מחקר זה כבר נתמך על ידי מענקי NIH (PN2EY016525 וP41GM103832). SHS נתמכה על ידי מענק מהתכנית ללימודי ההדרכה Nanobiology בינתחומי של מרכז קק WM להבינתחומי Bioscience הדרכה של חוף מפרץ קונסורציומים (NIH גרנט מס T32EB009379). SHS גזור, גדל ומזוגג DRG ותאים בהיפוקמפוס, שנאסף cryo-EM ונתונים cryo-ET של DRG ואקסונים בהיפוקמפוס; שוחזר וצבע-מבואר סדרת ההטיה. MRG גזור וסיפק תאים בהיפוקמפוס במעבדה של MNR. SC סייע בביאור סדרת הטיה. SHS הוכשר על ידי CW על כיצד לנתח ולגדול נוירונים. SHS, WCM והמקלחת הגו את הניסויים. SHS הכין את כתב היד עם קלט ממחברים אחרים. וידאו זה צולם במרכז לסלולרי הדמיה וNanoAnalytics (C-Cina) של Biozentrum של tהוא באזל האוניברסיטה. C-Cina משתלב במחלקה לBiosystems מדע וההנדסה (D-BSSE) של המכון הטכנולוגי של ציריך, הממוקם בבאזל, שוויץ.

1. הכנת מאכלים עם EM רשתות עבור נוירונים העיקרי ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התקינות של פחמן מחורר על רשתות EM הזהב באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של לפחות 25X. לעשות חורי פחמן בטוחים&gt; 98% בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציפוי נוירונים עיקרי, השתמש במבער בונזן להבה לעקר רשתות EM ובמקביל להבהיר להם הידרופילי. להשתמש בפינצטה כדי להרים את רשת EM על ידי הקצה שלה, לא את אזור gridded המרכזי. זהירות: לעולם אל תשאיר את מבער בונזן מואר ללא השגחה, ולא להשתמש בכפפות או פינצטה עם רכיבי פלסטיק בעת ביצוע הפעולות הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שהדלקתי את המבער בונזן, הגדר את התאמות האוויר וגז למיקום מינימאלי פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את המבער בונזן באמצעות צור חלוץ או מצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התאמות האוויר וגז כדי להשיג אש קטנה, כחולה פנימית בתוך להבה גבוהה יותר, קלה יותר כחול / סגולה. קצה הלהבה הפנימית הוא החלק החם ביותר של הלהבה. הידית מתחתNeath צורב מתאים את כמות הגז שנכנס לצינור צורב, ואילו החבית של המבער ניתן להפעיל כדי להתאים את כמות האוויר שנכנס למבער. הפיכת כיוון השעון התאמת האוויר מקטינה את האוויר (וכתוצאה מלהבה סגולה) ונגד כיוון שעון מגביר את האוויר (וכתוצאה מלהבה צהובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה מתכת (ללא חלקי פלסטיק) כדי להחזיק את רשת EM, להעביר אותו במהירות דרך הלהבה פעמיים, מול פחמן בצד למעלה. צד פחמן יופיע יותר מט (פחות מבריק) ועם יותר מגוון אפרפר יותר מהצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להעביר את הרשת (פחמן בצד למעלה) למרכז צלחת הזכוכית תחתונה ממוקמת בתוך 10 סנטימטר של המבער בונזן. השתמש ברשת EM אחד לכל צלחת (איור 1). להשתמש רק בזכוכית התחתונה מנות הpresterilized, כלומר באמצעות גמא הקרנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק את תקינות הרשת (חורי פחמן ללא פגע) תוך שמירת רשת EM בתוך זכוכית בוטהמנה om (כדי למנוע זיהום). כאשר פונה לכל חומר על הרשת או כל דבר שבאות במגע עם תאי העצב, השתמש בהליך סטרילי וטיפים פיפטה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע בתרבית רקמה באמצעות הליך סטרילי, להחיל 250 μl של חומר הציפוי המתאים לאט ובזהירות לאזור הזכוכית המרכזי של צלחת פטרי. ודא שחומר הציפוי המתאים מכסה את כל רשת EM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים בהיפוקמפוס, השתמש פולי-L-ליזין (PLL, 1 מ&quot;ג / מיליליטר) כחומר הציפוי, שהוכן כמתואר 19 בעבר. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. לגנגליון שורש הגבי נוירונים (DRG), להשתמש בתערובת חלבון דביקה המופרש על ידי Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר (ראה טבלה של חומרים וריאגנטים) כחומר ציפוי, להכין באופן הבא. שים לב ש250 μl יש צורך לרשת EM, לכל צלחת, ולכן קנה מידה אצווה בהתאם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוק המניהשל תערובת החלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל תאי סרקומה עכבר (EHS) הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על קור תערובת חלבונים הדביקה מופרש על ידי Engelbreth-Holm-נחיל (EHS) תאי סרקומה עכבר, ואת כל הרכיבים המשמשים לייצור הפתרון, כלומר על ידי שמירה על אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד על קרח, לדלל תערובת חלבונים הדביקה הזה במדיום Neurobasal להניב דילול 01:20 (כלומר לדלל 500 μl של תערובת החלבונים הדביקה ל10 מיליליטר של Neurobasal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פער בדילול תערובת חלבונים דביק לתוך 1 מיליליטר aliquots, ולאחסן באופן מיידי כל aliquots נוספים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 250 μl לרשת EM, לכל צלחת, כפי שתואר בסעיף 1.4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי עם הראש שלה ודגירה (או עם PLL לדגימות בהיפוקמפוס, או עם תערובת החלבונים הדביקה לדגימות DRG) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר במכסת המנוע בתרבית הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASPIלדרג כל PLL (עבור דגימות בהיפוקמפוס) או תערובת הדביקה החלבון (לדגימות DRG) מהכלים. כדי לעשות זאת, השתמש במערכת הוואקום במכסת המנוע בתרבית הרקמה. השתמש בקצה פיפטה סטרילית המצורף לצינור הוואקום. להימנע ממגע ישיר עם רשת EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה אוויר העקירה מתכווננת ליישם בזהירות 250 μl של PBS סטרילי (פוספט שנאגרו מלוח) לרשת EM באזור הזכוכית המרכזית של כל צלחת פטרי, כך שרשת EM מכוסה באופן מלא על ידי PBS. ואז, לשאוב את PBS מכל מנה. חזור 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר המנות עם רשתות EM לייבוש מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה במשך 15 דקות. לוודא שהם יבשים לחלוטין על ידי בדיקה מתחת למיקרוסקופ האור בחדר בתרבית הרקמה. ודא שאין בועות של לחות ברשת. אם כן, בזהירות לשאוב הבא לרשת EM לחסל לחות נוספת זה. יש להשתמש ברשת המצופה באופן מיידי לציפוי תאי העצב. </li></ol> 2. הכנה וPlating ראשי נוירונים בEM רשתות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלחת נוירונים עיקרי, לנתח ראשון, trypsinize (באמצעות טריפסין 2.5%) וtriturate לנתק hippocampi (או גנגליון השורש הגבי של עוברי עכברים ישנים 18 יום) לתאים בודדים, כמתואר 19 בעבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate היא מונח נפוץ בשימוש על ידי neurobiologists לתאר גושים מתנערים של תאים לתוך תאים בודדים, בעיקר על ידי שימוש בפיפטה זכוכית עם קצה אש מלוטשת. התוצאה מושגת על ידי ציור בזהירות ובאיטיות ומשחרר את התאים, מעלה ומטה, מספר רב של פעמים (~ 30V) באמצעות פיפטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההליכים כפי שתוארו לעיל לנתיחה DRG ותא בידוד 24, בשים לב לשימוש טריפסין 0.25% (בHBSS) כדי לבודד את הנוירונים DRG חולדה, ולא להשתמש באנזימים הציעו (פפאין, collagenase / dispase) שמתאימים יותר לעכבר נוירונים DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר תאי העצב הבודד (כלומר באמצעות hemocytometer)ולהשתמש בערך זה כדי לחשב את הנפח המתאים של תאים שיחולו על כל מנה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / מ&quot;ל ​​לכל צלחת. הנפח המרבי ליישם הוא 250 μl. שים לב שזה רק ממלא את האזור המרכזי הזכוכית, לא את כל המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הכלים ל30 דקות בCO 2 באינקובטור ב 37 ° C. לאפשר לתאים להתאושש ולדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 1.5 מיליליטר של תקשורת חיממה לכל מנה, נזהר שלא להפריע לרשת EM. הסוג של מדיה תלוי בסוג התא (בהיפוקמפוס או DRG). