이 연구는 NIH 보조금 (PN2EY016525 및 P41GM103832)에 의해 지원되었다. SHS는 걸프 지역 컨소시엄 (NIH 그랜트 번호 T32EB009379)의 학제 간 생명 과학 교육에 대한 WM 켁 센터에 NanoBiology 학제 간 대학원 교육 프로그램의 화목에 의해 지원되었다. SHS는 해부 성장하고 DRG와 해마 세포를 유리화, cryo 종 및 DRG와 해마 축삭의 크라이 ET 데이터를 수집, 재구성 및 틸트 시리즈 색상 주석. MRG는 해부와 MNR의 실험실에서 해마의 세포를 제공했다. SC는 경사 시리즈 주석의 지원. SHS는 뉴런을 해부하고 성장하는 방법에 대한 CW에 의해 훈련되었다. SHS, WCM, 화장실은 실험을 고안. SHS는 다른 저자의 의견으로 원고를 준비했다. 이 비디오는 t의 Biozentrum의 세포 이미징 및 NanoAnalytics (C-CINA)를위한 센터에서 촬영되었다대학 바젤 그. C-CINA는 스위스 바젤에있는 ETH 취리히의 바이오 시스템 공학 (D-BSSE)의 부서에 통합되어 있습니다.

1. 도금 차 뉴런을위한 EM 그리드와 요리 준비 <ol><li> 적어도 25 배의 배율로 광학 현미경을 사용하여 금 EM 그리드에 구멍 투성이의 탄소의 무결성을 검사합니다. 확인 탄소 구멍은&gt; 98 % 그대로 유지되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 기본 뉴런 도금의 경우, EM 격자를 화염 살균 동시에 그 친수성 ​​렌더링하는 분젠 버너를 사용합니다. 가장자리가 아닌 중앙 그리드 화 면적으로 EM 그리드를 데리러 핀셋을 사용합니다. 주의 : 자동 조명 분젠 버너를 두지 마십시오, 이러한 단계를 수행하는 동안 플라스틱 부품에 장갑이나 핀셋을 사용하지 마십시오 : <ol><li> 분젠 버너를 점화하기 전에 최소한의 개방 위치에 공기 및 가스 조정을 설정합니다. </li><li> 스트라이커 부싯돌 또는 부탄 라이터를 사용하여 분젠 버너에 불을. </li><li> 키도 크고, 밝은 블루 / 바이올렛 불꽃 내 작은 파란색 내부 불꽃을 달성하기 위해 공기 및 가스 조정을 수정합니다. 내부 불꽃의 끝이 불꽃의 가장 뜨거운 부분입니다. 아래의 손잡이버너의 총신이 공기가 버너 들어가는 양을 조절하기 위해 설정 될 수있는 반면 니스 버너, 가스 버너 튜브들이의 양을 조절한다. 공기 조절 시계 방향으로 돌리면 (보라색 불꽃의 결과로) 공기를 감소하고 반 시계 방향 (노란색 불꽃이 발생) 공기를 증가시킨다. </li><li> 탄소면이 위로 향하도록 두 번 불꽃을 통해 신속하게 전달, EM 그리드를 개최 금속 핀셋 (아무 플라스틱 부품)를 사용. 탄소 측 무광택 (이하 반짝)를 표시하고, 다른 쪽보다 칙칙한 색조의 더 많은 것을 가진 것입니다. </li><li> 즉시 분젠 버너의 10cm 이내에 배치 된 유리 바닥 접시의 중심으로 그리드 (탄소 쪽까지)를 전송합니다. 접시 당 하나의 EM 그리드 (그림 1)를 사용합니다. 만 presterilized하는 유리 바닥 요리, 즉 통해 감마 방사선을 사용합니다. </li></ol></li><li> 여전히 유리 BOTT 내부의 EM 그리드를 유지하는 동안 그리드 무결성 (탄소 구멍 그대로)을 확인하기 위해 광학 현미경을 사용하여OM 접시 (오염을 방지하기 위해). 신경과 접촉 할 그리드 또는 아무것도에 어떤 물질을 적용 할 때, 멸균 절차 및 멸균 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 멸균 절차를 사용하여 조직 문화 후드에서, 페트리 접시의 중앙 유리 영역에 차분히 적절한 코팅 물질의 250 μl를 적용합니다. 적절한 코팅 물질이 전체 EM 그리드를 포함해야합니다. <ol><li> 해마의 신경 세포의 경우, 이전에 19 바와 같이 제조 코팅 물질로서 폴리-L-라이신 (PLL, 1 ㎎ / ㎖)을 사용한다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. 후근 신경절 (DRG) 뉴런의 경우, 다음과 같이 준비, 코팅 물질로 (재료 및 시약의 표 참조) Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비되는 젤라틴 단백질 혼합물을 사용합니다. 