אנו מודים לאסיה סמירנוב ולורה Gonyar לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH r00 TW008042 וR01 AI097312 לAKCMBJ נתמכים בחלקו על ידי NIH T32 AI007046.

1. הערכת הכדאיות בקטריאלי עם יודיד Propidium וSYTO9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ&quot;מ ב24 גם צלחות עם חיידקים של עניין. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעם אחת בעדינות ב0.1 M 3 - (N-morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים), pH 7.2, המכילה 1 מ&quot;מ MgCl 2 (מגבים / MgCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך בטמפרטורת חדר עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. </li></ol> הערה: ניהול שולט עם חיידקי חיים ומתים, בהיעדרם של תאי מארח, כדי להראות כי לקטינים או נוגדנים של עניין מחייבים את כל החיידקים ללא קשר לכדאיות (איור 1). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים עם מגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מ &#39;עדיה מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר בשידור חי / המלח מכתים פתרון. בשידור חי / המלח מכתים פתרון הוא 5 SYTO9 מיקרומטר, 30 מיקרומטר יודיד propidium, וsaponin 0.1% (ריכוזים סופיים) במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מרחב זה עם הפנים כלפי מטה על גבי שקופיות זכוכית ולאטום עם לק השקוף. אל תשתמשו בחומרי הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות בתוך 30 דקות, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מערכות סינון בקנה אחד עם רכישת תמונה ירוקה, אדום, ומרחיק אדומה. </li></ol> הערה: שני מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי וכן במיקרוסקופ לייזר confocal הסריקה ניתן להשתמש. לאחר 30 דקות צבעי הניאון מתחילים לדלוף מהחיידקים ואת הנתונים שנרכשו כבר לא מדויקים. תמונות מוצגות במאמר זה נרכשו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזקוף Nikon Eclipse E800 עם מצלמה דיגיטלית האמאמטסו אורקה-ER באמצעות תוכנת OpenLab. הקרינה של אלקסה פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע כחול. הקרינה מן יודיד propidium זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן SYTO9 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים כחולים + אדומים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים אדום בלבד, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים כחולים + ירוקים, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים ירוקים בלבד. לספור לפי העין את המספרים של חיידקים, כי הם nonviable nonviable קיימא חיצוני, פנימי, חיצוני ובת קיימא, ופנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב אחוזים מחיידקי קיימא החיצוניים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא חיצוניים על ידי המספר הכולל של חיידקים חיצוניים (קיימא תוספת nonviמסוגל). לחשב אחוזים מחיידקי קיימא הפנימיים על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא פנימיים במספר הכולל של חיידקים פנימיים (קיימא תוספת nonviable) (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישנם שני פקדים חיוניים לבצע עם פרוטוקול זה. ראשית, לאמת שכל חיידקי nonviable הם יודיד חיובי propidium וכל החיידקים חיים הם SYTO9 חיוביים. תרבות אמצע לוגריתמים של חיידקים (בהעדר כל תאי מארח) צריכה להיות&gt; SYTO9 חיובי 95%. שמוצגת באיור 2 היא תרבות אמצע לוגריתמים של נ &#39; gonorrhoeae (ב10 8 מושבה להרכיב יחידות למ&quot;ל) הודגרו עם בשידור חי / המלח מכתים פתרון. שנית, לאמת כי שני יודיד propidium וSYTO9 יכולים להיכנס permeabilized תאי מארח נגועים,. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור אוכלוסייה של חיידקים מתים, לאסוף 2 x 10 8 מושבה חיידקים ויוצרת יחידות בצינור microfuge 1.5 מיליליטר, להוסיף isopropanol 70% ולשבת ל10 דקות. גלולה החיידקים בmicrofugend לשטוף את החיידקים פעמים PBS להסיר isopropanol שיורית. לאחר מכן בצע פרוטוקול צעדים 1.5-1.7. הוסף 5 μl של השעיה חיידקים לשקופית זכוכית וכיסוי עם coverslip. דגימות תמונה כמו בשלב פרוטוקול 1.9. בתנאים אלה, של האוכלוסייה 100% צריכים להיות יודיד החיובי propidium (איור 2). בחלק ממיני חיידקים, יודיד propidium לא יכול להכניע לחלוטין מכתים SYTO9, וחיידקים nonviable עשויים להופיע צהובים או כתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאי phagocytic כמו נויטרופילים, לחשוף את תאי חיידקים נהרג isopropanol ולהבטיח כי של החיידקים תאיים 100% יודיד החיובי propidium (איור 3). לתאים nonphagocytic שלא יכול להפנים חיידקים מתים, זה עשוי להיות מספיק כדי לטפל בתאים נגועים עם אזיד הנתרן או סוכני תא permeant אחרים מיקרוביאלית לפני הוספה בשידור חי / המלח מכתים פתרון. </li></ol></li></ol> 2. קטריאלי הכדאיות הערכה עם Sytox Green וDAPI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של מורס 25 ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ&quot;מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.5 מיליליטר 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות. </li><li&gt; לרכוש תמונות בתוך 30 דקות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה שלב פרוטוקול 1.9 לתיאור של מיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, ורכישת תוכנה. </li></ol> הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שגוי בצבע אדום. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים יופיעו אדום + ירוק, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים אדום + כחול, והחיידקים קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד (איור 4). לכמת אחוז מחיידקים החיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול STEp 1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3). </li></ol> 3. הערכה בקטריאלי ליכולת הקיום לצד לוקליזציה subcellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי תווית של עניין עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בינונית מוגדר של המורס ל20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים שאינם חסיד ל12 coverslips זכוכית העגול בקוטר מ&quot;מ ב24 גם צלחות עם חיידקים שכותרתו DAPI. אל תתקנו את התאים עם אלדהידים או ממסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעם עם מגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך עם נוגדן אלקסה פלואוריד 647 מצמיד או לקטינים אשר נקשר למיני חיידקים של עניין, במגבים / MgCl 2, כדי לזהות חיידקים חיצוניים. ראה הערה בשלב פרוטוקול 1.3 עבור פקדים שהציע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מהתאים ולשטוף תאים שני times במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם נוגדנים נגד סמן subcellular של ריבית ל20 דקות 555 יחד-Alexa פלואוריד, במגבים / MgCl 2 המכיל saponin 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מהתאים ולהוסיף 0.4 מיקרומטר Sytox ירוק במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים 5 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים פעמיים במגבים / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעם אחת במגבים / MgCl 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של שקופיות בתוך 30 דקות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראה שלב פרוטוקול 1.9 לתיאור של מיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, ורכישת תוכנה. </li></ol> הערה: הקרינה מAlexa פלואוריד 647 זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 590-650 ננומטר ומסנן פליטה של ​​663-735 ננומטר, והוא שווא בצבע סגול. ו הקרינהrom אלקסה פלואוריד 555 זוהה באמצעות מסנן עם גל עירור של 540-580 ננומטר ומסנן פליטה של ​​600-660 ננומטר. הקרינה מן Sytox הירוק זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 465-495 ננומטר ומסנן פליטה של ​​515-555 ננומטר. הקרינה מן DAPI זוהתה באמצעות מסנן עם גל עירור של 355-375 ננומטר ומסנן מחסום 400 ננומטר. <ol