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיה המתאימה לאף אחד מתאי עצב בהיפוקמפוס 19 או נוירונים גנגליון השורש הגבי 24, אשר שחמם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. דגירה צלחות הלילה בחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים בהיפוקמפוס, לשנות את התקשורת ביום שלמחרת. שינוי מחצית התקשורת בכל יומיים ואילך ל14 ימים. לחמם את התקשורת באמבט המים C ° 37 לפני השימוש. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים DRG, ביום שלמחרת לנתיחה / ציפוי, להכין מלאי חדש של תקשורת עם סוכן אנטי mitotic (uridine ו5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine) להפוך את פתרון מניות 10 מ&quot;מ של כל אחד, בנפרד; להשתמש סופי ריכוז של 10 מיקרומטר לכל אחד. הסר מחצית תקשורת DRG (875 μl) ולהוסיף 875 μl של תקשורת טרי עם הסוכן אנטי mitotic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים DRG, כל יומיים בשבוע הראשון, חלופי שינוי תקשורת בין כלי תקשורת אנטי mitotic ותקשורת DRG הסטנדרטי. בשבוע השני, לשנות את תקשורת DRG סטנדרטית בכל יומיים. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Vitrifying נוירונים בEM רשתות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הציוד ואת כל החומרים להקפאה ואחסון רשתות EM זהב בטמפרטורת קירור: מכשיר vitrification עם תא לחות 17, פינצטה מיוחדת עדין נקודה למכונת vitrification, פינצטה נקודה ארוכה שטוחה, דיואר (ים) של חנקן נוזלי (LN 2), גמיכל oolant, תיבת אחסון רשת EM, נייר סינון ללא סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מכשיר vitrification. הגדר את הלחות ל100% וטמפרטורה ל32 ° C. בסעיף &quot;המסוף&quot;, הגדר את זמן כתם לאפס שניות. זה מאפשר למדריך לסופג דרך צד החלון של תא הלחות של המכונה vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית נייר סינון ללא סידן עם כפפות, שכבותיהם כך ששלושה עיתונים נערמים. חותכים את הערימה לרצועות רחבה 0.5 סנטימטר כי הם ~ עוד 2 סנטימטר. לכופף אותם בזווית של ° 90 כך שצד אחד של הנייר יש 0.5 סנטימטר x 0.5 פנים סנטימטר (איור 2). בעזרת פינצטה, להסיר את הנייר באמצע ומניח אותו על נייר סינון ללא סידן נוסף עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את כפתור אחסון רשת בבעל הכפתור בתוך תא התהליכים. למלא את התא הפנימי של מיכל נוזל הקירור עם חנקן נוזלי ולחכות עד אידוי מוחלט. למלא את התא החיצוני של המיכל נוזל קירור דואר עם חנקן נוזלי עד שהוא משיג טמפרטורה יציבה שלימשיך לשלב הבא. למלא את התא הפנימי עם אתאן גזי טוהר גבוה שיהיה לדחוס למצב נוזלי בתוך התא מקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת (es) מהחממה לצלחת קלקר 100 מ&quot;מ גדול להובלה לחדר vitrification, אם לא בסביבה הקרובה. השתמש בפינצטה vitrification מיוחדת כדי לבחור את רשת EM זהירות מהצלחת. שים לב באיזה צד נוירונים גדלים על רשת EM; העמדה משנה לשלב הבא. השתמש בנעילה הזזה השחורה בפינצטה כדי לנעול מאובטח פינצטה על רשת EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את פינצטה לתוך מכונה vitrification צד שכזו של רשת EM שבנוירונים הם דבקו פרצופים לשמאל, הרחק מהחור בצד הפתיחה של המכונה vitrification. לחזור בי פינצטה מיוחדת למכונה vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מיכל נוזל הקירור בבעל המתאיםשל המכונה vitrification. יש למלא אותו עם LN נאות 2 ואתאן הנוזלי. באמצעות פקודת המסך המתאימה של המכונה vitrification, להעלות את תא נוזל הקירור כלפי מעלה עד שהוא הסמיק עם החלק התחתון של תא הלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פינצטה הנקודה