250 μL가 접시 당, EM 그리드 당 필요합니다, 그래서 그에 따라 배치를 확장 할 수 있습니다. <ol><li> 주식 병을 녹여4 ℃에서 하룻밤 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물의 </li><li> 차가운 유지 Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포 및 얼음에 그들을 유지하여 즉, 솔루션을 만드는 데 사용되는 모든 구성 요소에 의해 분비 젤라틴 단백질 혼합물. </li><li> 얼음, 1:20 희석액을 수득 Neurobasal 배지에서 젤라틴이 단백질 혼합물을 희석하면서 (즉 Neurobasal 10 ㎖에 젤라틴 단백질 혼합물의 500 μL 희석). </li><li> 나누기는 1 ㎖ 분량 씩에 젤라틴 단백질 혼합물을 희석하고, 즉시 -20 ℃ 여분의 분량 씩 저장 </li><li> 1.4 절에 설명 된대로, 접시 당, EM 그리드 당 250 μl를 적용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 상단에 페트리 접시를 덮고 (해마 시편 하나 PLL과 함께, 또는 DRG 표본의 젤라틴 단백질 혼합물) 배양 조직 문화 후드에서 실온에서 1 시간 동안. </li><li> ASPI(해마 표본에 대한) 모든 PLL 또는 요리에서 (DRG 시편) 젤라틴 단백질 혼합물을 평가. 이를 위해, 조직 배양 후드에서 진공 시스템을 사용한다. 진공 튜브에 부착 된 멸균 피펫 팁을 사용합니다. EM 그리드와의 직접적인 접촉을 피하십시오. </li><li> 주의 깊게 EM 그리드가 완전히 PBS에 포함되도록 각 페트리 접시의 중앙 유리 지역에 EM 그리드에 멸균 PBS (인산염 완충 식염수)의 250 μl를 적용하는 조정 가능한 공기 변위 피펫을 사용합니다. 그런 다음 각 접시에서 PBS를 대기음. 3 회 반복합니다. </li><li> EM 그리드와 함께 요리를 15 분의 조직 문화 후드에서 건조하도록 허용합니다. 그들은 조직 문화 방에있는 광학 현미경으로 검사하여 완전히 건조되어 있는지 확인합니다. 반드시 그리드의 수분 기포가 없는지 확인합니다. 이 경우,주의 깊게 대기음 다음 EM 그리드에이 여분의 수분을 제거한다. 코팅 된 그리드는 신경을 도금 즉시 사용되어야한다. </li></ol> 2. 준비 및 PLEM 그리드에 ating 차 뉴런 <ol><li> 이전 19 설명한 바와 같이, 각각의 세포에 해마 (또는 18 일 된 쥐 배아의 후근 신경절을) 해리 기본 뉴런, 첫 해부를 Trypsinize (2.5 % 트립신을 사용하여) 씹다를 판에. <ol><li> 씹다 특히 화재 연마 팁 유리 피펫을 사용하여, 각각의 세포로 세포의 해리 덩어리를 설명하는 신경 생물 학자에 의해 사용되는 일반적인 용어입니다. 결과는 조심스럽게 천천히 피펫을 (~ 30), 상하, 여러 번 세포를 그리기 및 방출에 의해 달성된다. </li></ol></li><li> 마우스에 대한 더 적합한 제안 효소 (파파인, 콜라게나 / 디스 파제)를 사용하는 대신, 쥐 DRG 뉴런을 분리 (HBSS에) 0.25 % 트립신을 사용하여 메모를 복용 등의 이전에 DRG의 해부 및 세포 분리 (24)에 대해 설명한 절차에 따라 DRG 뉴런. </li><li> (즉 혈구를 사용하여) 절연 뉴런의 수를 계산및 접시 당 50000 세포 / ml의 농도를 달성하기 위해 각 접시에 적용하는 세포의 적절한 부피를 계산하기 위해이 값을 사용한다. 적용 할 수있는 최대 볼륨이 250 μL이다. 이것은 단지 중앙 유리 영역 전체가 아니라 요리를 채우는 것에주의. </li><li> 37 ℃의 CO 2 배양기에서 30 분 동안 접시를 품어 세포를 복구하고 준수 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 EM 그리드 방해가되지 않게주의하면서 각각의 요리에 가온 미디어 1.5 ML를 추가합니다. 미디어 유형은 세포 분류 (해마 또는 DRG)에 의존한다. <ol><li> 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 예열하는 해마의 신경 세포 19 또는 지느러미 루트 신경절 신경 세포 (24), 중 하나에 해당하는 매체를 준비합니다. CO 2 배양기에서 하룻밤 요리를 품어. </li><li> 해마 신경 세포의 경우, 다음날 미디어를 변경합니다. 14 일 동안 이틀 이후 미디어의 절반을 변경합니다. 사용하기 전에 37 ° C의 물을 욕조에 미디어를 따뜻하게. </리&gt; <li> DRG 뉴런의 경우, 해부 / 도금 다음 날, 항 유사 분열 제 (우리 딘 5&#39; - 플루오로-2&#39;-데 옥시 우리 딘) 개별적으로, 각각 10 mM의 원액을 가진 매체의 신선한 재고를 준비, 최종를 사용 각각 10 μM의 농도. DRG 미디어 (875 μL)의 절반을 제거하고 항 유사 분열 제와 신선한 매체 875 μl를 추가합니다. <ol><li> DRG 뉴런를 들어, 첫 번째 주에 대한 매 2 일, 다른 항 유사 분열 미디어 및 표준 DRG 미디어 사이에 미디어를 변경. 