Agradecemos Asya Smirnov e Laura Gonyar para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R00 e R01 TW008042 AI097312 para AKCMBJ foi apoiado em parte pelo NIH T32 AI007046.

1. Avaliando bacteriana Viabilidade com iodeto de propídio e SYTO9 <ol><li> Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com as bactérias de interesse. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos. </li><li> Lave as células uma vez gentilmente em 0,1 M de 3 - (N-morfolino) propanossulfónico (MOPS), pH 7,2, contendo MgCl2 1 mM (MOPS / MgCl 2). </li><li> Incubar as células durante 10 min no escuro à temperatura ambiente com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl 2, para detectar bactérias externas. </li></ol> NOTA: Conduta controla com bactérias vivas e mortas, na ausência de células hospedeiras, para mostrar que a lectina ou um anticorpo de interesse liga-se todas as bactérias, independentemente da viabilidade (Figura 1). <ol start="4"><li> Lave as células duas vezes com MOPS / MgCl 2. </li><li> Aspirar mEDIA a partir de células e adicionar 0,5 ml Live / solução de coloração Morto. Solução de coloração vivo / morto é SYTO9 5 uM, 30 uM de iodeto de propídio, e 0,1% de saponina (concentrações finais) em MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubar as células durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2. </li><li> Lamelas Inverter face para baixo em lâminas de vidro e selar com clara unha polonês. Não use mídia de montagem. </li><li> Adquirir imagens dentro de 30 minutos, utilizando um microscópio de fluorescência com conjuntos de filtros compatíveis com a aquisição de imagem verde, vermelho e vermelho-extremo. </li></ol> NOTA: Ambos microscopia de fluorescência convencional e a microscopia confocal a laser pode ser utilizado. Após 30 min os corantes fluorescentes começam a vazar as bactérias e os dados adquiridos não são precisos. As imagens mostradas neste artigo foram adquiridos em uma Nikon Eclipse E800 microscópio de fluorescência na posição vertical com Hamamatsu Orca-ER câmera digital usando o software Openlab. Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e um filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa de cor azul. A fluorescência a partir de iodeto de propídio foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um filtro de emissão de 600-660 nm. A fluorescência a partir de SYTO9 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm. <ol start="10"><li> Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis ​​externas aparecem azul + vermelho, as bactérias não viáveis ​​internos aparecem vermelhos só, bactérias viáveis ​​externas aparecem em azul + verde e bactérias viáveis ​​internos aparecem apenas verde. Contagem por olho o número de bactérias que são externos inviável, inviável interna, externa viável, e interna viável. </li><li> Calcular a percentagem de bactérias viáveis ​​externo, dividindo o número de bactérias viáveis ​​externos ao número total de bactérias externas (mais viável nonvicapaz). Calcular a percentagem de bactérias viáveis ​​internos através da divisão do número de bactérias viáveis ​​internos pelo número total de bactérias internas (mais viável não viável) (Figura 4). </li><li> Há dois controles essenciais para realizar com este protocolo. Primeiro, validar que todas as bactérias não viáveis ​​são iodeto de propídio-positivas e todas as bactérias vivas são SYTO9 positivo. Uma cultura semi-logarítmico de bactérias (na ausência de quaisquer células hospedeiras) deve ser&gt; 95% SYTO9-positivo. Mostrado na Figura 2 é uma cultura semi-logarítmico de N. gonorrhoeae (a 10 8 colônia unidades por ml formando) incubadas com Live / solução de coloração Morto. Em segundo lugar, validar que tanto o iodeto de propídio e SYTO9 pode entrar permeabilizadas, as células hospedeiras infectadas. <ol><li> Para gerar uma população de bactérias mortas, recolher 2 x 10 8 unidades formadoras de colónias de bactérias em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 70% de isopropanol e sentar-se durante 10 min. Agregar as bactérias em uma microcentrífuga and lavar as bactérias duas vezes com PBS para remover o isopropanol residual. Em seguida, siga os passos