שטוחה, לתפוס קצה אחד של נייר הסינון כך שהצד הקצר יותר (0.5 סנטימטר 0.5 x הפנים סנטימטר) הוא בניצב לפינצטה. פניה זו באה במגע ישיר עם רשת EM לסופג (איור 2). בזהירות להכניס את נייר הסינון לצד החור של תא הלחות של המכונה vitrification (איור 2 א). יציבות תצמיד את נייר רשת EM (הצד הפונה הרחק מהדגימה) ל10 שניות. מחק את הנייר אחר כך ומייד לצלול להקפיא את הדגימה באתאן הנוזלי באמצעות האוטומציה של המכונה vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר רשת EM-התייבשות הקפואה שלך בזהירות לאחד החריצים באחדכפתורי אחסון רשת. חזור על התהליך עבור רשתות EM נוספות במנות. כפתורי אחסון רשת EM משמשים בניסויים אלה יכולים לאחסן רשתות EM מרובות התייבשות קפוא. </li></ol> 4. אוסף תמונה, עיבוד, וביאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לאסוף micrographs אלקטרונים 2-D ו / או סדרה להטות 3-D של 5 neurites באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-בתנאי במינון נמוך. תמונות 2-D נועדו להעריך את האיכות של הרשת במונחים של עובי קרח והתחומים האפשריים להיות שימושי סדרה להטות 3-D ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה זה, את כל התמונות נאספו באמצעות מצלמת CCD 4k x 4k המצורפת למיקרוסקופ אלקטרונים 200 קילו וולט מצויד בבעל העברת cryo להטות חנקן הנוזלי יחיד, בהגדלה מיקרוסקופ 20k ביעד underfocus של 7 מיקרומטר ודגימה של 4.4 A / פיקסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג tomogram 3D של המדגם, לנקוט בשורה של תמונות הקרנה תוך הטיית אל המדגם באופן הדרגתיאונג ציר מיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים (TEM) אחד. בהתחשב בזוויות ההטיה והגדרות ניסיוניות אחרות, יש כמה תוכנות שונות זמינות כדי לאסוף את הסדרה להטות 5 באופן אוטומטי. הסדרה להטות 3-D מוצגת כאן נאספו באותו מיקרוסקופ באמצעות תוכנת רכישת סדרה להטות חצי אוטומטית-26 על פני טווח של -60 ° 60 ° ב 5 ° מרווחים עם מינון מצטבר של ~ 60 דואר / 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את סדרת ההטיה של neurites באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 21 כפי שתוארה קודם לכן לדוגמאות אחרות 5,29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבע תסמן את תכונות 3-D של neurites ידי פילוח הראשון tomogram ויצירת מודל פני השטח באמצעות תוכנת עיבוד תמונה 3-D כפי שתואר בעבר 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections.">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).</li><li>Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+dystrophic+neurites+characteristically+associated+with+senile+plaques+are+not+found+within+other+neurodegenerative+diseases+unless+amyloid+beta-protein+deposition+is+present.">Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present.</a> Brain Res. 606, 10-18 (1993).</li><li>Binks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+of+bacterial+cells.">Electron cryotomography of bacterial cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).</li><li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain.">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277, 1990-1993 (1997).</li><li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+aqueous+suspensions.">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).</li><li>Fern&#225;ndez-Busnadiego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+molecular+organization+of+the+neuron+by+cryo-electron+tomography.">Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography.</a> J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).