私たちは、原稿の重要な読書のためにアシャスミルノフとローラGonyarに感謝します。この作品は、NIH T32 AI007046によって部分的にサポートされていましたAKCMBJへの助成金NIHのR00 TW008042とR01 AI097312によってサポートされていました。

1。ヨウ化プロピジウムとSYTO9と細菌の生存率を評価する<ol><li>目的の細菌で24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。 </li><li>一旦穏やかで細胞をすすぎ、0.1M 3 - （N-モルホリノ）、1mMのMgCl 2（MOPS /のMgCl 2）を含有するプロパンスルホン酸（MOPS）、pH7.2で、。 </li><li>外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl 2に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンを用いて室温で暗所で10分間、細胞をインキュベートする。 </li></ol> NOTE：行動、関心のあるレクチンまたは抗体に関係なく生存率（ 図1）の全ての細菌に特異的に結合することを示すために、宿主細胞の非存在下で、生および死細菌を制御する。 <ol start="4"><li> MOPS / MgCl 2を用いて細胞を2回すすいでください。 </li><li>吸引物M細胞からEDIAと0.5ミリリットル生/死染色溶液を加える。生/死染色溶液は、MOPS / 塩化マグネシウムが5μmのSYTO9、30μMのヨウ化プロピジウム、0.1％サポニン（最終濃度）である。 </li><li>暗所で室温で15分間、細胞をインキュベートする。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li>反転したカバーは、スライドガラス上に裏向きと明確なマニキュアで密封する。封入剤は使用しないでください。 </li><li>緑、赤、遠赤の画像取得と互換性のフィルターセットで蛍光顕微鏡を用いて、30分以内に画像を取得する。 </li></ol>注：従来の蛍光顕微鏡法および共焦点レーザー走査顕微鏡法の両方を使用することができる。 30分後、蛍光色素は、細菌から漏れ始めておらず、取得したデータはもはや正確である。この記事に示されている画像は、のOpenLABソフトウェアを使用して、浜松オルカ-ERデジタルカメラニコンエクリプスE800直立蛍光顕微鏡で得た。 650 nmおよび663の発光フィルター - - アレクサフルーア647の蛍光は、590の励起波長を有するフィルターを用いて検出した735 nmであり、偽色の青である。 580と600nmの発光フィルター - - 660 nmのヨウ化プロピジウムの蛍光を、540の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555 nmのSYTO9からの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 <ol start="10"><li>このプロトコルは、外部生育不能細菌が赤+青表示され、内部の生育不能細菌は、外部生菌が緑+青表示され、内部の生菌のみを緑色にのみ赤く表示された画像になります。目で、外部の生育不能生育不能内部、実行可能な外部、および内部生存している細菌の数を数える。 </li><li>外部の細菌の総数（外部によって生菌数で割ることによって、外部生菌の割合を計算する実行可能なプラスnonviでき）。内部の細菌の総数（実行可能なプラス生育不能）（ 図4）により、内部生菌数を割ることによって、内部生菌の割合を計算します。 </li><li>このプロトコルで実行するには、2つの本質的なコントロールがあります。まず、すべての生育不能細菌はヨウ化陽性であり、すべての生菌がSYTO9陽性であることを検証します。 （任意の宿主細胞の非存在下）の細菌の中間対数文化が&gt; 95％のSYTO9陽性である必要があります。 N.の中間対数培養物は、 図2にも示されている淋菌 （ミリリットル当たりの単位を形成する10 8コロニーでの）生/死染色溶液と共にインキュベートした。第二に、ヨウ化プロピジウムとSYTO9両方が透過処理、感染した宿主細胞に入ることができることを検証します。 <ol><li>死んだ細菌の集団を生成するために、1.5mlマイクロ遠心チューブ内のユニットを形成し、2×10 8個の細菌コロニーを採取し、70％のイソプロパノールを添加し、10分間放置。マイクロフュージA中の細菌をペレットND残留イソプロパノールを除去するためにPBSで2回細菌を洗い流す。 1.7 - その後、プロトコルは1.5ステップに従ってください。ガラススライドに細菌懸濁液の5μLを加え、カバーガラスでオーバーレイ。プロトコルステップ1.9のように、画像サンプル。これらの条件下では、人口の100％がヨウ化陽性（ 図2）である必要があります。いくつかの細菌種では、ヨウ化プロピジウムは完全SYTO9染色を圧倒できず、生育不能細菌は黄色やオレンジ色表示されることがあります。 </li><li>好中球のような食細胞の場合は、イソプロパノール-死菌に細胞を公開し、細胞内細菌の100％がヨウ化陽性（ 図3）であることを確認してください。死菌を内在化しないことができる非食細胞のためには、アジ化ナトリウム又は生/死染色溶液を添加する前に、他の細胞浸透性抗菌剤を用いて感染細胞を治療するのに十分であり得る。 </li></ol></li></ol> 2。 SYTOXグリーと評価する細菌生存率NおよびDAPI <ol><li>ラベル暗所で室温で20分間、モースの限定培地25中10μg/ mlのDAPIで目的の細菌。 </li><li> DAPIで標識した細菌と24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。 </li><li> MOPS / MgCl 2をで細胞を1回すすいでください。 </li><li>外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl 2に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンで暗所で室温で10分間、細胞をインキュベートする。