do protocolo 1,5-1,7. Adicionar 5 mL de suspensão bacteriana para uma lâmina de vidro e sobreposição com uma lamela. Amostras de imagem como na protocolo passo 1.9. Sob estas condições, 100% da população deveria ser de iodeto de propídio-positivo (Figura 2). Em algumas espécies bacterianas, iodeto de propídio não pode sobrecarregar completamente coloração SYTO9, e as bactérias não viáveis ​​podem aparecer amarelo ou laranja. </li><li> No caso de células fagocíticas como os neutrófilos, expor as células de bactérias mortas por isopropanol e garantir que 100% das bactérias intracelulares são iodeto de propídio-positivo (Figura 3). Para as células que não podem nonphagocytic internalizar as bactérias mortas, pode ser suficiente para o tratamento de células infectadas com azida de sódio ou outras células de permeante agentes antimicrobianos antes da adição da solução de coloração vivo / morto. </li></ol></li></ol> 2. Avaliando bacteriana Viabilidade com SYTOX Green e DAPI <ol><li> Etiqueta de bactérias de interesse com 10 ug / ml de DAPI, em meio definido de Morse de 25, durante 20 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com bactérias marcadas com DAPI. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos. </li><li> Lave as células uma vez com MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubar as células durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl 2, para detectar bactérias externas. Veja a nota na protocolo passo 1.3 para controles sugeridas. </li><li> Aspirar a mídia a partir de células e adicionar 0,5 ml de 0,4 mM SYTOX Verde em MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubar as células durante 5 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2. </li><li> Lave as células uma vez em MOPS / MgCl 2 durante 5 min. </li><li&gt; Adquirir imagens dentro de 30 min com um microscópio de fluorescência. Veja protocolo passo 1.9 para descrição do microscópio, câmera digital e software de aquisição. </li></ol> NOTA: Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e um filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa cor vermelha. A fluorescência a partir de SYTOX Green foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm. A fluorescência a partir de DAPI foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 355-375 nm e um filtro barreira de 400 nm. <ol start="10"><li> Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis ​​externas aparecem vermelho + verde, as bactérias não viáveis ​​internos aparecem em verde + azul, bactérias viáveis ​​externas aparecem em vermelho + azul, e bactérias viáveis ​​internos aparecem em azul apenas (Figura 4). Quantificar o percentual de bactérias externas e internas, conforme descrito no protocolo step 1,11. </li><li> Os controlos descritos no protocolo de passo 1,12 deve ser realizada com a combinação de corante de DAPI / SYTOX verde (Figuras 2 e 3). </li></ol> 3. Avaliando bacteriana Viabilidade Junto localização subcelular <ol><li> Etiqueta de bactérias de interesse com 10 ug / ml de DAPI, em meio definido de Morse de 20 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Infectar as células que estão aderentes a 12 mm de diâmetro lamelas de vidro circulares em placas de 24 poços com bactérias marcadas com DAPI. Não corrigir as células com aldeídos ou solventes orgânicos. </li><li> Lave as células uma vez com MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubar 10 minutos à temperatura ambiente no escuro com Alexa Fluor 647 anticorpo ou lectina-acoplado que se liga às espécies bacterianas de interesse, em MOPS / MgCl 2, para detectar bactérias externas. Veja a nota na protocolo passo 1.3 para controles sugeridas. </li><li> Aspirar a mídia a partir de células e lave as células duas times em MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubar as células com Alexa Fluor 555 anticorpo acoplado contra o marcador subcelular de interesse, durante 20 min, em MOPS / MgCl2 contendo 0,2% de saponina. </li><li> Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2. </li><li> Lave as células uma vez em MOPS / MgCl 2 durante 5 min. </li><li> Aspirar a mídia a partir de células e adicionar 0,4 mM SYTOX Verde em MOPS / MgCl 2. </li><li> Incubar