둘째 주 들어 이틀 표준 DRG 미디어를 변경합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. EM 그리드에 신경을 유리화 <ol><li> 극저온에서 금메달 EM 그리드 냉동 및 저장 장비와 모든 재료를 준비 습도 챔버 (17)와 유리화 장치, 액체 질소의 유리화 기계, 긴 평탄 점 핀셋, 듀어 (들)에 대한 좋은 점 전문 핀셋 (LN 2), Coolant 용기, EM 그리드 스토리지 박스, 칼슘 무료 필터 종이. </li><li> 유리화 장치를 시작합니다. 32 ° C.에 100 % 및 온도에 습도를 설정 &quot;콘솔&quot;섹션에서 0 초로에 오점 시간을 설정합니다. 이 유리화 기계의 습도 챔버의 사이드 창을 통해 블로 팅 매뉴얼을 할 수 있습니다. </li><li> 세 논문이 누적되는 등을 레이어드, 장갑 칼슘 무료 필터 용지를 처리​​ 할 수​​ 있습니다. ~ 2cm 긴 0.5 cm 폭 스트립으로 스택을 잘라. 용지 한면이 × 0.5 cm의 얼굴 (그림 2) 0.5 cm가되도록 90 ° 각도를 구부린다. 핀셋을 사용하여, 중간 종이를 제거하고 사용할 때까지 다른 칼슘 무료 필터 종이에 놓습니다. </li><li> 유리화 챔버 내에서 버튼 홀더에 그리드 스토리지 버튼을 놓습니다. 액체 질소를 냉매 용기의 내부 챔버를 입력하고 완전한 증발 될 때까지 기다립니다. 일의 외부 챔버를 채우액체 질소와 E 냉매 용기는 다음 단계로 진행하기 위해 안정적인 온도를 달성 할 때까지. 냉각 된 챔버 내에서 액체 상태로 응축됩니다 고순도 가스 에탄과 내부 챔버를 입력합니다. </li><li> 바로 인근에 유리화 방에 수송을위한 대형 100mm 폴리스티렌 접시에 인큐베이터에서 접시 (들) 이동하지 않을 경우. 조심스럽게 접시에서 EM 그리드를 선택하는 전문 유리화 핀셋을 사용합니다. 뉴런은 EM 그리드에 성장하는 쪽면에, 위치는 다음 단계에 문제가됩니다. 안전하게 EM 그리드에 핀셋을 잠 핀셋 블랙 슬라이딩 잠금 장치를 사용합니다. </li><li> 유리화 기계 신경 세포가 떨어져 유리화 기계의 사이드 오픈 구멍에서 왼쪽으로 얼굴을 부착되어있는 EM 그리드 등 그 옆에 핀셋을 삽입합니다. 유리화 기계로 전문 족집게 후퇴. </li><li> 해당 홀더에 냉각수 용기를 올려유리화 기계. 그것은 적절한 LN 2와 액체 에탄으로 가득해야합니다. 이 습도 챔버의 하부로 플러시 될 때까지 유리화 기계의 적절한 화면 명령을 이용하여, 상향 냉각제 챔버를 올린다. </li><li> 평탄 점 핀셋, 짧은 쪽 (0.5 센티미터 × 0.5 cm 얼굴) 핀셋에 수직이되도록 필터 종이의 한쪽 끝을 잡고. 이 얼굴 (그림 2B)를 모래 바닥에 EM 그리드와 직접 접촉한다. 조심스럽게 유리화 기계의 습도 챔버의 측면 구멍 (그림 2A)에 종이 필터를 삽입합니다. 안정적으로 10 초 동안 (측면 멀리 표본에서 마주) EM 그리드에 대한 용지를 개최합니다. 이후 용지를 취소하고 즉시 유리화 기계의 자동화를 사용하여 액체 에탄의 표본을 뛰어 동결. </li><li> 조심스럽게 하나의 슬롯 중 하나에 냉동 - 수화 EM 그리드 전송그리드 스토리지 버튼. 요리의 추가 EM 그리드에 대해이 과정을 반복합니다. 이 실험에서 사용 된 EM 그리드 저장 버튼 체류 냉동 - 수화 EM 그리드를 저장할 수있다. </li></ol> 4. 이미지 수집, 처리, 및 주석 <ol><li> 2-D의 전자 현미경 사진 및 / 또는 저용량 조건 극저온 전자 현미경을 사용하여 신경 돌기의 3-D 틸트 시리즈 5를 수집 진행. 2-D 이미지는 3-D 틸트 시리즈 편리하게 얼음 두께 및 가능 영역의 관점에서 그리드의 품질을 평가하도록 하였다. <ol><li> 이 경우, 모든 이미지 / 12 μM 및 4.4의 샘플링 언더 포커스 대상에서 20K 현미경 배율에서 단일 경사 액체 질소 크라이 전사 홀더를 구비 한 200 kV의 전자 현미경에 부착 된 4K X 4K CCD 카메라를 사용하여 수집되었다 픽셀. </li><li> 증분 샘플​​ AL 틸팅 동안 샘플의 3 차원 단층 화상을 얻기 위해서는, 투영 이미지의 시리즈를 취할투과형 전자 현미경 (TEM)의 하나의 축 옹. 틸트 각도와 다른 실험 설정을 감안할 때, 자동으로 틸트 시리즈 5를 수집 사용할 수있는 여러 가지 다른 소프트웨어가있다. 여기에 표시된 3 차원 기울기 시리즈는 ~ 60 E / 2의 누적 복용량을 가진 5 ° 씩 60 ° -60 °의 범위에서 반자동 기울기 시리즈 수집 소프트웨어 (26)를 사용하여 동일한 현미경에 수집되었다. </li></ol></li><li> 앞서 다른 샘플 5,29 대해 기재된 화상 처리 소프트웨어 (21)를 사용하여 신경 돌기의 틸트 시리즈를 재구성. </li><li> 제 단층 화상을 분할하기 이전에 5 바와 같이 3-D 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 표면 모델을 작성하여 신경 돌기의 3-D 기능 색깔 주석. </li></ol>