提案しコントロールするためのプロトコルのステップ1.3の注を参照してください。 </li><li>細胞から培地を吸引し、MOPS / 塩化マグネシウムで0.5ミリリットル0.4μMSYTOXグリーンを追加します。 </li><li>暗所で室温で5分間、細胞をインキュベートする。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li> 5分間のMOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。 </li><li&gt;蛍光顕微鏡で30分以内に画像を取得します。顕微鏡、デジタルカメラ、および取得ソフトウェアの説明については、プロトコルのステップ1.9を参照してください。 </li></ol>注：アレクサフルーア647からの蛍光は590の励起波長のフィルターを用いて検出した - 650 nmおよび663の発光フィルター - 735 nmであり、偽色の赤です。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555nmのSYTOXグリーンからの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 375と400nmのバリアフィルター - DAPIからの蛍光は、355の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 <ol start="10"><li>このプロトコルは、外部生育不能細菌が緑+赤表示され、内部の生育不能細菌は青+緑に表示され、外部の生菌は青+赤で表示され、内部の生菌のみ（ 図4）青く見える画像になります。プロトコルセントで説明したように外部と内部の細菌の割合を定量化P 1.11。 </li><li>プロトコールステップ1.12に記載されたコントロールは、DAPI / SYTOX Green色素の組み合わせ（ 図2および図3）を用いて実施されるべきである。 </li></ol> 3。細胞内局在と並んで細菌の生存率を評価する<ol><li>ラベル暗所で室温で20分間、モースの定義された培地中で10μg/ mlのDAPIで目的の細菌。 </li><li> DAPIで標識した細菌と24ウェルプレートに直径12mmの円形のカバーガラスに付着している細胞に感染する。アルデヒドまたは有機溶媒を用いて細胞を固定しないでください。 </li><li> MOPS / MgCl 2をで細胞を1回すすいでください。 </li><li>外部の細菌を検出するために、MOPS /のMgCl 2に、関心対象の細菌種に特異的に結合するアレクサフルーア647結合抗体またはレクチンで暗所で室温で10分間インキュベートする。提案しコントロールするためのプロトコルのステップ1.3の注を参照してください。 </li><li>細胞から培地を吸引し、細胞を2 TIをすすぐMOPS / 塩化マグネシウム中でMES。 </li><li> MOPS / MgCl 2を0.2％サポニンを含有する、20分間の関心の細胞内マーカーに対するアレクサフルーア555結合抗体で細胞を培養する。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li> 5分間のMOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。 </li><li>細胞から培地を吸引し、MOPS / 塩化マグネシウムで0.4μMSYTOXグリーンを追加します。 </li><li>暗所で室温で細胞を5分間インキュベート。 </li><li> MOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を2回すすいでください。 </li><li> 5分間のMOPS / 塩化マグネシウム中で細胞を1回洗浄します。 </li><li>蛍光顕微鏡での30分以内に、スライドの画像を取得する。顕微鏡、デジタルカメラ、および取得ソフトウェアの説明については、プロトコルのステップ1.9を参照してください。 </li></ol>注：アレクサフルーア647からの蛍光は590の励起波長のフィルターを用いて検出した - 650 nmおよび663の発光フィルター - 735 nmであり、偽色の紫色である。蛍光fは580と600nmの発光フィルター - - 660 nmのロムアレクサフルーア555が540の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 495 nmおよび515の発光フィルター - - 555nmのSYTOXグリーンからの蛍光は、465の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 375と400nmのバリアフィルター - DAPIからの蛍光は、355の励起波長を有するフィルターを用いて検出した。 <ol start="14"><li>このプロトコルは、外部生育不能細菌が緑+紫に見える画像になり、内部の生育不能細菌は青+緑に表示され、外部の生菌は青+紫に見える、内部生菌は青表示され、細胞内のタンパク質（ 図4）、赤が表示されます。プロトコールに記載されているように外部と内部の生菌perecentを定量化することは1.11を繰り返します。 </li><li>プロトコールステップ1.12に記載されたコントロールは、DAPI / SYTOX Green色素の組み合わせ（ 図2および図3）を用いて実施されるべきである。 </li><li>で生存可能で、生育不能細菌をカウントすることに加え、目的の細胞内マーカーと共局在するため、正または負のいずれかとし、各細菌を分類する。 </li><li>生菌数の合計で共局在生菌数で割ることによって細胞内のマーカーと共局在生菌の割合を計算する。生育不能細菌の総数で生育不能共局在した細菌の数を割ることによって細胞内のマーカーと共局在生育不能細菌の割合を計算します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