</li><li>Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+membrane-bound+cellular+organelles.">Electron tomography of membrane-bound cellular organelles.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).</li><li>Garvalov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+particles+within+cellular+microtubules.">Luminal particles within cellular microtubules.</a> J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).</li><li>Gr&#252;newald, K., Cyrklaff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+complex+viruses+and+virus-infected+cells+by+electron+cryo+tomography.">Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).</li><li>Gu, J., Bourne, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural bioinformatics. , (2009).</li><li>De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons+and+astrocytes+from+fetal+rodent+brain.">Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure.">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Fink, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+neurite+extension+and+synapse+formation+by+the+beta+but+not+the+alpha+isoform+of+CaMKII.">Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII.</a> Neuron. 39, 283-297 (2003).</li><li>Jacob, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+matrix+granules:+their+behavior+during+changing+metabolic+situations+and+their+relationship+to+contact+sites+between+inner+and+outer+mitochondrial+membranes.">Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes.</a> Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).</li><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure.">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li><li>Ibiricu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+Electron+Tomography+of+Herpes+Simplex+Virus+during+Axonal+Transport+and+Secondary+Envelopment+in+Primary+Neurons.">Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons.</a> PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Koning, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo+electron+tomography+of+vitrified+fibroblasts:+microtubule+plus+ends+in+situ.">Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ.</a> J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li><li>Lotharius, J., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Parkinson's+disease:+dopamine,+vesicles+and+alpha-synuclein.">Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).</li><li>Luci&#263;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+imaging+of+neurons+grown+in+culture:+from+light+microscopy+to+cryo-electron+tomography.">Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).</li><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and.</a> 2, 152-160 (2007).</li><li>Marsh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+tomographic+studies+of+the+mammalian+Golgi.">Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+actin+networks+in+intact+filopodia.">Organization of actin networks in intact filopodia.</a> Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנחנו מראים שנוירונים חולדה עובריים (גנגליון שורש הגבי והיפוקמפוס) ניתן לגדל במיקרוסקופ אלקטרונים זהב רשתות (EM) וקפוא בקרח זגוגי רזה מספיק neurites להיות צילמה באמצעות 2-D cryo-EM וcryo-3-D ET. בעוד neurites בהיפוקמפוס בעבר צילמה באמצעות cryo-ET 8,10,18,23, פרוטוקול מפורט מספיק לשכפול מ...