start="14" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה יביא לתמונות שבו חיידקי nonviable חיצוניים מופיעים סגולים + ירוקים, חיידקי nonviable פנימיים מופיעים ירוקים + כחולים, חיידקי קיימא חיצוניים מופיעים סגולים + כחולים, חיידקי קיימא פנימיים מופיעים כחולים בלבד, וחלבון subcellular מופיע אדום (איור 4). לכמת את perecent של חיידקי קיימא חיצוניים ופנימיים כמתואר בפרוטוקול הצעדים 1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבקרות מתוארות בשלב פרוטוקול 1.12 צריכה להתבצע עם שילוב הצבע DAPI / Sytox הירוק (איורים 2 ו -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוךבנוסף לספירת חיידקי קיימא וnonviable, לסווג כל חיידקים כחיוביים או שלילי לcolocalization עם סמן subcellular של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב אחוזים מחיידקי קיימא colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי קיימא colocalized במספר הכולל של חיידקים ובת קיימא. לחשב אחוזים מחיידקי nonviable colocalized עם סמן subcellular על ידי חלוקת מספר חיידקי colocalized nonviable במספר הכולל של חיידקי nonviable. </li></ol>

<ol>
	<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77 (2011).</li><li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes.">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li><li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay.">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li><li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).</li><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions.">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+absolute,+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer.">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li><li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization.">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128,+a+fresh-produce+washing+aid,+in+chlorinated+wash+solutions.">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li><li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry:+a+comparison+to+culture-based+techniques.">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).</li><li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils.">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells:+clinical+and+pathogenetic+implications.">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li><li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li><li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection.">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53 (2006).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination:+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages.">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro.">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li><li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells.">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li><li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR.">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li><li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells.">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li><li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages.">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li><li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate,+Tetrahymena+sp.">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li><li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae:+the+requirement+for+hypoxanthine.">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils.">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li><li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain.">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מוצגים כאן הם שני פרוטוקולים המשתמשים DNA מחייב וצבעי כדאיות בשיתוף עם קטיני ניאון כדי לזהות חיידקים חיים ומתים מצורפים ובתוך תאים אנושיים. מכיוון ששני הפרוטוקולים ביעילות להפלות חיים מחיידקים מתים, הבחירה באיזה פרוטוקול של להשתמש תלויה במטרה הניסוי. הפרוטוקול הראש?...