DNAがヒト細胞にし、内部に取り付け生死菌を特定するための蛍光レクチンと一緒に結合し、実行可能性染料使用する2つのプロトコルがここに提示した。両方のプロトコルが有効に死菌からライブを区別するので、使用するプロトコルの選択は、実験の目的に依存します。第一のプロトコルはそのまま細菌を検出するために、生育不能細菌やSYTO9を検出するために、ヨウ化プロピジウムを使用...

細菌やそれらが存在するホスト間の動的相互作用と共進化があります。細菌が付着小器官、分泌系、および/または宿主食細胞および非貪食細胞のそれらの生産的な感染を可能にする毒素を産生する能力を進化させてきた。細菌は、宿主免疫系の認識と抗菌活性と競合しなければならない。宿主の免疫系は、物理的および化学的障壁、免疫細胞、補体系、及び体液性免疫の他の成分を含む、先天性および適応性の成分から構成されている。多くの細菌は、多層宿主免疫応答による殺傷およびクリアランスを受けやすいが、いくつかの病原性および日和見細菌は、種々の宿主細胞に感染し、宿主免疫応答1によるクリアランスを破壊するメカニズムを進化させてきた。 淋菌は、細菌病原体の一例であるそれは非常に、そのヒト宿主に固執するようになっている。N。淋菌は、容易に尿生殖路、咽頭、結膜、および直腸の粘膜上皮細胞の管の表面にコロニーを形成。植民地化は、粘膜部位に好中球の豊富な採用をトリガします。好中球は、微生物を殺す抗菌様々なプロセスを持っている専門的な食細胞であるが、N。淋菌は、好中球2-5の存在下で生存することが可能である。このようなNとしてどのように細菌性病原体の理解淋菌覆す、抑制し、最終的には、通常敵対ホスト環境で生き残るために免疫応答をハイジャックは、感染症と闘うための新たな治療法の開発に不可欠である。 多くの場合、宿主細胞内での細菌の生存を調査するために使用される実験プロトコルは、コロニーカウントアッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、電子顕微鏡法が挙げられる。コロニー数のアッセイでは、感染した細胞の集団は、WHの洗剤で、例えば（溶解されているICH細菌は細菌を遊離させるために）抵抗性である。溶解物を希釈し、寒天ベースの培地上にプレートし、溶解物中のコロニー形成単位を、各時点および/または実験条件について列挙されている。このアプローチは、全体の細菌集団の生存を報告したが、細胞内と細胞外の生存を区別することはできない。コロニーカウントアッセイの変形、ゲンタマイシン保護アッセイは、具体的には真核生物の原形質膜6を通過する抗生物質ゲンタマイシンできないことに基づいて、細胞内の細菌の生存率を測定する。しかし、このアッセイは、ゲンタマイシン（または同様に、真核生物膜非透過性である別の抗生物質）と内部の細菌へのアクセス権を持っている抗生物質のことができないことによって殺傷に対して感受性である細菌に依存している。したがって、ゲンタマイシン保護アッセイは、すべての細菌種の検査のために有効であるか否よい高度における細菌の生存率を調べると好中球などのピノサイトーシス細胞。 （細菌が凝集体又は異なって、個々の細菌細胞から振る舞う微小コロニーを形成している場合など ）これらのアプローチのいずれも、細胞内局在や個々の細菌の他の動作を明らかにする。個々の外部および内部の細菌の生存率を調べるための別のアプローチは、頻繁に使用される薄切片を透過型電子顕微鏡（TEM）である。それはさらに、亜細胞マーカーに対する金結合抗体を用いて免疫電子顕微鏡によって調査することができる宿主細胞（ 例えばファゴソーム、細胞質、オートファゴソーム）、細菌の位置に関する情報を提供することができるという点で、このアプローチは有利で ​​ある。しかし、電子顕微鏡では、細菌の生存能力を評価することを特に区別されません。埋め込まれた切片は、酢酸ウラニル、クエン酸鉛、または他の電子密度試薬で染色し、電子顕微鏡によって画像化されると、電子密度の高い細菌が生存可能であり、電気考えられているTRONルーセント生育不能7,8。しかし、この仮定はひどく混乱膜や細胞質を欠いたとだけ死菌ので、電子·ルーセントが表示され、細菌の生存能力を過大評価。さらに、いくつかの細菌種は、それが困難な生存率を決定すること、それらの成長段階に応じて、電子密度の範囲を表示することができる。 代替として、またはこれらの広く使用されている方法に加えて、ここでは、宿主細胞によって内在化に取り付けられた細菌の生存を評価するための細菌の生存率を示す蛍光染料の使用のためのプロトコルおよび理論的根拠を提供する。細胞外の細菌を同定するために、感染細胞を、最初のそのようなレクチンまたは細菌特異的抗体などの蛍光試薬にさらされる。感染した細胞は、その後、透過処理し、細菌の生存のための代理として、劣化した膜対そのままで細菌に差動的にアクセス可能なDNA特異的染料にさらされている。最初のP INヨウ化プロピジウムは、膜を侵害しているため、生育不能と考えられているものの細菌のみがアクセスされている間rotocol、膜透過性色素SYTO9は、全細菌集団を同定する。ヨウ化とSYTO9は、バイオフィルム中の細菌の生存能力を評価する非病原性細菌から病原性差別、そして実行可能な水性菌9月12日を列挙するために使用されている。 SYTOXグリーン生育不能人口のみがアクセスされているときに2番目のプロトコルでは、4 &#39;、6&#39;-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）は、総菌数を識別します。これらの生存度色素対は、細菌の細胞内局在を定義する、例えば、目的のタンパク質に関連して各細菌の位置を決定するために、免疫蛍光法と組み合わせることができる。