נוירונים להקים חיוני מעגלים המורכבים לתפקוד של מערכת העצבים המרכזית ואת הפריפריה על ידי לפרט דנדריטים לקבל מידע ואקסונים, לעתים קרובות די ארוך, כדי לתקשר עם הנוירונים במורד הזרם. התוצאה neurite ממלאת תפקיד מהותי במהלך התפתחות עוברית והתמיינות ותחזוקה של neurites עצביות תומכת באופן ביקורתי את התפקוד של מערכת העצבים. תהליכים מדלקת עצבים גם תכונה קריטית בפגיעה עצבית והתחדשות, כמו גם הפרעות במערכת עצבים. לימודי אדריכלות עצבית הוא חיוניים כדי להבין הן את המוח הבריא והחולה. למרבה המזל, מערכות תרבית תאים עצביות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית קיימות שיכול לשחזר מבנים תאיים מורכבים והטרוגנית. בהתבסס על הבהרה של פלטפורמות ניסיוניות מוצקות, אסטרטגיות יעילות להדמיה המאפשרות ניתוחים איכותיים וכמותית של מורפולוגיה עצבית יש צורך. שימושי במיוחד הייתלהיות מתודולוגיה מפורטת המספקת פלטפורמה אחידה המאפשרת הדמית neurites, שני אקסונים ודנדריטים בקנה המידה ננומטרי. במיקרוסקופ אלקטרונים מסורתי דורש שימוש בממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף, אשר יכולה לגרום לעיוותים בדגימות ממצבם האמיתי. עד כה, רוב האפיונים מבניים בקנה המידה ננומטרי מבוססים על תאים גדולים יותר או רקמות שנחשפים לכימיקלים קשים כגון - ובכך להגביל את הפרשנות של הממצאים 4,9,25. יתר על כן, לחדירת קרן אלקטרונים, חתך נדרש לאורגניזמים או בליטות סלולריות מציגים עובי גדול מ 1 מיקרומטר 12. לבסוף, מחולק או הסתובב תוצאות רקמות באוסף של ערכות נתונים פרוסה ספציפית בדידות, מה שהופך מסורבלת להגדרת התכונה המוארכת של neurites. אפילו לcryo-EM, שבו חתך דגימה קפוא התייבשות הוא אפשרי, השיטה מציגה artif דחיסהפועל 1. בשנים האחרונות, חוקרים למדו איך לגדל תאי עצב בהיפוקמפוס ישירות על רשתות EM ו באתאן הנוזלי כדי לחזות בהמשך neurites באמצעות cryo-ET 8,10,18,23 הקפאת הבזק. עם זאת, מחקרים כאלה או להשתמש בהתקן מותאם אישית 10,23, או פרטי חוסר בצעד הסופג ליצירת קרח זגוגי מספיק דק להדמיה שגרתית 8,18. לדוגמא, מחקר אחד ממליץ על השימוש של 30-40 שניות לסופגים רשת EM 10, עם זאת, ערך זה הוא מותאם לא לשימוש כללי, אלא הוא ספציפי לאותו מכשיר ההקפאה לצלול בהזמנה אישית. שימוש במכשיר בהזמנה אישית ולא אחד 17 זמינים מסחרי לשמירה על לחות לפני מדגם ההקפאה לצלול יכול להוות מכשול לשחזור נרחב. בעוד שמחקרים אלה היו פורץ באופן חזותי neurites ידי cryo-ET, נקטנו צעד נוסף כדי לחקור את applicability של cryo-ET למגוון רחב של דגימות עצביות (נוירונים בהיפוקמפוס וגנגליון השורש הגבי). בנוסף, אנו דנים בשתי תוצאות אופטימליות והכי מוצלחות, כמו גם חפצים הפוטנציאליים שאפשר להיתקל באמצעות cryo-ET לדגימות מסוג זה. הגדרת טכניקה מפורטת לשימור באופן חזותי כל neurites בקנה המידה ננומטרי במצב כמעט טבעי היה לשפר את היכולת ליותר חוקרים לבצע מחקרי ultrastructural. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומפורט תוך שימוש בציוד זמין מסחרי כדי להכין נוירונים מבולבל, בלא כתם לדמיין neurites. זהו צעד ראשון חשוב לקראת המפרט את ultrastructure של neurites בריאה וכדי להניח את היסודות להבנה מה הבדלים מבניים קיימים בדגמי מחלה של מערכת עצבים. מאז cryo-ET יכול לפתור את תכונות neurite מבולבל, בלא כתם ב 3-D בקנה המידה ננומטרי, השיטה תגרום אפשרי כפי שמעולם לא יהיה זהביטוי להגדרת ארכיטקטורה מדלקת עצבים 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