as células 5 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lave as células duas vezes em MOPS / MgCl 2. </li><li> Lave as células uma vez em MOPS / MgCl 2 durante 5 min. </li><li> Adquirir imagens de lâminas dentro de 30 min em microscópio de fluorescência. Veja protocolo passo 1.9 para descrição do microscópio, câmera digital e software de aquisição. </li></ol> NOTA: Fluorescência de Alexa Fluor 647 foi detectado por um filtro com comprimento de onda de excitação de 590-650 nm e filtro de emissão de 663-735 nm, e é falsa cor roxa. Fluorescência from Alexa Fluor 555 foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 540-580 nm e um filtro de emissão de 600-660 nm. A fluorescência a partir de SYTOX Green foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um filtro de emissão de 515-555 nm. A fluorescência a partir de DAPI foi detectada utilizando um filtro com o comprimento de onda de excitação de 355-375 nm e um filtro barreira de 400 nm. <ol start="14"><li> Este protocolo irá resultar em imagens onde as bactérias não viáveis ​​externas aparecem roxo + verde, as bactérias não viáveis ​​internos aparecem em verde + azul, bactérias viáveis ​​externas aparecem roxo + azul, bactérias viáveis ​​internos aparecem em azul só, e proteína subcelular aparece em vermelho (Figura 4). Quantificar a perecent de bactérias viáveis ​​externos e internos como descrito no protocolo de passos de 1,11. </li><li> Os controlos descritos no protocolo de passo 1,12 deve ser realizada com a combinação de corante de DAPI / SYTOX verde (Figuras 2 e 3). </li><li> EmAlém de contagem de bactérias viáveis ​​e não viáveis, classificar cada bactéria como positivo ou negativo para a co-localização com o marcador subcelular de interesse. </li><li> Calcular a percentagem de bactérias viáveis ​​com o marcador colocalized subcelular, dividindo o número de bactérias viáveis ​​colocalized pelo número total de bactérias viáveis. Calcular a percentagem de bactérias não viáveis ​​colocalized com o marcador subcelular pela divisão do número de bactérias colocalized não viáveis ​​por o número total de bactérias não viáveis. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Apresentamos aqui dois protocolos que usam ligação ao DNA e corantes de viabilidade em conjunto com uma lectina fluorescente para identificar bactérias vivas e mortas anexados a e no interior das células humanas. Como ambos os protocolos efetivamente discriminar ao vivo a partir de bactérias mortas, a escolha de qual protocolo usar depende do objetivo do experimento. O primeiro protocolo utiliza iodeto de propídio para detectar bactérias não viáveis ​​e SYTO9 para detectar bactérias intactas. Mostrado na <...

Há uma interação dinâmica e co-evolução entre as bactérias e os anfitriões em que residem. As bactérias têm evoluído organelos aderência, sistemas de secreção, e / ou a capacidade de produzir toxinas que permitem a infecção produtiva de fagocítica hospedeiro e as células não fagocíticas. As bactérias também devem lidar com o reconhecimento e actividade antimicrobiana do sistema imune do hospedeiro. O sistema imune do hospedeiro é constituído por componentes inatos e adaptativos incluindo barreiras físicas e químicas, as células do sistema imunológico, o sistema do complemento, e outros componentes da imunidade humoral. Enquanto muitas bactérias são suscetíveis a morte eo afastamento por parte do anfitrião resposta imune de várias camadas, algumas bactérias patogênicas e oportunistas desenvolveram mecanismos para infectar uma variedade de células hospedeiras e subvertem alívio da resposta imune hospedeiro 1. Neisseria gonorrhoeae é um exemplo de um patógeno bacteriano que está altamente adaptada para persistir no hospedeiro humano. N. gonorrhoeae prontamente coloniza as superfícies luminais de células epiteliais da mucosa do tracto urogenital, da faringe, da conjuntiva, e recto. Colonização desencadeia o recrutamento abundante de neutrófilos nos locais de mucosas. Os neutrófilos são fagócitos profissionais que possuem uma variedade de processos antimicrobianos para matar microrganismos, no entanto, N. gonorrhoeae é capaz de sobreviver na presença de neutrófilos 2-5. Compreender