;LMMP&#39; etiketli. </li><li> Etik kurul, euthanize m onayından sonraservikal dislokasyon veya CO 2 boğulma ouse. </li><li> % 70 EtOH ile cerrahi yüzey, temiz cilde dorsal recumbence fare yerleştirin ve forseps kullanarak karın cilt kaldırın. Makas, açık karın boşluğu ve iç sindirim organları ortaya kullanma. </li><li> Ileum bir bölüm kaldırma ve mezenteri ortaya çıkararak, gastrointestinal yolun uzunluğu çıkarın. Makasla mezenter ile Snip yavaşça çıkarın ve ileum / kolondan mezenter çekmek için dikkatli olmak, ileum ve kolon çözülmeye. </li><li> Bağırsak tam uzunlukta sökülmüş sonra, bağırsak yoluyla çekum için mide distalinde ve proksimal keserek ileum çıkarın Not:. Bu prosedür de proksimalinde için çekum için distalinden kolon kaldırarak kolon doku ile yapılabilir anüs. </li><li> Dokular daha proksimal ve distal kolon ve jejenum ve ileum arasında bölünebilir. Bu işlemi geri kalanı ileum izolasyonu sevk edecektir; to işlem kolon LMMP en izolasyonu için aynıdır. Buz Krebs &#39;kirli&#39; olarak işaretlenmiş bir cam kapta tüm ileum yerleştirin. </li><li> Ileum temizlemek için bir araç oluşturmak ve bir dosyalama taş kullanarak künt büyük 20 G iğne buz soğuk Krebs içeren büyük bir şırınga (10 ml) ekleyin. </li><li> Üç ya da daha fazla büyük parçalar halinde ileum kesit tarafından ilumundan dışkı temizleyin. Beher bir ileal kısmını çıkarın ve bir ileal parçasının ucunu Kör İğne yerleştirin. </li><li> Tüm dışkı ayrı bir atık kabı içine kaldırılır kadar yavaşça bağırsak bölümü üzerinden Krebs çalıştırın. &#39;Temiz&#39; olarak işaretlenmiş Krebs kaba temizlenmiş bölümüne yerleştirin. Tüm ileum temizlenir kadar tekrarlayın. </li><li> LMMP kaldırmak için, yaklaşık 2, küçük bölümler halinde ileum kesmek - 4 cm. Bir plastik veya cam çubuk üzerinde ileum bir segment yerleştirin; ileum kuytu uygun ama (~ 2 mm) gevşek veya gergin olmamalıdır. Yavaşça mezenter parçaları kaldırarak LMMP çıkarılması başlayın hala eklemekBir forseps kullanarak gastrointestinal (Gİ) sistem için ed. Yavaşça başparmak kullanarak çubuk için tüp iğneleyerek çubuk etrafında dönmesini gastrointestinal önleyin. </li><li> Temel dairesel kas LMMP ayırın, önce hafifçe hafifçe uzunlamasına kas bir boşluk yaratarak, üst segment altına, mezenter bağlı olduğu tüm hat boyunca forseps kenarına sürün. Sonra yavaşça Krebs ile ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanarak uzunlamasına kas uzak kızdırmak. </li><li> Uzunlamasına kas boşluğu üst başlar ve uzunlamasına kas sadece dairesel kas ayrı başlayana kadar çok hafif bir basınç uygularken hafif yatay vuruş kullanarak uzak kızdırmak; mezenter bağlantı noktası birlikte tüm şerit aşağı yapıyoruz. </li><li> Sonra yavaşça GI tüp etrafında çalışmaya başlar, boyuna kas yavaş yavaş tüp etrafında dairesel kas tüm yol ayrılır gibi yukarıdan aşağıya ve geriye hareket. Tamamlandığında,LMMP doğal olarak GI borusunun kalanı kapalı gelecektir. </li><li> &#39;LMMP&#39; işaretli beher uzunlamasına kas elde edilen ince bir şerit yerleştirin. Tüm kesimleri için tekrarlayın. </li><li> LMMP tüm şeritler tek bir fare elde edildikten sonra, kullanılan diğer fareler için işlemi tekrarlayın. Iyice Tekrar kullanmadan önce &#39;kirli&#39; ve &#39;temiz&#39; bardak durulayın. </li><li> Biyolojik kirlenme kaldırmak için 3x LMMP durulayın. Buz Krebs ile üç 2 ml Eppendorf tüpleri doldurun. Bir santrifüj içinde 356 x g&#39;de 30 saniye boyunca ilk tüp ve spin LMMP şeritleri yerleştirmek 4 ° C&#39;ye kadar soğutuldu Dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve sonraki temiz Krebs dolu tüpe LMMP şeritler hareket ettirin. Kalan her tüp için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol> 4. Digest LMMP <ol><li> 10 ml carbogen-kabarmış Krebs solüsyonu 13 mg kollajenaz tip 2 ve 3 mg BSA koyarak sindirim çözeltisi hazırlayın. </li><li> Sindirim çözüm ve kullanım SCIS içine durulanır LMMP Yeri segmentlerisors küçük parçalar halinde LMMP snip için. </li><li> ° C su banyosunda çalkalayıcı ile 37 60 dakika hafifçe carbogen ile kabarmış olan süre Digest LMMP. </li><li> Sindirim tamamlandıktan sonra, 356 