これらのアッセイの使用は、宿主細胞の感染時に細菌殺傷または生存につながる相互作用に重要な洞察を提供します。この資料に記載されているプロトコルは、生存率を評価した好中球ファゴソーム5,13,14の異なる集団に含めた初代ヒト好中球、および内部で接続されている淋菌 。しかしながら、これらのプロトコルは、プロ食細胞、非専門食細胞、および原生動物で15-24グラム陽性およびグラム陰性細菌の生存率を評価するために適用することができる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water for irrigation</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>07-09-64-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 500</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>RDCD0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS no Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80 12CIR-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human interleukin-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L7007 or L7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-32463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CD63</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>H5C6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A20187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Bright Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004377</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。これらの疑問を解決するために、現在のプロトコルは、コロニー数アッセイ、ゲンタマイシン保護アッセイ、および電子顕微鏡が含まれています。コロニー数およびゲンタマイシン保護アッセイは、全体細菌集団の生存能力を評価し、個々の細菌生存率を測定することができない。電子顕微鏡法は、個々の細菌の生存度を決定し、宿主細胞におけるそれらの局在化に関する情報を提供するために使用することができる。しかし、細菌はしばしば生存率の評価を困難に、電子密度の範囲を示す。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。これらのアッセイは、初代ヒト好中球淋菌の生存を評価するために独自に開発されましたが、あるべき任意の細菌宿主細胞の相互作用にpplicable。これらのプロトコルは、アクセス可能であり、膜不透過性蛍光色素（ヨウ化プロピジウムおよびSYTOXグリーン）のすべての細菌を、染色膜透過性蛍光色素（SYTO9及び4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニル[DAPI]）を、コンバイン生育不能細菌。真核細胞の透過処理の前に、抗体または蛍光試薬は、細胞外細菌を同定するために添加される。したがって、これらのアッセイは、真核細胞への内部付着細菌の生存を判別する。プロトコルは、個々の細菌の細胞内局在を決定するために、真核細胞マーカーに対する蛍光抗体と組み合わせて生存色素を使用するために設けられている。この資料に記載された細菌の生存率染料は、個々の細菌の生存率を評価し、細菌が宿主細胞内で生存する場所に関する情報を提供するために、伝統的な微生物学技術に対して敏感で補体および/または代替物であるS。

概説したプロトコルは、N.の生存を調べた初代ヒト好中球5,26にさらされた後淋菌 。好中球は、感染させたN.淋菌および緑色蛍光生存色素SYTO9及び赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ 図4A）を使用して、プロトコル1で処理した。染料は、優先的に、宿主細胞原形質膜を透過性にするために、コレステロールを隔離サポニンの存在下ではなく、N.添加し?...

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Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.5K ビュー.  University of Virginia Health Sciences Center. 微生物は、真核細胞への曝露後に存続した場合、どのように細菌の病原性の分野の中心となるのは、定義する機能です。この記事では、内部および宿主細胞に関連する個々の細菌の生存を明らかに蛍光色素を使用するためのプロトコルの概要を説明します。 

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

免疫・感染学

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...