como bactérias patogênicas, como N. gonorrhoeae subverter, suprimir, e sequestrar a resposta imune para sobreviver em última análise, em ambientes de host normalmente hostis é crucial para o desenvolvimento de novas terapias para o combate a doenças infecciosas. Protocolos experimentais muitas vezes utilizados para investigar a sobrevivência bacteriana em células hospedeiras incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Em ensaios de contagem de colónia, uma população de células infectadas é lisadas (por exemplo, com um detergente para which as bactérias são resistentes) para libertar as bactérias. Os lisados ​​são diluídas e plaqueadas em meio à base de agar, e as unidades formadoras de colónias nos lisados ​​são enumerados para cada ponto de tempo e / ou condição experimental. Esta abordagem relata a viabilidade de toda a população de bactérias, mas não é capaz de diferenciar entre a sobrevivência intracelular e extracelular. Uma variação no ensaio de contagem de colónia, o ensaio de protecção de gentamicina, mede especificamente a sobrevivência bacteriana intracelular, com base na incapacidade do antibiótico gentamicina para atravessar a membrana plasmática eucariótica 6. No entanto, este ensaio é dependente das bactérias que são susceptíveis à morte por gentamicina (ou outro antibiótico que é semelhante eucariótica membrana impermeabilizante) e a incapacidade de o antibiótico para ter acesso às bactérias internos. Portanto, um ensaio de proteção gentamicina pode não ser eficaz para o exame de todas as espécies bacterianas ou ao examinar a sobrevivência bacteriana em altacélulas pinocytic tais como neutrófilos. Nenhuma destas abordagens revela a localização subcelular ou outro comportamento de bactérias individuais (por exemplo, se as bactérias formam agregados ou microcolônias que se comportam de forma diferente a partir de células bacterianas individuais). Outra abordagem frequentemente usado para examinar a viabilidade das bactérias externas e internas individuais é de secção fina de microscopia electrónica de transmissão (TEM). Esta abordagem é vantajosa na medida em que pode fornecer informação sobre a localização das bactérias nas células do hospedeiro (por exemplo, fagossoma, citoplasma, autophagosome), que pode continuar a ser investigada por microscopia imunoelectrónica com anticorpos acoplados a ouro contra marcadores subcelulares. No entanto, a microscopia eletrônica não é especialmente sensível a avaliação da viabilidade bacteriana. Quando seções embutidos são corados com acetato de uranila, citrato de chumbo, ou outros reagentes de elétron-densas e fotografada por microscopia eletrônica, as bactérias elétron-densas são considerados viáveis ​​e electron-Lucent inviável 7,8. No entanto, esta hipótese superestima viabilidade bacteriana, uma vez que apenas as bactérias mortas com membranas severamente interrompidas e desprovido de citoplasma aparecem elétron-Lucent. Além disso, algumas espécies bacterianas podem exibir uma gama de densidades de electrões de acordo com a sua fase de crescimento, o que torna difícil determinar a viabilidade. Como uma alternativa ou em adição a estes métodos amplamente utilizados, aqui podemos fornecer protocolos e racional para a utilização de corantes fluorescentes que indicam a viabilidade bacteriana para avaliar a sobrevivência de bactérias aderidas para e internalizados pelas células hospedeiras. Para identificar as bactérias extracelulares, as células infectadas são primeiro expostas a um reagente fluorescente, tal como uma lectina ou anticorpo de bactérias específicas. As células infectadas são então permeabilizadas e expostos a corantes específicos de DNA que são diferencialmente acessíveis às bactérias com membranas intactas versus degradados, como um substituto para a viabilidade bacteriana. No primeiro protocolo, a membrana permeável SYTO9 corante identifica a população bacteriana total, enquanto iodeto de propídio é acessível apenas para as bactérias que comprometeram membranas e são, portanto, consideradas inviáveis. Iodeto de propídio e SYTO9 têm sido utilizados para avaliar a viabilidade de bactérias em biofilmes, discriminar patogênica de bactérias não