יש אינטראקציה דינמית ואבולוציה משותפת בין חיידקים והמארחים שבו הם מתגוררים. חיידקים התפתחו האברונים דבקות, מערכות הפרשה, ו / או את היכולת לייצר רעלים המאפשרים זיהום הפורה של phagocytic המארח ותאים שאינם phagocytic. החיידקים חייבים גם להתמודד עם הכרה ופעילות מיקרוביאלית של מערכת החיסון המארחת. המערכת החיסונית של המארח מורכבת ממרכיבים מולדים ובעלי כושר הסתגלות, כולל מחסומים פיסיקליים וכימיים, תאי מערכת החיסון, מערכת המשלימה, ורכיבים אחרים של חסינות הלחות. בעוד חיידקים רבים רגישים להרג ולאישור על ידי התגובה חיסונית מארח רב שכבתית, כמה חיידקים פתוגניים ואופורטוניסטיים התפתחו מנגנונים להדביק מגוון רחב של תאי מארח ולחתור תחת אישור על ידי התגובה חיסונית מארח 1. Neisseria gonorrhoeae הוא דוגמא אחת לפתוגן חיידקים כי הוא מותאם מאוד להתמיד במארח האנושי שלה. N. gonorrhoeae קלות colonizes משטחי luminal של תאי האפיתל ברירית של דרכי השתן ואברי המין, לוע, לחמית, ופי טבעת. קולוניזציה מעוררת את גיוס שפע של נויטרופילים באתרים ברירית. הנויטרופילים הם phagocytes המקצועי שיש להם מגוון רחב של תהליכים מיקרוביאלית להרוג מיקרואורגניזמים, עם זאת, נ &#39; gonorrhoeae הוא מסוגל לשרוד בנוכחות של נויטרופילים 2-5. הבנה כיצד חיידקים פתוגנים, כגון נ gonorrhoeae לערער, ​​לדכא, ולחטוף את התגובה החיסונית כדי לשרוד סופו של דבר בסביבות מארח בדרך כלל עוינות הוא קריטי לפיתוח של טיפולים חדשים למאבק במחלות זיהומיות. פרוטוקולי ניסוי משמשים לעתים קרובות כדי לחקור הישרדות חיידקים בתאי מארח כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. במבחני ספירת מושבה, אוכלוסייה של תאים נגועים lysed (למשל, עם חומר ניקוי ל&quot;שich החיידקים עמידים) כדי לשחרר את החיידקים. Lysates הוא בדילול ומצופה על תקשורת מבוססת אגר, ומושבת יוצרי יחידות בlysates ממוספרת עבור כל נקודת זמן ו / או תנאי ניסוי. גישה זו מדווחת על יכולת הקיום של אוכלוסיית החיידקים כולה, אבל הוא לא מסוגל להבדיל בין תאיים והישרדות תאית. וריאציה על assay ספירת מושבה, assay הגנת גנטמיצין, במיוחד מודדת הישרדות חיידקים תאית, המבוסס על חוסר היכולת של גנטמיצין האנטיביוטיקה לחצות את קרום הפלזמה אוקריוטים 6. עם זאת, assay זה תלוי בחיידקים שרגישים להרג על ידי גנטמיצין (אנטיביוטי או אחר, כי הוא קרום impermeant דומה אוקריוטים) וחוסר היכולת של האנטיביוטיקה כדי לקבל גישה לחיידקים פנימיים. לכן, assay הגנת גנטמיצין לא יכול להיות יעיל לבדיקה של כל מיני החיידקים או כאשר בוחנים את הישרדות חיידקים במאודתאי pinocytic כגון נויטרופילים. אף אחת מהגישות הללו חושף את לוקליזציה subcellular או התנהגות של חיידקים בודדים אחרת (למשל, אם החיידקים ליצור אגרגטים או microcolonies שמתנהג בצורה שונה מתאי חיידקים בודדים). גישה בשימוש תכופה נוספת כדי לבחון את הכדאיות של חיידקים חיצוניים ופנימיים בודדים היא מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים דק סעיף (TEM). גישה זו יש יתרון בכך שהוא יכול לספק מידע לגבי מיקומם של החיידקים בתאי מארח (למשל phagosome, ציטופלסמה, autophagosome), אשר יכול להיחקר יותר על ידי מיקרוסקופ immunoelectron עם נוגדני מצמידים זהב נגד סמני subcellular. עם זאת, במיקרוסקופ אלקטרונים אינו רגיש במיוחד בהערכת כדאיות חיידקים. כאשר חלקים מוטבעים מגואלות אצטט uranyl, ציטראט עופרת, או חומרים כימיים אלקטרונים צפופים אחרים וצלמו על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, חיידקי אלקטרונים צפופים נחשבים קיימא וelecטרון-Lucent 7,8 nonviable. עם זאת, הנחה זו מגזים בהערכת כדאיות חיידקים, שכן חיידקים מתים האלה רק עם קרומים ונטולי ציטופלסמה שיבשו קשות מופיעה אלקטרונים לוסנט. בנוסף, חלק ממיני