نشكر بنك آسيا سميرنوف ولورا Gonyar لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة وأيد منح R00 R01 TW008042 وAI097312 لAKCMBJ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة AI007046 T32.

1. تقييم البكتيرية الجدوى مع يوديد propidium وSYTO9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا من الفائدة. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بلطف خلايا مرة واحدة في 0.1 م 3 - (N-morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف)، ودرجة الحموضة 7.2، يحتوي على 1 ملم MgCl 2 (اجتماعات الأطراف / MgCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية. </li></ol> ملاحظة: يتحكم السلوك مع البكتيريا الحية والميتة، في غياب الخلايا المضيفة، لإظهار أن كتين أو الضد من مصلحة ملزم لجميع البكتيريا بغض النظر عن الجدوى (الشكل 1). <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرتين مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح مالقانونين من الخلايا وإضافة 0.5 مل لايف / الميت تلطيخ الحل. الحية / الميت تلطيخ الحل هو 5 ميكرومتر SYTO9، 30 ميكرومتر يوديد propidium، و 0.1٪ سابونين (تركيزات النهائي) في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips قلب وجهه لأسفل على الشرائح الزجاجية وختم بطلاء الأظافر واضحة. لا تستخدم وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور في غضون 30 دقيقة، وذلك باستخدام المجهر مضان مع مجموعات مرشح متوافق مع الأخضر والأحمر، والأحمر حتى الحصول على الصور. </li></ol> ملاحظة: كلا التقليدية المجهري مضان، ويمكن استخدامها متحد البؤر المسح المجهري بالليزر. بعد 30 دقيقة تبدأ الأصباغ الفلورية لتسرب من البكتيريا والتي لم تعد البيانات المكتسبة دقيقة. تم الحصول على الصور المبينة في هذه المادة على نيكون الكسوف E800 مضان المجهر تستقيم مع كاميرا رقمية هاماماتسو أوركا-ER باستخدام برنامج Openlab. تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وباطل اللون الأزرق. تم الكشف عن مضان من يوديد propidium باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 600-660 نانومتر. تم الكشف عن مضان من SYTO9 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية أزرق + أحمر، تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الداخلية الحمراء فقط، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر أزرق + أخضر، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر خضراء فقط. عد بالعين أعداد البكتيريا التي هي غير قابل للحياة الخارجية، الداخلية غير قابل للحياة، قابلة للحياة الخارجية، والداخلية قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب في المئة من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية بقسمة عدد من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية من العدد الكلي للبكتيريا الخارجية (قابلة للحياة بالإضافة إلى nonviقادرة). حساب في المئة من البكتيريا الداخلية قابلة للحياة بقسمة عدد من البكتيريا الداخلية قابلة للحياة من العدد الكلي للبكتيريا الداخلية (قابلة للحياة بالإضافة إلى غير قابل للحياة) (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هناك نوعان من الضوابط الأساسية لأداء مع هذا البروتوكول. أولا، تحقق من أن كل البكتيريا غير قابل للحياة هي propidium يوديد-الإيجابية وجميع البكتيريا الحية هي SYTO9 إيجابية. وينبغي أن يكون ثقافة منتصف لوغاريتمي من البكتيريا (في حالة عدم وجود أية خلايا المضيف)&gt; 95٪ SYTO9 إيجابية. هو مبين في الشكل 2 هي ثقافة منتصف لوغاريتمي من N. البنية (في 10 وحدة في مستعمرة 8 مل تشكيل) حضنت مع لايف / الميت تلطيخ الحل. الثانية، التحقق من أن كل من يوديد propidium وSYTO9 يمكن أن تدخل permeabilized، الخلايا المضيفة المصابة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد السكان من البكتيريا الميتة، وجمع 2 × 10 8 مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدة في 1.5 مل microfuge أنبوب، إضافة 70٪ الأيزوبروبانول والجلوس لمدة 10 دقيقة. بيليه البكتيريا في microfuge لالثانية يغسل البكتيريا مرتين في برنامج تلفزيوني لإزالة الأيزوبروبانول المتبقية. ثم اتبع الخطوات بروتوكول 1،5-1،7. إضافة 5 ميكرولتر من تعليق البكتيرية لشريحة زجاجية وتراكب مع ساترة. عينات الصورة كما في البروتوكول الخطوة 1.9. في ظل هذه الظروف، يجب أن يكون 100٪ من السكان يوديد propidium إيجابية (الشكل 2). في بعض الأنواع البكتيرية، يوديد propidium قد لا تطغى تماما SYTO9 تلطيخ، وغير قابل للحياة قد تظهر البكتيريا الأصفر أو البرتقالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلايا البلعمة مثل العدلات، تعرض الخلايا لقتل البكتيريا الأيزوبروبانول والتأكد من أن 100٪ من البكتيريا داخل الخلايا هي propidium يوديد إيجابية-(الشكل 3). لخلايا nonphagocytic التي قد لا تستوعب البكتيريا الميتة، قد تكون كافية لعلاج الخلايا المصابة مع أزيد الصوديوم أو غيرها من العوامل المضادة للجراثيم خلايا نفيذ قبل مضيفا ايف / الميت تلطيخ الحل. </li></ol></li></ol> 2. تقييم الجدوى البكتيرية مع SYTOX GREEن ودابي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البكتيريا التسمية في المصالح مع 10 ميكروغرام / مل دابي في مورس معرفة متوسطة 25 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا دابي المسمى. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف خلايا مرة واحدة مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية. انظر الملاحظة في البروتوكول الخطوة 1.3 لعناصر المقترحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح من الخلايا وإضافة 0.5 مل 0.4 ميكرومتر SYTOX الخضراء في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق. </li><li&gt; الحصول على صور في غضون 30 دقيقة مع المجهر مضان. انظر البروتوكول الخطوة 1.9 لوصف المجهر، والكاميرا الرقمية، والبرمجيات الاستحواذ. </li></ol> ملاحظة: تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وغير صحيح اللون الأحمر. تم الكشف عن مضان من SYTOX الأخضر باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر. تم الكشف عن مضان من دابي باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 355-375 نانومتر ومرشح حاجز 400 نانومتر. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية الحمراء + الخضراء والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر أخضر + أزرق، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر أحمر + أزرق، والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الزرقاء فقط (الشكل 4). قياس المئة من البكتيريا الخارجية والداخلية كما هو موضح في البروتوكول الظريفص 1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتحدد الضوابط المبينة في البروتوكول خطوة 1.12 ينبغي أن يقوم مع دابي / SYTOX الأخضر صبغ مزيج (الشكلين 2 و 3). </li></ol> 3. تقييم الجدوى البكتيرية إلى جانب توطين التحت خلوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البكتيريا التسمية في المصالح مع 10 ميكروغرام / مل دابي في متوسطة مورس محدد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب الخلايا التي هي ملتصقة إلى 12 مم coverslips الزجاج الدائرية في 24 لوحات جيدة مع البكتيريا دابي المسمى. لا تصلح الخلايا مع الألدهيدات أو المذيبات العضوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف خلايا مرة واحدة مع اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-647 أو كتين التي تربط إلى الأنواع البكتيرية من الفائدة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2، للكشف عن البكتيريا الخارجية. انظر الملاحظة في البروتوكول الخطوة 1.3 لعناصر المقترحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح من الخلايا وشطف خليتين منظمة الشفافية الدوليةMES في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع اليكسا فلور الأضداد مقرونة-555 ضد علامة التحت خلوية من الفائدة لمدة 20 دقيقة، في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 تحتوي على 0.2٪ سابونين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح من الخلايا وإضافة 0.4 ميكرومتر SYTOX الخضراء في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرتين في اجتماعات الأطراف / MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة في اجتماعات الأطراف / MgCl 2 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور من الشرائح في غضون 30 دقيقة على المجهر مضان. انظر البروتوكول الخطوة 1.9 لوصف المجهر، والكاميرا الرقمية، والبرمجيات الاستحواذ. </li></ol> ملاحظة: تم الكشف عن مضان من اليكسا فلور 647 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 590-650 نانومتر وتصفية الانبعاثات من 663-735 نانومتر، وباطل اللون الأرجواني. مضان وتم الكشف مدمج اليكسا فلور 555 باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 600-660 نانومتر. تم الكشف عن مضان من SYTOX الأخضر باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 465-495 نانومتر وعامل تصفية الانبعاثات من 515-555 نانومتر. تم الكشف عن مضان من دابي باستخدام فلتر مع الإثارة الطول الموجي من 355-375 نانومتر ومرشح حاجز 400 نانومتر. <ol start="14" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف يؤدي هذا البروتوكول في صور حيث تظهر البكتيريا غير قابل للحياة الخارجية الأرجواني + الخضراء والبكتيريا غير قابل للحياة الداخلية تظهر أخضر + أزرق، والبكتيريا قادرة على البقاء الخارجية تظهر الأرجواني الأزرق + والبكتيريا الداخلية قابلة للحياة تظهر الأزرق فقط، ويظهر بروتين التحت خلوية الحمراء (الشكل 4). قياس perecent من البكتيريا قادرة على البقاء الخارجية والداخلية كما هو موضح في البروتوكول الخطوات 1.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتحدد الضوابط المبينة في البروتوكول خطوة 1.12 ينبغي أن يقوم مع دابي / SYTOX الأخضر صبغ مزيج (الشكلين 2 و 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيبالإضافة إلى عد البكتيريا قادرة على البقاء وغير قابل للحياة، وتصنيف كل البكتيريا إما إيجابية أو سلبية على colocalization مع علامة التحت خلوية من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب في المئة من البكتيريا قادرة على البقاء colocalized مع علامة التحت خلوية بقسمة عدد من البكتيريا قادرة على البقاء colocalized من العدد الكلي للبكتيريا قابلة للحياة. حساب في المئة من البكتيريا غير قابل للحياة colocalized مع علامة التحت خلوية بقسمة عدد من البكتيريا colocalized غير قابل للحياة من العدد الكلي للبكتيريا غير قابل للحياة. </li></ol>

