Ringraziamo Asya Smirnov e Laura Gonyar per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R00 e R01 TW008042 AI097312 a AKCMBJ è stato supportato in parte dal NIH T32 AI007046.

1. Valutare batterica Viabilità con ioduro di propidio e SYTO9 <ol><li> Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri di interesse. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici. </li><li> Lavare le cellule una volta delicatamente in 0.1 M 3 - (N-morfolino) Acido propanosulfonico (MOPS), pH 7.2, contenente 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl 2). </li><li> Incubare le cellule per 10 minuti al buio a temperatura ambiente con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl 2, per rilevare batteri esterni. </li></ol> NOTA: effettuare controlli con batteri vivi e morti, in assenza di cellule ospiti, per dimostrare che la lectina o anticorpi di interesse lega tutti i batteri, indipendentemente della redditività (Figura 1). <ol start="4"><li> Lavare le cellule due volte con MOPS / MgCl 2. </li><li> Aspirare mEDIA da cellule e aggiungere 0,5 ml Live / Morto colorazione soluzione. Live / Morto colorazione soluzione è di 5 micron SYTO9, 30 micron ioduro di propidio, e lo 0,1% di saponina (concentrazioni finali) in MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2. </li><li> Coprioggetto Inverti faccia in giù su vetrini e sigillare con smalto trasparente. Non utilizzare supporti di montaggio. </li><li> Acquisire immagini in 30 minuti, utilizzando un microscopio a fluorescenza con set di filtri compatibili con l&#39;acquisizione di immagini verde, rosso e rosso lontano. </li></ol> NOTA: Sia microscopia a fluorescenza convenzionale e microscopio confocale a scansione laser può essere usato. Dopo 30 minuti i coloranti fluorescenti cominciano a trapelare dai batteri ed i dati acquisiti non sono più accurate. Le immagini mostrate in questo articolo sono stati acquisiti su un microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse E800 verticale con fotocamera digitale Hamamatsu Orca-ER utilizzando il software Openlab. Fluorescenza di Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d&#39;onda di 590-650 nm ed un filtro per le emissioni di 663-735 nm, ed è falso-colore blu. Fluorescenza da ioduro di propidio è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 540-580 nm ed un filtro di emissione di 600-660 nm. Fluorescenza da SYTO9 stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm. <ol start="10"><li> Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono blu + rosso, i batteri non vitali interni appaiono solo rosso, batteri vitali esterne appaiono blu + verde, e batteri vitali interni appaiono solo verde. Contare occhio il numero di batteri che sono esterni non vitale, non vitale interno, esterno praticabile, e interno redditizio. </li><li> Calcolare la percentuale di batteri vitali esterni dividendo il numero di batteri vitali esterni per il numero totale di batteri esterni (vitali più nonvigrado). Calcolare la percentuale di batteri vitali interne dividendo il numero di batteri vitali interne per il numero totale di batteri interne (vitali più non vitale) (Figura 4). </li><li> Ci sono due controlli essenziali per eseguire con questo protocollo. In primo luogo, verificano che tutti i batteri non vitali sono ioduro di propidio-positivi e tutti i batteri vivi sono SYTO9-positivi. Una cultura mid-logaritmica di batteri (in assenza di cellule ospiti) deve essere&gt; 95% SYTO9-positivo. In figura 2 è una cultura medio-logaritmica di N. gonorrhoeae (a 10 8 colonia unità per ml di formatura) incubate con Live / Morto colorazione Solution. In secondo luogo, verificano che sia ioduro di propidio e SYTO9 possono entrare permeabilizzate, cellule ospiti infettate. <ol><li> Per generare una popolazione di batteri morti, raccogliere 2 x 10 8 unità formanti colonia batterica in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 70% di isopropanolo e riposare per 10 min. Pellet i batteri in una microcentrifuga unnd lavare i batteri due volte in PBS per rimuovere isopropanolo residuo. Poi seguire il protocollo passaggi 1,5-1,7. Aggiungere 5 ml di sospensione batterica di un vetrino e sovrapporre con un coprioggetto. Campioni della fotografia come in protocollo step 1.9. In queste condizioni, il 100% della popolazione dovrebbe essere propidio ioduro positivo (Figura 2). In alcune specie batteriche, ioduro di propidio non può sopraffare completamente SYTO9 colorazione e batteri non vitali può apparire di colore giallo o arancione. </li><li> Per fagociti come neutrofili, esporre le cellule di batteri isopropanolo-uccisi e assicurarsi che il 100% dei batteri intracellulari sono propidio ioduro-positive (figura 3). Per le celle nonphagocytic che non può internalizzare batteri morti, può essere sufficiente per trattare cellule infettate con sodio azide o di altri agenti antimicrobici cellule permeante prima di aggiungere Live / Morto colorazione Solution. </li></ol></li></ol> 2. Valutare batterica Viabilità con Sytox Green e DAPI <ol><li> Batteri Label di interessi con 10 mcg / ml DAPI a Morse Definito medio di 25 per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri DAPI-etichettati. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici. </li><li> Lavare le cellule una volta con MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl 2, per rilevare batteri esterni. Vedi nota nel protocollo step 1.3 per i controlli suggeriti. </li><li> Aspirare i media dalle cellule e aggiungere 0,5 ml di 0,4 micron Sytox verde in MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2. </li><li> Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl 2 per 5 min. </li><li&gt; Acquisire immagini all&#39;interno di 30 minuti con un microscopio a fluorescenza. Vedere protocollo step 1.9 per la descrizione di microscopio, macchina fotografica digitale e software di acquisizione. </li></ol> NOTA: Fluorescenza da Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d&#39;onda di 590-650 nm ed un filtro per le emissioni di 663-735 nm, ed è falso-colore rosso. Fluorescenza da Sytox Green è stato rilevato utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm. Fluorescenza da DAPI è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 355-375 nm e filtro barriera 400 nm. <ol start="10"><li> Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono rosso + verde, i batteri non vitali interni appaiono verde + blu, batteri vitali esterne appaiono di colore rosso + blu e batteri vitali interni appaiono blu solo (Figura 4). Quantificare la percentuale di batteri esterni e interni come descritto nel protocollo step 1.11. </li><li> I controlli descritti nel protocollo punto 1.12 devono essere eseguite con il colorante combinazione DAPI / Sytox verde (figure 2 e 3). </li></ol> 3. Valutare batterica Viabilità Accanto localizzazione subcellulare <ol><li> Batteri Label di interessi con 10 mcg / ml DAPI in Piano Definito di Morse per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri DAPI-etichettati. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici. </li><li> Lavare le cellule una volta con MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubare 10 minuti a temperatura ambiente al buio con Alexa Fluor 647 anticorpi accoppiati o lectina che si lega alla specie batteriche di interesse, in MOPS / MgCl 2, per rilevare batteri esterni. Vedi nota nel protocollo step 1.3 per i controlli suggeriti. </li><li> Aspirare i media dalle cellule e lavare le cellule due times in MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubare le cellule con Alexa Fluor 555 anticorpi accoppiati contro marcatore subcellulare di interesse per 20 minuti, in MOPS / MgCl 2 contenente 0,2% saponina. </li><li> Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2. </li><li> Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl 2 per 5 min. </li><li> Aspirare i media dalle cellule e aggiungere 0,4 micron Sytox verde in MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubare le cellule 5 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule due volte in MOPS / MgCl 2. </li><li> Lavare le cellule una volta in MOPS / MgCl 2 per 5 min. </li><li> Acquisire le immagini di diapositive in 30 min a microscopio a fluorescenza. Vedere protocollo step 1.9 per la descrizione di microscopio, macchina fotografica digitale e software di acquisizione. </li></ol> NOTA: Fluorescenza da Alexa Fluor 647 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione lunghezza d&#39;onda di 590-650 nm e filtro di emissione di 663-735 nm, ed è falso-colore viola. Fluorescenza from Alexa Fluor 555 è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 540-580 nm ed un filtro di emissione di 600-660 nm. Fluorescenza da Sytox Green è stato rilevato utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 465-495 nm ed un filtro di emissione di 515-555 nm. Fluorescenza da DAPI è stato rilevato usando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 355-375 nm e filtro barriera 400 nm. <ol start="14"><li> Questo protocollo si tradurrà in immagini in cui i batteri non vitali esterne appaiono viola + verde, i batteri non vitali interni appaiono verde + blu, batteri vitali esterne appaiono viola + blu, batteri vitali interni appaiono blu solo, e proteine ​​subcellulare appare rosso (Figura 4). Quantificare il perecent di batteri vitali interni ed esterni come descritto nel protocollo passaggi 1.11. </li><li> I controlli descritti nel protocollo punto 1.12 devono essere eseguite con il colorante combinazione DAPI / Sytox verde (figure 2 e 3). </li><li> InOltre a contare batteri vitali e non vitali, classificare ogni batteri come positivo o negativo per colocalizzazione con il marker subcellulare di interesse. </li><li> Calcolare la percentuale di batteri vitali colocalized con il marcatore subcellulare dividendo il numero di batteri vitali colocalized per il numero totale di batteri vitali. Calcolare la percentuale di batteri non vitali colocalized con il marcatore subcellulare dividendo il numero di batteri colocalized non vitali per il numero totale di batteri non vitali. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui presentati sono due protocolli che utilizzano legame al DNA e coloranti vitalità in combinazione con una lectina fluorescente per identificare batteri vivi e morti allegate e dentro le cellule umane. Poiché entrambi i protocolli effettivamente discriminare in diretta da batteri morti, la scelta di quale protocollo da utilizzare dipende l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento. Il primo protocollo utilizza ioduro di propidio per rilevare i batteri non vitali e SYTO9 per rilevare i batteri intatti. Mostrato nella <stron...