Neurites, גם דנדריטים ואקסונים, הם תהליכים תאיים עצביים המאפשרים ההולכה של דחפים חשמליים בין תאי עצב. הגדרת המבנה של neurites היא קריטית להבנה כיצד תהליכים אלה להעביר חומרים ואותות שתומכים בתקשורת הסינפטי. במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כבר משמש באופן מסורתי כדי להעריך את תכונות ultrastructural בתוך neurites, עם זאת, החשיפה לממס אורגני במהלך התייבשות והטבעת שרף יכולה לעוות מבנים. מטרה שלא סופקו חשובה היא גיבוש נהלים המאפשרים להערכות מבניות אינם מושפעות מממצאים כאלה. הנה, הקמנו פרוטוקול מפורט ולשעתק לגידול וneurites כל הקפאה-הבזק של נוירונים עיקרי שונה ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבדיקה שלהם עם טומוגרפיה האלקטרונים cryo-(cryo-ET). טכניקה זו מאפשרת להדמיה 3-D של neurites הקפואה, התייבשות ברזולוציה ננומטר, בהנחיית assessment של ההבדלים מורפולוגיים שלהם. הפרוטוקול שלנו מניב תצוגה חסרת תקדים של הגנגליון הגבי שורש neurites (DRG), ויזואליזציה של neurites בהיפוקמפוס במדינה הקרובה למולדתם. ככזה, שיטות אלה ליצור בסיס למחקרים עתידיים בneurites של שני נוירונים נורמלים ואלה מושפעים מהפרעות נוירולוגיות.

לפני הקפאה והדמיה באמצעות cryo-ET, יש לנקוט בתמונות מיקרוסקופ אור של רשת EM שבו נוירונים גדלים. Neurites צריכה להיות לעין בלי חפיפה משמעותית אחד עם השני. קופסא צבעונית באיור 3A מייצגת אזור זה זנק ב להראות בהגדלה גבוהה יותר באיור 3 ב, שבי neurites משתרעת על פני סריג...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

preparation-primary-neurons-for-visualizing-neurites-frozen-hydrated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K Views.  Baylor College of Medicine.  כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים ב...

Video: Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

הכנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים מרכזיים עבור<em&gt; באתר</em&gt; התיקון clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

שימוש של שבבי Microfluidic פלסטיק מראש ממדר נוירונים מאתר העיקרי

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

כימות ספונטני Ca2+ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant thiol-disulfide redox buffer glutathione is considered a central player in antioxidant defenses. Therefore, measuring the mitochondrial glutathione redox potential provides useful information about mitochondrial redox status and oxidative stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is a genetically encoded, green fluorescent protein (GFP)-based ratiometric indicator of the glutathione redox potential that has two redox-state-sensitive excitation peaks at 400 nm and 490 nm with a single emission peak at 510 nm. This article describes how to perform confocal live microscopy of mitochondria-targeted Grx1-roGFP2 in primary hippocampal and cortical neurons. It describes how to assess steady-state mitochondrial glutathione redox potential (e.g., to compare disease states or long-term treatments) and how to measure redox changes upon acute treatments (using the excitotoxic drug N-methyl-D-aspartate (NMDA) as an example). In addition, the article presents co-imaging of Grx1-roGFP2 and the mitochondrial membrane potential indicator, tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE), to demonstrate how Grx1-roGPF2 can be multiplexed with additional indicators for multiparametric analyses. This protocol provides a detailed description of how to (i) optimize confocal laser scanning microscope settings, (ii) apply drugs for stimulation followed by sensor calibration with diamide and dithiothreitol, and (iii) analyze data with ImageJ/FIJI.

This article describes a protocol to determine differences in basal redox state and redox responses to acute perturbations in primary hippocampal and cortical neurons using confocal live microscopy. The protocol can be applied to other cell types and microscopes with minimal modifications.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...