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Biol. 17, 79-84 (2007).</li><li>Medalia, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography.">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298, 1209-1213 (2002).</li><li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).</li><li>Nakatomi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Hippocampal+Pyramidal+Neurons+after+Ischemic+Brain+Injury+by+Recruitment+of+Endogenous+Neural+Progenitors.">Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors.</a> Cell. 110, 429-441 (2002).</li><li>Peachey, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+Observations+on+the+Accumulation+of+Divalent+Cations+in+Intramitochondrial+Granules.">Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules.</a> J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).</li><li>Raza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+is+associated+with+elevated+intracellular+calcium+levels+and+altered+calcium+homeostatic+mechanisms+in+hippocampal+neurons.">Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons.</a> Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).</li><li>Scroggs, R. S., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+current+variation+between+acutely+isolated+adult+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+of+different+size.">Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size.</a> J. Physiol. 445, 639-658 (1992).</li><li>Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental neuroscience. , (2003).</li><li>Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+hit+hypotheses+for+dopamine+neuron+loss+in+Parkinson's+disease.">Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+expression+of+glycine+and+GABA(A)+receptors+in+developing+spinal+cord+neurons.+Effects+on+neurite+outgrowth.">Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth.</a> Neuroscience. 108, 493-506 (2001).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 쥐의 배아 신경 (척수 신경절 및 해마는) 골드 전자 현미경 (EM) 그리드에 성장 및 2-D cryo 종 및 3-D의 극저온을 사용하여 몇 군데되는 자신의 신경 돌기에 충분한 얇은 유리 같은 얼음에 고정 할 수 있다는 것을 보여 ET. 해마의 신경 돌기 이전 크라이 ET 8,10,18,23을 사용하여 몇 군데되었지만, 프로토콜이 부족 한 상업적으로 사용 가능한 장치를 사용하여 성공적으로 복제 충분히 상세?...