C&#39;è una interazione dinamica e co-evoluzione tra i batteri ei padroni di casa in cui risiedono. I batteri si sono evoluti organelli aderenza, sistemi di secrezione e / o la capacità di produrre tossine che consentono loro infezione produttiva di phagocytic host e le cellule non fagocitarie. I batteri devono anche vedersela con il riconoscimento e l&#39;attività antimicrobica del sistema immunitario dell&#39;ospite. Il sistema immunitario ospite comprende componenti innate e adattative comprese barriere fisiche e chimiche, cellule immunitarie, il sistema del complemento, e altri componenti di immunità umorale. Mentre molti batteri sono suscettibili di abbattimento e passaggio della risposta immunitaria ospitante multistrato, alcuni batteri patogeni e opportunisti sono evoluti meccanismi per infettare una varietà di cellule ospiti e sovvertire passaggio della risposta immunitaria ospitante 1. Neisseria gonorrhoeae è un esempio di un batterio patogeno che è altamente adattato a persistere nel suo ospite umano. N. gonorrhoeae colonizza facilmente le superfici luminali delle cellule epiteliali della mucosa del tratto urogenitale, faringe, congiuntiva, e del retto. Colonizzazione innesca l&#39;abbondante assunzione di neutrofili nei siti mucosali. I neutrofili sono fagociti professionali che possiedono una varietà di processi antimicrobici per uccidere i microrganismi, tuttavia, N. gonorrhoeae è in grado di sopravvivere in presenza di neutrofili 2-5. Capire come batteri patogeni come N. gonorrhoeae sovvertire, sopprimere, e dirottare la risposta immunitaria a sopravvivere in ultima analisi, in ambienti host normalmente ostili è cruciale per lo sviluppo di nuove terapie per la lotta contro le malattie infettive. Protocolli sperimentali usati spesso per studiare la sopravvivenza dei batteri nelle cellule ospiti comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. In saggi conteggio delle colonie, una popolazione di cellule infette viene lisato (per esempio, con un detergente a which i batteri sono resistenti) per liberare i batteri. I lisati sono diluiti e piastrate su supporti a base di agar, e unità formanti colonie nei lisati vengono enumerate per ciascun punto di tempo e / o condizione sperimentale. Questo approccio riporta la redditività di tutta la popolazione batterica, ma non è in grado di distinguere tra intracellulare ed extracellulare sopravvivenza. Una variazione del dosaggio conteggio delle colonie, il test di protezione gentamicina, misuri specificamente sopravvivenza batterica intracellulare, basato sulla incapacità dei gentamicina antibiotico per attraversare la membrana plasmatica eucariotica 6. Tuttavia, questo test dipende dai batteri essendo suscettibile di uccisione da gentamicina (o altro antibiotico che è simile eucariotico membrana impermeant) e l&#39;incapacità di antibiotico per avere accesso ai batteri interne. Pertanto, un test di protezione gentamicina può non essere efficace per l&#39;esame di tutte le specie batteriche o nell&#39;esame sopravvivenza batterica altamentecellule pinocytic come neutrofili. Nessuno di questi approcci rivela la localizzazione subcellulare o altri comportamenti di batteri individuali (ad esempio, se i batteri formano aggregati o microcolonie che si comportano diversamente da cellule batteriche individuali). Un altro approccio frequentemente utilizzato per esaminare la fattibilità dei singoli batteri esterni e interni è sottile-sezione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questo approccio è vantaggioso in quanto può fornire informazioni sulla posizione dei batteri in cellule ospiti (es phagosome, citoplasma, dell&#39;autofagosoma), che può essere ulteriormente esaminato al microscopio immunoelettronica con anticorpi oro accoppiata contro marcatori subcellulari. Tuttavia, microscopia elettronica non è particolarmente sensibile a valutare vitalità batterica. Quando le sezioni incorporati vengono colorate con acetato di uranile, citrato di piombo, o altri reagenti elettrone-densi e ripreso al microscopio elettronico, i batteri elettrone-densi sono considerati vitali ed elettronichetron-Lucent non vitali 7,8. Tuttavia, questa ipotesi sopravvaluta vitalità batterica, dal momento che solo i batteri morti con membrane gravemente perturbati e privo di citoplasma appare elettrone-Lucent. Inoltre, alcune specie batteriche possono visualizzare una gamma di densità di elettroni a seconda della loro fase di crescita, rendendo difficile determinare la vitalità. In alternativa o in aggiunta a questi metodi ampiamente utilizzati, qui forniamo protocolli e razionale per l&#39;uso di coloranti fluorescenti che indicano vitalità batterica per valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati ae internalizzati dalle cellule ospiti. Per identificare i batteri