x g&#39;de santrifüj az 8 dakika boyunca santrifüj hücreleri toplamak için 4 ° C&#39;de soğutuldu </li><li> Bu noktadan itibaren tüm işlemler bir hücre kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır! Tüm reaktifler ve kaplar kullanımdan önce sterilize edilmelidir. </li><li> Santrifüj sırasında, 1 mi yerleştirerek% 0.05 tripsin solüsyonu hazırlamak% 0.25 tripsin ısıtıldı ve 4 ml steril bir 50 ml hücre kültür tüpüne HBSS ısıtıldı. </li><li> Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. Bir vakum kullanmayın, bu olasılığı düşük santrifüj hızı nedeniyle hücre pelet emmek olacaktır. Dikkatlice% 0.05 tripsin solüsyonu 5 ml temiz bir tüp içine hücre pelet ve yer çıkarın. </li><li> 37 7 dakika boyunca çalkalanarak ° C su banyosu içinde% 0.05 tripsin solüsyonu hücreleri Digest. 7 mi aşmayınn toplam tripsin tedavi ya da nöronların yok olacak. </li><li> Tripsin muamelesi 7 dakika sonra soğuk durulama ortam 10 ml tripsin nötralize edilir. </li><li> 356 x g 8 dakika hücreler santrifüj. Çıkarın ve medya atın. </li><li> Santrifüj sırasında, steril bir 15 ml&#39;lik hücre kültürünün tüpün üstüne sterilize Nitex örgü bir bölümü dengesi. </li><li> Santrifüj sonra, kaldırmak ve supernatant atın. 3 ml tam ortam nöron içinde öğütülerek yavaşça tekrar süspansiyon hücre karışımı. Bu adımı ve hücre karışımı toz haline olduğu gelecekteki tüm adımları sırasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Tüm triturations çok nazikçe yapılmalıdır. Temiz 15 ml hücre kültürü tüp içine Nitex örgü süzülür hücre çözümü. </li><li> İsteğe bağlı: Cap hücre kültürü tüp ve 30 dakika için hafif haddeleme ve devirme ile soğutmalı Hula mikser yer (veya dönme sağlayan herhangi bir mikser). Bu adım isteğe bağlıdır, ancak önerilen olduğunu. </li><li> İsteğe bağlı: Hula mikser sonra hücreler yıkamak için 2 ml soğuk durulama medya ekleyin. </li><li> Santrifüj hücreleri (8 dk, 356 x g) toplayın. Çıkarın ve supernatant atın. </li><li> 1.200 ul tam nöron medya hücreleri tekrar süspansiyon. Yavaşça 1 ml plastik pipet kullanarak hücreleri Karışım. Hava kabarcıkları oluşturmaz. En parçalar kırık ve hücrelere sıvı içine askıya kadar yavaş ve nazikçe pipetle. </li><li> Bir ön-kaplamalı cam lamel içeren 12 gözeneği için tam ortam 750 ul ilave edilerek ezildi hücre çözeltisinden 100 ul ilave edin. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe inkübe nöronlar. </li><li> Hücre ortamı her 2 günde bir yarısı değiştirin. </li><li> Nöronlar 1 sonra elektrofizyolojik kayıtlar için hazır - kültüründe 2 gün. </li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system:+A+second+brain.">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li><li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+lytic,+latent,+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons.">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li><li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li><li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig.">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li><li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig.">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li><li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia.">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li><li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation.">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li><li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels.">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li><li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities:+Introducing+the+neuro-gliopathies.">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li><li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+genetics,+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice.">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li><li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract.">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li><li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin.">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li></ol>