<ol>
	<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77 (2011).</li><li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes.">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li><li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay.">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li><li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes.">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).</li><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions.">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+absolute,+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer.">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li><li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization.">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128,+a+fresh-produce+washing+aid,+in+chlorinated+wash+solutions.">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li><li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry:+a+comparison+to+culture-based+techniques.">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).</li><li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils.">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells:+clinical+and+pathogenetic+implications.">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li><li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps.">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li><li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection.">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53 (2006).</li><li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination:+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages.">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro.">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li><li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells.">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li><li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR.">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li><li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells.">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li><li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages.">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li><li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate,+Tetrahymena+sp.">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li><li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae:+the+requirement+for+hypoxanthine.">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li><li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils.">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li><li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain.">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

المقدمة هنا نوعان من البروتوكولات التي تستخدم الحمض النووي ملزمة والأصباغ جدوى بالتزامن مع كتين الفلورسنت لتحديد البكتيريا الحية والميتة وتعلق داخل الخلايا البشرية. لأن كلا من بروتوكولات تميز بفعالية الحية من البكتيريا الميتة، واختيار أي بروتوكول لاستخدام يعتمد ?...

هناك ديناميكية التفاعل والتطور المشترك بين البكتيريا والمضيفين التي يقيمون فيها. وقد تطورت البكتيريا العضيات الالتزام، ونظم إفراز و / أو القدرة على إنتاج السموم التي تمكن العدوى الإنتاجية الخاصة بهم من أكلة المضيف والخلايا غير البلعمية. يجب على البكتيريا أيضا يتعامل مع الاعتراف والأنشطة المضادة للميكروبات الجهاز المناعي المضيف. ويتألف الجهاز المناعي مجموعة من المكونات الفطرية والتكيفية بما في ذلك الحواجز الفيزيائية والكيميائية، الخلايا المناعية، ونظام مكمل، وغيرها من عناصر الحصانة الخلطية. بينما العديد من أنواع البكتيريا هي عرضة للقتل والتطهير من قبل المضيف المناعي استجابة متعددة الطبقات، تطورت بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض الانتهازية وآليات لتصيب مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة وتخريب التخليص من قبل المضيف