extracellulari, cellule infettate vengono prima esposti a un reagente fluorescente, come una lectina o anticorpo specifici batteri. Le cellule infettate vengono permeabilizzate ed esposti a coloranti specifici di DNA che sono differenzialmente accessibili ai batteri con membrane intatte vs degradati, come surrogato vitalità batterica. Nel primo protocol, la membrana permeabile colorante SYTO9 identifica la popolazione batterica totale, mentre ioduro di propidio è accessibile solo a quei batteri che hanno compromesso le membrane e sono quindi considerate non vitali. Ioduro di propidio e SYTO9 sono stati utilizzati per valutare la vitalità batterica in biofilm, discriminare patogeni dai batteri non patogeni, ed enumerare a base d&#39;acqua batteri vitali 9-12. Nel secondo protocollo, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) identifica i batteri totali, mentre Sytox verde è accessibile solo alla popolazione non vitali. Queste coppie vitalità coloranti possono essere combinati con immunofluorescenza per determinare la posizione di ciascun batterio in relazione ad una proteina di interesse, ad esempio per definire localizzazione subcellulare batterica. L&#39;uso di questi test fornisce informazioni chiave nelle interazioni che provocano battericida o sopravvivenza durante l&#39;infezione delle cellule ospiti. I protocolli descritti in questo articolo sono stati usati per valutare la fattibilità diN. gonorrhoeae che è attaccato e dentro neutrofili umani primari, tra cui in diverse popolazioni di phagosomes neutrofili 5,13,14. Tuttavia, questi protocolli possono essere applicati per valutare la vitalità dei batteri gram-positivi e gram-negativi in fagociti professionali, fagociti non professionali, e protozoi 15-24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l&#39;esposizione a cellule eucariotiche. Attuali protocolli per affrontare tali questioni comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. Conteggio delle colonie e di protezione gentamicina saggi valutano solo la vitalità di tutta la popolazione batterica e sono in grado di determinare la vitalità batterica individuale. La microscopia elettronica può essere utilizzata per determinare la fattibilità di singoli batteri e fornire informazioni sulla loro localizzazione in cellule ospiti. Tuttavia, i batteri spesso mostrano una gamma di densità di elettroni, rendendo la valutazione della vitalità difficile. Questo articolo descrive i protocolli per l&#39;uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all&#39;interno e associati alle cellule ospiti. Questi test sono stati sviluppati inizialmente per valutare la sopravvivenza di Neisseria gonorrhoeae in neutrofili umani primari, ma dovrebbe essere unApplicabile a qualsiasi interazione cellula batterio-ospite. Questi protocolli si combinano coloranti fluorescenti membrana permeabile (SYTO9 e 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), che macchia tutti i batteri, con coloranti membrana impermeabile fluorescente (propidio ioduro e Sytox verdi), che sono accessibili solo a batteri non vitali. Prima di permeabilizzazione cellula eucariotica, viene aggiunto un anticorpo o reagente fluorescente per identificare i batteri extracellulari. Così questi saggi discriminano la vitalità dei batteri aderente e all&#39;interno delle cellule eucariotiche. Un protocollo è prevista anche per utilizzare i coloranti redditività in combinazione con anticorpi fluorescenti a marcatori di cellule eucariotiche, al fine di determinare la localizzazione subcellulare di singoli batteri. I coloranti vitalità batterica discussi in questo articolo sono un complemento sensibili e / o alternative alle tecniche di microbiologia tradizionali per valutare la fattibilità dei singoli batteri e fornire informazioni riguardanti dove i batteri sopravvivono nella cellula ospites.

I protocolli descritti sono stati usati per esaminare la sopravvivenza di N. gonorrhoeae dopo l&#39;esposizione al primario dell&#39;uomo neutrofili 5,26. I neutrofili sono stati infettati con N. gonorrhoeae e trattati con protocollo 1, utilizzando la vitalità SYTO9 colorante verde fluorescente e lo ioduro di propidio-rosso fluorescente (Figura 4A). I coloranti sono stati aggiunti in presenza di saponina, che sequestra colesterolo per permeabilize preferenzialmente membrane...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l&#39;esposizione a cellule eucariotiche. Questo articolo descrive i protocolli per l&#39;uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all&#39;interno e associati alle cellule ospiti.

Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K Views.  University of Virginia Health Sciences Center.  Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti. 

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...