Yazarlar önemli bir çıkar çatışması var olduğunu beyan ederim.

Kullanılan hayvanların Bu protokol İsviçre Webster fareler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, sıçan gibi diğer küçük ölçekli memelilere ve farenin diğer suşları için de uyarlanabilir. Biz başarıyla C57 fare ve μ-opioid reseptör knock-çıkışları ile ön izolasyonları gerçekleştirdik. Ancak, bu farelerin diğer suşları GI morfolojik farklılıklar nedeniyle sorunlu olabilir olması da mümkündür. Ayrıca, nihai izolasyon nöronların çıkan k...

Enterik sinir sistemi (ENS) sinir ve gastrointestinal (Gİ) sistem ve tüm uzunluğu çalışır glia geniş bir ağdır. ENS işlevsel peristaltizm, sıvı emme / salgılanması, uyaranların hissi, vb (yorum için 1) da dahil olmak üzere sindirim tüm yönleriyle, kontrol eder. Bu omurilik bulunan fazla 500 milyon nöron içerir ve beyinde bulunan her nörotransmitter sınıf içerir. Ayrıca, ENS bu merkezi sinir sistemi 2 girişi olmadan refleks olarak işlev görebilir benzersizdir. ENS anlaşılması normal fizyolojik rolünü anlamak için, ama (en Hirschsprung hastalığı), satın alınan (Chagas), hastalık durumları (diyabetik gastroparezi) bağlı, ilaç doğumsal olabilir nöropati çeşitli katılımının anlamak için değil sadece, çok önemlidir bağlı (opioid bağırsak sendromu) ya da yaralanma (postoperatif ileus) 1. nedeniyle. Buna ek olarak, enterik nöronlar yeniden olabilirviral enfeksiyon (varisella zoster) 3 servoir. Çünkü beyin ve bağırsak serotonin yüksek düzeyde olan benzerlikler, merkezi sinir sistemi kusurları tedavi edilmesini amaçlayan ilaçlar genellikle ENS 2 istenmeyen yan etkileri vardır. Bu tür Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi birçok nöropatiler ENS bu hastalıkların 4 patogenezinde incelemek için bir kolay kullanılabilir hale, merkezi nöronlarda kendi görünümünü çok önce enterik nöronların benzer hücresel değişiklikler gösteriyor olması da dikkat çekicidir. Bu nedenle, ENS tam bir anlayış hastalık durumları anlama ve farmakolojik yan etkileri önlemede / tahmin bir zorunluluktur. ENS olan nöronlar geleneksel olarak 8. 5-7 veya kültür nöronlar wholemount hazırlıkları kullanarak kobay olarak incelenmiştir. Nöronların bu büyük hayvan okudu olabilir hangi kolaylığı rağmen, bu model de dahil olmak üzere birçok sınırlamalar vardırgenetiği değiştirilmiş suşları, bu türe özgü reaktifler eksikliği ve bu konularda sipariş ve konut ile ilgili yüksek maliyetli olmaması. Bir kemirgen enterik sinir sistemi modeli geliştirme sistemleri, hücre kültürü tekniği ile birlikte kullanılabilecek diğer yöntemler arasında kurulan geniş bir dizi ve kobay modeli için bir doğrulama sağlama yeteneği üzerinden vuruş çeşitli en önemli avantajı vardır . Bağırsak peristaltik eylemleri için esas sorumlu olan dış myenterik pleksus (uzunlamasına ve dairesel kas arasında), hem de submukozal ve mukozal pleksi, (: ENS gastrointestinal sistem uzunluğu çalışan üç pleksi oluşur büyük ölçüde sıvı emilimi / salgılanmasını uyaran ve 1 algılama kontrol mukoza, sırasıyla) altında ve içinde bulunan. Bu yöntem, soyma ile uzunlamasına kas / myenterik pleksus (LMMP) hazırlık izolasyonu ile başlargastrointestinal dış kas tabakası kapalı. Bu dramatik mukoza tabakası izolasyon söz konusu olduğunda ortaya çıkan kirlenme sorunları azalır. Sonuç olarak, bu işlem oldukça ENS salgı işlemleri daha motilite sinirsel kontrolü çalışma için idealdir. Yöntemi burada enterik nöronlar ve glia karışık bir kültür sonuçlarını sundu. Nöronların en az iki farklı türde önceki mevcut elektrofizyolojik ve immünositokimyasal gözlemler 9 dayanmaktadır. Glia varlığı kendi başlarına çalışmak için önemli bir hücre tipi sadece gibi, son derece avantajlıdır, ancak enterik nöronlar 10 hayatta kalma katkıda bulunmak ve nöronal hücre yüzeyinde 11 yerli reseptör ifade korumak. Ayrıca, enterik glia eksiklikleri &#39;nöro-gliopathies&#39; 12 icat anormal gastrointestinal motilite hastalık durumları, yol açabilir. Bu nedenle, ENS kültür Burada yer RSoruşturma için olgunlaşmış birkaç hücre tiplerinde onu ç lar. Bu yöntem için avantajları izolasyon, ucuz araç gereksinimleri ve deneyimli laboratuvar personeli tarafından teknik ana kısa bir süre kolaylığı vardır. Metodoloji sınırlamaları düşük genel hücreli yüksek doku birimleri verim ve mukozal ve submukozal pleksi gelen ENS nöronların dışlama içerir. Bu işlem elektrofizyoloji, immünhistokimya, tek hücreli PCR ve diğer yöntemler konusunda uzmanlaşmış bilim adamları için son derece avantajlı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12-545-82</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P6407- 5 mg</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:171px;">CELLTREAT</td>
			<td style="width:137px;">229124</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:171px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">354 232</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">ddH2O</td>