뉴런은 다운 스트림 신경과 의사 소통을하기위한 정보와 축삭, 종종 아주 긴을받을 모 수석을 정교화하여 중앙과 말초 신경계의 기능에 대한 복잡한 회로의 핵심을 설정합니다. 신경 돌기 가지 신경계의 비판적 기능을 지원 배아 발달과 신경 세포의 분화 및 신경 돌기의 유지 보수 동안 근본적인 역할을한다. Neuritic 과정은 신경 세포의 손상 및 재생뿐만 아니라, 신경계 장애에 비판적 있습니다. 신경 세포의 구조의 연구는 모두 정상 및 병에 걸린 뇌를 이해하는 것이 중요합니다. 다행히, 생리학 관련 신경 세포 배양 시스템은 복잡하고 이질적인 세포 구조를 요점을 되풀이 할 수있다. 고체 실험 플랫폼, 신경 세포의 형태의 정성 및 정량 분석​​을 가능하게 효과적인 시각화 전략의 해명에 따라 필요합니다. 특히 유용한 것나노 미터 스케일에서 신경 돌기, 축삭과 수상 돌기 모두를 시각화하기위한 일관성있는 플랫폼을 제공하는 자세한 방법합니다. 기존의 전자 현미경은 그들의 진정한 상태에서 시험편에 왜곡을 유도 할 수있는 탈수 수지 매립 중에 유기 용매의 사용을 필요로한다. 따라서 연구 결과 4,9,25의 해석을 제한 - 현재까지 나노 미터 스케일에서 가장 구조적 특성 분석은 이러한 가혹한 화학 물질에 노출되는 더 큰 세포 또는 조직을 기반으로합니다. 더욱이, 전자빔 침투, 절편은 1 내지 12 ㎛보다 큰 두께를 나타내는 생물체 또는 세포 돌기 요구된다. 마지막으로, 신경 돌기의 신장 기능의 성가신 정의하고, 개별 슬라이스 특정 데이터 세트의 컬렉션에 조직의 결과를 단면 또는 가공. 비록 극저온-EM위한 냉동 수화 시험편을 구획하는 것이 가능하는, 상기 방법은 압축 ARTIF 도입1 역할을합니다. 최근 몇 년 동안, 연구자들은 EM 그리드 및 플래시 동결 이후 크라이 ET 8,10,18,23를 사용하여 신경 돌기를 시각화하는 액체 에탄을 직접 해마의 신경 세포를 성장하는 방법을 배웠습니다. 그러나, 이러한 연구는 맞춤 장치 10,23, 또는 일상적인 시각화 (8, 18) 얇은만큼 유리 같은 얼음을 생성하는 모래 바닥 단계에 부족 세부 사항을 사용 하나. 예를 들어, 한 연구는 EM 그리드 (10)를 모래 바닥에 대한 30 ~ 40 초를 사용할 것을 권장하지만,이 값은 일반적으로 사용하지 최적화되어 있지만, 사용자 정의 - 만든 플 런지 냉동 장치에 대해 특정입니다. 플 런지 동결하는 샘플을 이전의 습도를 유지하기위한 사용자 정의 만든 장치가 아닌 시중에서 한 17를 사용하여 광범위한 재현성에 대한 장애물을 초래할 수 있습니다. 이 연구는 극저온 ET으로 신경 돌기를 시각화에 획기적인되었지만, 우리는 AP를 탐험 한 단계 더 촬영했습니다신경 세포의 표본 (해마와 후근 신경절 신경 세포)의 다양한 크라이 ET의 plicability. 또한, 우리는 최선과 차선의 결과뿐만 아니라, 하나는 시편 크라이 ET를 사용하여 발생할 수있는 잠재적 이슈를 모두 설명합니다. 네이티브에 가까운 상태로 보존하고 나노 미터 규모로 전체의 신경 돌기를 시각화에 대한 상세한 기술을 정의하는 것은 미세 구조 연구를 수행하기 위해 더 많은 연구에 대한 능력을 향상시킬 것입니다. 이를 위해, 우리는 신경 돌기를 시각화하는 정착, 흠 뉴런을 제조 시판 장비를 이용하여 효율적이고 상세한 프로토콜을 설명한다. 이것은 건강한 신경 돌기의 미세 구조를 자세히 설명하고 구조적 차이가 신경계 질병 모델에 존재하는 것을 이해하기위한 토대를 마련하기 위해 향한 중요한 첫 번째 단계입니다. CRYO-ET는 나노 미터 스케일에서 3-D에 고정되지 않은, 흠없는 신경 돌기의 기능을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 가능한 결코로하게 될 것입니다neuritic 건축 (12)를 정의하는 앞.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="970">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Dumont #7 Tweezers</td>
			<td style="width:196px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:309px;">72803-01</td>
			<td style="width:171px;">For handling EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P35G-1.5-10C</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electron microscopy grids</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td>
			<td>For growing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium-free filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1541-055</td>
			<td>For blotting sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large flat point long tweezers</td>
			<td>Excelta Corporation</td>
			<td>E003-000590, 25-SA</td>