المناعي استجابة 1. النيسرية البنية هو مثال واحد من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية التي يتم تكييفها للغاية أن تستمر في المضيف الإنسان. N. البنية يستعمر بسهولة السطوح اللمعية من الخلايا الظهارية المخاطية من الجهاز البولي التناسلي والبلعوم والملتحمة، والمستقيم. الاستعمار يتسبب في التوظيف وفيرة من العدلات في مواقع المخاطية. العدلات هي البالعات المهنية التي تمتلك مجموعة متنوعة من العمليات المضادة للجراثيم لقتل الكائنات الحية الدقيقة، ومع ذلك، N. البنية غير قادرة على البقاء في وجود العدلات 2-5. فهم كيفية مسببات الأمراض البكتيرية مثل N. البنية تخريب، وقمع، وخطف الاستجابة المناعية البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف في بيئات معادية المضيف عادة هو أمر حاسم في تطوير علاجات جديدة لمكافحة الأمراض المعدية. البروتوكولات التجريبية غالبا ما تستخدم للتحقيق بقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة تشمل فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. في فحوصات العد مستعمرة، ويبلغ عدد سكانها هي lysed الخلايا المصابة (على سبيل المثال، مع المنظفات لذوي الخوذات البيضاءمعنوى البكتيريا مقاومة) لتحرير البكتيريا. وتضعف لست] ومطلي على وسائل الاعلام القائمة على أجار، ويتم تعداد الوحدات المكونة للمستعمرة في لست] لكل نقطة زمنية و / أو حالة تجريبية. هذا النهج تقارير الجدوى من السكان البكتيرية بأكمله ولكن غير قادر على التفريق بين الخلايا والبقاء على قيد الحياة خارج الخلية. وهناك تباين في مقايسة العد مستعمرة، مقايسة حماية الجنتاميسين، يقيس على وجه التحديد بقاء البكتيريا داخل الخلايا، استنادا إلى عدم قدرة جنتاميسين مضاد حيوي لعبور حقيقية النواة غشاء البلازما 6. ومع ذلك، هذا الاختبار يعتمد على البكتيريا كونها عرضة للقتل من قبل جنتاميسين (أو مضاد حيوي آخر هو بالمثل حقيقية النواة غشاء impermeant) وعدم قدرة المضاد الحيوي على الوصول إلى البكتيريا الداخلية. وبالتالي، مقايسة حماية الجنتاميسين قد لا تكون فعالة لفحص كل أنواع البكتيريا أو عند النظر في البقاء على قيد الحياة البكتيرية للغايةخلايا pinocytic مثل العدلات. لم يكن أي من هذه الطرق يكشف توطين التحت خلوية أو أي سلوك آخر من البكتيريا الفردية (على سبيل المثال إذا كانت البكتيريا تشكيل المجاميع أو microcolonies أن تتصرف بشكل مختلف من الخلايا البكتيرية الفردية). آخر النهج كثيرا ما تستخدم لدراسة الجدوى من البكتيريا الخارجية والداخلية الفردية رقيقة المقطع انتقال الإلكترون المجهري (TEM). هذا النهج هو مفيد من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات بشأن مكان وجود البكتيريا في الخلايا المضيفة (مثل يبلوع، السيتوبلازم، جسيم بلعمي ذاتي)، والتي يمكن أن تحقق مزيدا من immunoelectron المجهري مع الأجسام المضادة إلى جانب الذهب ضد علامات التحت خلوية. ومع ذلك، المجهر الإلكتروني ليست حساسة ولا سيما في تقييم الجدوى البكتيرية. عندما يتم ملطخة أقسام جزءا لا يتجزأ مع خلات اليورانيل، سترات الرصاص، أو غيرها من الكواشف الإلكترون الكثيفة والتقط بواسطة المجهر الإلكتروني، وتعتبر البكتيريا الإلكترون كثيفة قابلة للحياة وكهربائيTRON-وسنت غير قابل للحياة 7،8. ولكن هذا الافتراض يغالي بقاء البكتيرية، ومنذ تلك البكتيريا الميتة فقط مع الأغشية تعطلت بشدة وتخلو من السيتوبلازم تظهر الإلكترون لوسنت. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض الأنواع البكتيرية عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات اعتمادا على مرحلة نموها، مما يجعل من الصعب تحديد الجدوى. كبديل أو بالإضافة إلى هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع، وهنا نقدم بروتوكولات والأساس المنطقي لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تشير إلى بقاء البكتيرية لتقييم بقاء البكتيريا التي تعلق على والمنضوية بواسطة الخلايا المضيفة. لتحديد البكتيريا خارج الخلية يتم، أولا، تتعرض الخلايا المصابة إلى كاشف الفلورسنت، مثل كتين أو الأجسام المضادة البكتيريا محددة. ثم يتم permeabilized الخلايا المصابة والمعرضة للالأصباغ الحمض النووي المحددة التي يمكن الوصول إليها بشكل مختلف للبكتيريا مع الأغشية سليمة مقابل المتدهورة، كبديل للبقاء البكتيرية. في ع الأولrotocol، يحدد غشاء منفذ صبغ SYTO9 مجموع السكان البكتيرية، في حين يوديد propidium هو فقط للوصول الى تلك البكتيريا التي أثرت سلبا الأغشية، وبالتالي