patogênicas, e enumerar bactérias viáveis ​​transmitidas pela água 9-12. No segundo protocolo, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) identifica bactérias totais, enquanto SYTOX Verde só é acessível à população inviável. Estes pares de corantes de viabilidade pode ser combinada com a imunofluorescência para determinar a localização de cada bactéria em relação a uma proteína de interesse, por exemplo, para definir a localização subcelular bacteriana. A utilização destes testes proporciona uma visão chave nas interacções que resultam em sobrevivência ou morte bacteriana durante a infecção das células hospedeiras. Os protocolos descritos neste artigo foi utilizado para avaliar a viabilidade deN. gonorrhoeae que é anexado ao e dentro de neutrófilos humanos primários, incluindo em diferentes populações de neutrófilos phagosomes 5,13,14. No entanto, estes protocolos podem ser aplicados para avaliar a viabilidade das bactérias gram-positivas e gram-negativas em fagócitos profissionais, os fagócitos não profissionais, e protozoários 15-24.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Os protocolos atuais para lidar com essas questões incluem ensaios de contagem de colônia, ensaios de proteção gentamicina, e microscopia eletrônica. Contagem de colônias e de proteção gentamicina ensaios apenas avaliar a viabilidade de toda a população bacteriana e são incapazes de determinar a viabilidade bacteriana individual. A microscopia electrónica pode ser usado para determinar a viabilidade das bactérias individuais e fornecer informações sobre a sua localização em células hospedeiras. No entanto, as bactérias freqüentemente exibem uma gama de densidades de elétrons, fazendo com que a avaliação de viabilidade difícil. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras. Estes ensaios foram desenvolvidos originalmente para avaliar a sobrevivência de Neisseria gonorrhoeae em neutrófilos humanos primários, mas deve ser umAPLICÁVEL a qualquer interação célula bactéria-hospedeiro. Estes protocolos combinar corantes fluorescentes à membrana permeável (SYTO9 e 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindole [DAPI]), o qual mancha todas as bactérias, com corantes fluorescentes de membrana impermeável (iodeto de propídio e SYTOX verde), que só são acessíveis a bactérias não viáveis. Antes de permeabilização de células eucarióticas, de um anticorpo ou reagente fluorescente é adicionada para identificar bactérias extracelulares. Assim, estes ensaios de discriminar a viabilidade das bactérias aderentes e para dentro de células eucarióticas. Um protocolo é também fornecida para a utilização de corantes de viabilidade, em combinação com anticorpos fluorescentes para os marcadores de células eucarióticas, de forma a determinar a localização subcelular de bactérias individuais. Os corantes bacterianas viabilidade mencionados neste artigo são um complemento e / ou alternativa sensível às técnicas tradicionais de microbiologia para avaliar a viabilidade de bactérias individuais e fornecer informações sobre onde as bactérias sobrevivem em célula hospedeiras.

Os protocolos descritos foram usados ​​para examinar a sobrevivência de N. gonorrhoeae após a exposição ao humano primário neutrófilos 5,26. Os neutrófilos foram infectados com N. gonorrhoeae e processados ​​com o protocolo 1, utilizando o corante de viabilidade SYTO9 verde-fluorescente e o iodeto de propídio vermelho fluorescente (Figura 4A). Os corantes foram adicionados, na presença de saponina, que sequestra o colesterol para permeabilizar preferencialme...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras.

Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K visualizações.  University of Virginia Health Sciences Center.  Central ao campo da patogénese bacteriana é a capacidade de definir se e como os micróbios sobrevivem após exposição a células eucarióticas. Este artigo descreve protocolos para a utilização de corantes fluorescentes que revelam a viabilidade das bactérias individuais dentro e associados com as células hospedeiras. 

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Imunologia e Infecção

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...