			<td style="width:171px;"> </td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;">Can prepare in lab </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">15 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">188261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">50 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">227261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP358-212</td>
			<td style="width:79px;">MW 58.44</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP366-500</td>
			<td style="width:79px;">MW 74.55</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaH2PO4 .2H2O</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">S369-3</td>
			<td style="width:79px;">MW137.99</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">MgSO4</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M7506-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 120.4</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S6014-5KG</td>
			<td style="width:79px;">MW 84.01</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">glucose</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">D16-1</td>
			<td style="width:79px;">MW 180.16</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">CaCl22H2O</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">C5080-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 147.02</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">F12 media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">11330</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:137px;">110-001-101HI</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibiotic/antimycotic 100x liquid</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">15240-062</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Neurobasal A media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">10888</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">25030164</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)</td>
			<td style="width:171px;">Neuromics</td>
			<td style="width:137px;">PR27022</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">8940</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-812-41</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">23-400-101</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">250 ml Graduated Glass Beaker</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-100-250</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 L Glass Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-500-2000</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Plastic rod (child&#39;s paint brush)</td>
			<td style="width:171px;">Crayola</td>
			<td style="width:137px;">05 3516</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">Carbogen</td>
			<td style="width:171px;">Airgas</td>
			<td style="width:137px;">UN 3156</td>
			<td style="width:79px;">5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">10 ml Leur-lock Syringe</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">309604</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">305167</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:171px;">Worthington</td>
			<td style="width:137px;">LS004174</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:291px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">American Bioanalytical</td>
			<td rowspan="2" style="width:137px;">AB00440</td>
			<td rowspan="2" style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-864-252</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Nitrex Mesh 500 &#181;M</td>
			<td style="width:171px;">Elko Filtering Co</td>
			<td style="width:137px;">100560</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Pipette Set</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">21-377-328</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharpeining Stone</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">NC9681212</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:195px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td style="width:108px;">Nuaire</td>
			<td style="width:137px;">NU-425-400</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">10 L Shaking Waterbath</td>
			<td style="width:108px;">Edvotek</td>
			<td style="width:137px;">5027</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:283px;">Microcentrifuge 5417R</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">5417R</td>
			<td style="width:195px;">May use a single larger centrifuge with size adapters</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">Allegra 6 Series Centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">366816</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">HuluMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15920D</td>
			<td style="width:195px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Nuiare</td>
			<td style="width:137px;">NU-4750</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">Analytical Balance Scale</td>
			<td style="width:108px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:137px;">XS104</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse

Enterik sinir sistemi fonksiyonel mide-bağırsak hareketliliği kontrol gastrointestinal uzunluğu çalışan nöronlar ve glia geniş bir ağdır. Myenterik pleksustan nöron ve glia karışık bir nüfus izolasyonu ve kültürü için bir prosedür açıklanmıştır. Primer kültürlerinde nöronlar ve glia arasında gelişmekte olan bağlantıları ile, 7 gün boyunca korunabilir. Ekli myenterik pleksus ile uzunlamasına kas şerit fare ileum ya da kolon altında yatan dairesel kas sıyrıldı ve enzimatik sindirim tabi tutulur. Steril koşullar altında, izole edilmiş nöronal ve glial nüfus pelet aşağıdaki santrifüj içinde korunmuş ve lamelleri kaplama. 24-48 saat içinde, akson uzantısı oluşur ve nöronlar pan-nöronal belirteçler ile tespit edilebilir. Kültür içinde iki günden sonra izole nöronların yangın aksiyon potansiyelleri olarak yama kelepçe çalışmalar tarafından gözlenmiştir. Ayrıca, enterik glia da identif olabilirGFAP boyama ile ied. Yakın apozisyon nöronların ve glia bir ağ 5 içinde oluşturur - 7 gün. Enterik nöronların tek tek olması ve doğrudan bu immünhistokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve tek hücreli PCR gibi yöntemler kullanılarak incelenmiştir olabilir. Ayrıca, bu prosedür genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Bu metodoloji gerçekleştirmek için basit ve ucuzdur. Daha iyi normal ve hastalık durumlarında, ENS özelliğe keşfedebilir, böylece genel olarak, bu protokol, kolayca manipüle şekilde enterik sinir sisteminin bileşenlerini ortaya koyar.

<html> LMMP türetilmiş hücreler, nöronlar ve diğer hücre tipleri arasında hemen takip eden izolasyon kolayca belirgin olmayacaktır. Yaşam, belirsiz fenotip yuvarlak hücreler de tam olarak sindirilir doku parçaları ve bağ dokusu doku döküntü olarak görülebilir. Bu ayaktakımı hiçbir endişe ve büyük ölçüde iki gün içinde ilk medya değişikliği ile kaldırılacak. Sağlıklı, canlı hücreler de silinecektir bu önce slaytlar temizlemek için çalışmayın. Kült?...

Watch this Scientific Journal Video about An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse at JoVE.com

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan hazırlanır<em&gt; Vb</em&gt;.

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

26.6K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University. Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan hazırlanır Vb.

Video: An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Yetişkin doğmuş Nöronlar Entegrasyon incelenmesi

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Nörobilim

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Bir<em&gt; İn Vitro</emKas afferentlerin tahrik Properties incelenmesi için&gt; Yetişkin Fare kas-sinir Hazırlık

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, interactions with our environment can induce brain plasticity. Increasingly, research is trying to identify which environments stimulate brain plasticity beneficial for treating brain and behavioral disorders. Two environmental manipulations are described which increase or decrease the number of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH+, the rate-limiting enzyme in dopamine (DA) synthesis) neurons in the adult mouse midbrain. The first comprises pairing male and female mice together continuously for 1 week, which increases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in males, but decreases midbrain TH+ neurons by approximately 12% in females. The second comprises housing mice continuously for 2 weeks in &#8216;enriched environments&#8217; (EE) containing running wheels, toys, ropes, nesting material, etc., which increases midbrain TH+ neurons by approximately 14% in males. Additionally, a protocol is described for concurrently infusing drugs directly into the midbrain during these environmental manipulations to help identify mechanisms underlying environmentally-induced brain plasticity. For example, EE-induction of more midbrain TH+ neurons is abolished by concurrent blockade of synaptic input onto midbrain neurons. Together, these data indicate that information about the environment is relayed via synaptic input to midbrain neurons to switch on or off expression of &#8216;DA&#8217; genes. Thus, appropriate environmental stimulation, or drug targeting of the underlying mechanisms, might be helpful for treating brain and behavioral disorders associated with imbalances in midbrain DA (e.g. Parkinson&#8217;s disease, attention deficit and hyperactivity disorder, schizophrenia, and drug addiction).

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Yetişkin Farelerde Orta beyin dopamin Nöronlar Sayısının Çevre Modülleri

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.