فهي تعتبر غير قابل للحياة. وقد استخدمت يوديد propidium وSYTO9 لتقييم الجدوى البكتيرية في الأغشية الحيوية، تميز الممرضة من بكتيريا غير إمراضية، وتعداد البكتيريا التي تنتقل عن طريق المياه قابلة للحياة 9-12. في البروتوكول الثاني، 4 &#39;، 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (دابي) يحدد مجموع البكتيريا، في حين SYTOX الأخضر هو فقط للوصول الى السكان غير قابل للحياة. هذه الأزواج بقاء الصبغة يمكن الجمع بين المناعي لتحديد موقع كل البكتيريا في ما يتعلق بروتين من الفائدة، على سبيل المثال لتعريف توطين التحت خلوية البكتيرية. استخدام هذه المقايسات يقدم رؤية المفتاح في التفاعلات التي تؤدي إلى قتل البكتيريا أو البقاء على قيد الحياة خلال العدوى من الخلايا المضيفة. تم استخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لتقييم جدوىN. البنية التي يتم تركيبها داخل والعدلات الإنسان الأساسية، بما في ذلك مجموعات مختلفة من phagosomes العدلة 5،13،14. ومع ذلك، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها لتقييم الجدوى من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام في البالعات المهنية، البالعات غير المهنية، والبروتوزوا 15-24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. وتشمل البروتوكولات الحالية لمعالجة هذه الأسئلة فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. العد مستعمرة وحماية الجنتاميسين فحوصات تقييم الجدوى فقط من السكان البكتيرية كامل وغير قادر على تحديد الجدوى البكتيرية الفردية. ويمكن استخدام المجهر الإلكتروني لتحديد الجدوى من البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن التوطين في الخلايا المضيفة. ومع ذلك، في كثير من الأحيان بكتيريا عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات، مما يجعل من الصعب تقييم الجدوى. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة. وقد وضعت هذه المقايسات أصلا لتقييم بقاء النيسرية البنية في العدلات الإنسان الأساسية، ولكن ينبغي أن يكونpplicable إلى أي تفاعل الخلية البكتيريا في استضافة. الجمع بين هذه البروتوكولات الأصباغ الفلورية غشاء نفاذية (SYTO9 و4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole [دابي])، والتي وصمة عار جميع البكتيريا، مع الأصباغ غشاء كتيمة الفلورسنت (يوديد propidium وSYTOX الأخضر)، والتي يمكن الوصول إليها فقط ل البكتيريا غير قابل للحياة. قبل permeabilization الخلية حقيقية النواة، يتم إضافة الجسم المضاد أو كاشف الفلورسنت لتحديد البكتيريا خارج الخلية. وبالتالي هذه المقايسات تميز جدوى من البكتيريا تمسكا وداخل الخلايا حقيقية النواة. ويرد البروتوكول أيضا لاستخدام الأصباغ جدوى في تركيبة مع الأجسام المضادة لعلامات الفلورسنت خلية حقيقية النواة، من أجل تحديد توطين التحت خلوية من البكتيريا الفردية. الأصباغ البكتيرية الجدوى مناقشتها في هذه المقالة هي تكملة الحساسة و / أو بديل لتقنيات علم الأحياء المجهرية التقليدية لتقييم جدوى البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن مكان البقاء على قيد الحياة البكتيريا في الخلية المضيفةق.

تم استخدام البروتوكولات المحددة لدراسة بقاء N. البنية بعد التعرض لالإنسان الأساسية العدلات 5،26. أصيب العدلات مع N. البنية ومعالجتها مع بروتوكول 1، وذلك باستخدام الخضراء الفلورسنت SYTO9 الجدوى صبغ والحمراء الفلورسنت يوديد propidium (الشكل 4A). أضيفت ال...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells at JoVE.com

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة.

مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K Views.  University of Virginia Health Sciences Center.  المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترا?...

Video: Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

استخدام الخلوي على الصورة لعرض الكمي من الفطريات الممرضة في جمعية مع الخلايا المضيفة

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

مضان<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتوطين الفيروسات والبكتيريا Endosymbiotic في النبات والحشرات مناديل

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

اللثوية Porphyromonas كما كائن نموذج لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع خلايا المضيف

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...