			<td>For blotting sample </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitrification device and tweezers</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>For freezing sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini grid storage boxes</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>160-40</td>
			<td>For storing EM grids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo transfer holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Semi-automated tilt series acquisition software</td>
			<td>SerialEM</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image processing software</td>
			<td>IMOD eTomo</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Transmission electron microscope for cryoEM</td>
			<td>JEOL, Tokyo</td>
			<td>200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4k x 4k CCD camera</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For imaging samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-D annotation software</td>
			<td>Visage Imaging GmbH</td>
			<td>Amira/Avizo</td>
			<td>For processing 3-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software for digitally stitching 2-D images</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>For processing 2-D data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-0252</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636-500MG</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td>For hippocampal culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant rat b-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#39;-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>For DRG culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary neurons for visualizing neurites in a frozen-hydrated state using cryo-electron tomography

신경 돌기, 모두 수상 돌기 및 축색 돌기는 뉴런 사이의 전기 자극의 전도를 가능하게 신경 세포 과정이다. 신경 돌기의 구조를 정의하는 것은 이러한 과정이 시냅스 통신을 지원 자료 및 신호를 이동하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 전자 현미경 (EM)는 전통적으로 신경 돌기 내의 미세 기능을 평가하는 데 사용되었습니다 있지만, 탈수 및 수지 매립시 유기 용제에 노출 구조를 왜곡 할 수 있습니다. 중요한 충족 목표는 유물의 영향을받지 구조 평가를 허용 절차의 수립이다. 여기, 우리는 성장하고 극저온 전자 단층 촬영 (크라이 ET)과의 시험 다음에 전자 현미경 그리드에 다른 차 신경의 플래시 냉동 전체의 신경 돌기에 대한 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설립했다. 이 기술은 ASSE 용이 나노 미터 분해능에서 냉동 수화 신경 돌기의 3-D 시각화를 허용자신의 형태 학적 차이 ssment. 우리의 프로토콜은 후근 신경절 (DRG) 신경 돌기, 그들의 네이티브에 가까운 상태에서 해마의 신경 돌기의 시각화의 전례가없는보기를 얻을 수 있습니다. 따라서,이 방법은 정상적인 신경 세포와 신경 장애에 의해 영향을 사람들 모두의 신경 돌기에 미래 연구를위한 기초를 만들 수 있습니다.

이전 크라이 ET를 통해 동결 및 이미징, 광학 현미경 이미지는 신경 세포가 성장하고있는 EM 그리드주의해야한다. 신경 돌기가 서로 상당한 중복하지 않고 명확하게 볼 수 있어야합니다. 그림 (a)에 색 상자가 확대 된에 신경 돌기가 격자의 격자에 걸쳐 확장되는 그림 (b)에서 높은 배율을 표시하는 영역을 나타냅니다. 각 그리드 사각형은 뉴런과 자신의 신경 돌기를 지원하...

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

79.0K 조회수.  Baylor College of Medicine.  미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다. 