חיידקים עשויים להציג מגוון של צפיפויות אלקטרונים בהתאם לשלב צמיחה שלהם, ולכן קשה לקבוע כדאיות. כחלופה או בנוסף לשיטות בשימוש נרחבת אלה, כאן אנו מספקים פרוטוקולים ורציונל לשימוש בצבעי ניאון שמצביעים על כדאיות בקטריאלי על מנת להעריך את ההישרדות של חיידקים מצורפים והפנימו על ידי תאי מארח. כדי לזהות חיידקים תאיים, תאים נגועים נחשפים ראשון למגיב ניאון, כגון קטינים או נוגדני חיידק ספציפי. לאחר מכן התאים הנגועים permeabilized ונחשפו לצבעי DNA ספציפי שהם באופן דיפרנציאלי נגישים לחיידקים עם שלם לעומת ממברנות מושפלים, כתחליף ליכולת קיום חיידקים. בעמ &#39;הראשונהrotocol, SYTO9 הצבע החדיר הקרום מזהה את אוכלוסיית חיידקים בסך הכל, בעוד יודיד propidium נגיש רק לאלה חיידקים שהתפשרו ממברנות ולכן הן נחשבות nonviable. Propidium יודיד וSYTO9 כבר משמשים להערכת כדאיות חיידקים בbiofilms, להפלות פתוגניים מחיידקי nonpathogenic, ולמנות את החיידקים שמקורן במי קיימא 9-12. בפרוטוקול השני, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מזהה חיידקי סך הכל, בעוד Sytox הירוק הוא נגיש רק לאוכלוסיית nonviable. ניתן לשלב זוגות צבע כדאיות אלה עם immunofluorescence כדי לקבוע את המיקום של כל חיידק ביחס לחלבון של עניין, למשל להגדרת לוקליזציה subcellular חיידקים. השימוש במבחנים אלה מספק תובנה מפתח לתוך האינטראקציות שתגרומנה להרג או להישרדות חיידקים במהלך ההדבקה של תאי מארח. הפרוטוקולים שתוארו במאמר זה שימשו להערכת הכדאיות שלנ gonorrhoeae המחובר ולבתוך נויטרופילים אנושיים ראשוניים, ובכלל זה באוכלוסיות שונות של phagosomes נויטרופילים 5,13,14. עם זאת, יכולים להיות מיושמים על פרוטוקולים אלה כדי להעריך את הכדאיות של חיידקי גרם חיוביים וגרמו שליליים בphagocytes המקצועי, phagocytes הלא מקצועי, ופרוטוזואה 15-24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. פרוטוקולים הנוכחיים כדי לענות על שאלות אלה כוללים מבחני ספירת מושבה, מבחני הגנת גנטמיצין, ומיקרוסקופ אלקטרונים. מבחני ספירת מושבה והגנת גנטמיצין רק להעריך את הכדאיות של אוכלוסיית החיידקים כולה ואינם מסוגלים לקבוע כדאיות חיידקים בודדות. במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע לגבי הלוקליזציה שלהם בתאי מארח. עם זאת, לעתים קרובות חיידקים להציג מגוון רחב של צפיפויות אלקטרונים, ביצוע הערכה של יכולת קיום קשה. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח. מבחני אלו פותחו במקור כדי להעריך הישרדות של Neisseria gonorrhoeae בנויטרופילים אנושיים ראשוניים, אבל צריך להיותpplicable לכל אינטראקציה תא חיידק מארח. פרוטוקולים אלה משלבים צבעי קרום חדיר ניאון (SYTO9 ו4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), שמכתים את כל חיידקים, עם צבעי קרום בלתי חדיר ניאון (יודיד propidium וSytox ירוק), שהם נגישים רק ל חיידקי nonviable. לפני permeabilization תא אוקריוטים, נוגדן או מגיב ניאון מתווסף לזהות חיידקים תאיים. לכן מבחני אלה מפלים את הכדאיות של חיידקים חסידים ולבתוך תאי אוקריוטים. פרוטוקול הוא גם סיפק לשימוש בצבעי הכדאיות בשילוב עם נוגדני ניאון לסמני תא אוקריוטים, על מנת לקבוע את לוקליזציה subcellular של חיידקים בודדים. צבעי כדאיות החיידקים שנדונו במאמר זה הם מוצר משלים רגיש ו / או תחליף לטכניקות מיקרוביולוגיה מסורתיות כדי להעריך את הכדאיות של חיידקים בודדים ולספק מידע בדבר שבו חיידקים לשרוד בתא מארחs.

הפרוטוקולים שתוארו שימשו כדי לבחון קיומה של נ &#39; gonorrhoeae לאחר חשיפה לאדם עיקרי נויטרופילים 5,26. הנויטרופילים היו נגועים בנ gonorrhoeae ומעובד עם פרוטוקול 1, באמצעות SYTO9 צבע כדאיות ירוקת הניאון ויודיד אדום ניאון propidium (איור 4 א). הצבעים נוספו בנוכחות sapo...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells at JoVE.com

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K Views.  University of Virginia Health Sciences Center.  מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח. 

Video: Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...