This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

הערה: חלק מהצעדים להלן דורשים הפרוטוקול עובדים במנדף נקי. בנוסף, השיטה דורשת מיקרוסקופ לנתיחה שמרי הטטרדה מצויד מטרת מרחק 10X עבודה ארוכה כדי לפקח spheroplasting. מיקרוסקופ יש להגדיר בשכונה לפני הזמן. הסר את זרוע micromanipulator ובעל צלחת מההיקף ולמקם את הפריטים האלה במקום בטוח הרחק מאזור העבודה. 1. הכנת Spheroplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בתנאי שמרים רצויים. השתמש על 2 x 10 8 תאים עבור כל דגימה, למשל 4 מיליליטר של תרבות בOD600 1.4 = 5 x 10 7 תאים / מיליליטר. למרות עיבוד מיידי של דגימות עשוי להיות עדיף במקרים מסוימים, עבור מרבית היישומים, ניתן לאחסן aliquots הסלולרי בקרח לעד 8 שעות לפני העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות וספין בצנטריפוגה קלינית בהגדרת 5 (2,345 סל&quot;ד / 857.5 XG) במשך 3 דקות עד גלולה התאים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג טיפול לקיחה הבינוני לא לאבד את התאים מגלולים. בעדינות resuspend התאים במאגר ZK מיליליטר 1 ולאחר מכן להוסיף 40 dithiothreitol μl M 1 (DTT). דגירה 2 דקות עם ערבוב עדין. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורים גלולים במאגר ZK 1 מיליליטר. הוסף 5 μl של פתרון מוכן טרי של 100T zymolyase שכבר מעורב באופן יסודי. דגירה במשך 20-30 דקות על 30 מעלות צלזיוס להסיר את דופן התא ולייצר spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay אגל 10 μl של השעיה תא בשקופית מיקרוסקופ כדי לקבוע אם spheroplasting הוא מלא. תאים שנצפו תחת מיקרוסקופ לנתיחה ללא coverslip. תאים אמורים להופיע נפוחים ועגולים ולא מעט מוארכים וצריכים lyse הבא תוספת של 20 μl של מים. אם תאים לא מצליחים lyse, להחזיר את המדגם ל -30 מעלות צלזיוס ומחדש assay כל 10 דקות עד תמוגה מים מושרה הוא ציין בקלות. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend ולשטוף אני תא גלולהn 2.5 מיליליטר MES / חיץ סורביטול קר. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). בעדינות resuspend תא גלולה ב300-400 MES / חיץ סורביטול קר μl. יכולים להיות כל הזמן בתאים על קרח בשלב זה לכמה שעות. </li></ol> 2. כרומוזום הפצת הערה: משטחי הזכוכית שעליו כרומוזומים ייפרסו-או שקופיות או coverslips-צריך להיות מוכנים מבעוד מועד. כל שקופית או coverslip צריכה להיות שקוע במים, ואז EtOH, אז להתייבש, ומלוטש עם נייר עדשה. אם הכרומוזומים יתפרסו על coverslips, coverslip צריך להיות מודבקים לשקופית עם סקוטש או מלט גומי. אלא אם נאמר אחרת, שאר הפרוטוקול יתארו מתפשטים משני שקופיות או coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipettor P20, pipet 20 μl של השעיה תא על פני השטח של שקופית נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor P200, להוסיף 40 μl של 3% פתרון PFA / סוכרוז ולערבב בעדינות solution על ידי &quot;מתערבל&quot; השקופיות עם היד עד קווי Schlieren ייעלמו. מניחים שקופיות תחת מיקרוסקופ ולאשר כי תאים הם בפוקוס. את פתרון PFA צריך להיות מוכן טרי-במנדף ביום שימוש. הערה: אם החלבון של עניין לא נבדק על ידי השיטה בעבר, מומלץ להכין שקופיות נוספות באמצעות פתרונות המכילים 2 ו -4% PFA כדי לקבוע אם השמירה של החלבון רגישה לתנאי קיבעון. פתרון / סוכרוז 4% PFA משמש במקרים שבם רצוי לדמיין microtubules טובולין קשור. החסרון של הריכוז גבוה יותר הוא שמקבע את הכרומוזומים יהיו &quot;underspread,&quot; 2% PFA גם נוטה להניב כרומוזומים &quot;underspread&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor P200, להוסיף 80 μl של 1% Lipsol, מערבולת כמו קודם לערבב פתרונות שלמים ככל האפשר, להתחיל טיימר. במידת Lipsol לא זמין, 80 μl 1% NP40 או 80 μl DH 2 O יכולים להיותהוחלף (ראה נציגי תוצאות, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בתאים בזהירות ובעדינות מערבולת השקופית כל 15 שניות. כאשר כ -80% מהתאים lysed (נעלם) לעצור את שעון העצר, להסיר באופן מיידי את השקופית ממיקרוסקופ, להוסיף 80 μl של פתרון PFA / סוכרוז, ומערבולת לערבב. תמוגה צריכה להתרחש מבין 30 ל 90 שניות לאחר תחילת שעון העצר. הערה: אם כמה שקופיות להראות תמוגה בערך באותו הזמן, אחד יכול סופו של דבר להשמיט ניטור מיקרוסקופי לשארית השקופיות ופשוט זמן תקופה שבין תוספת של lipsol ותוספת של aliquot הסופי של מקבע בזהירות. עם זאת, קיצור זה רק אמין בעת ​​הכנת שקופיות מרובות מאותה הדגימה. עדיף לפקח תמוגה של כל דגימה מיקרוסקופית כאשר שקופיות שונות מוכנות מדגימות שנלקחו בזמנים שונים או מתרבויות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על משטח נקי ושטוח ולהפיץ את הנוזל על פני surfac unfrosted כלדואר של השקופית באמצעות הצד של pipet נקי, חד פעמי מרעה שנערך מתחת להמניסקוס של &quot;השלולית&quot; אבל מעל פני השטח של השקופית עצמה, כלומר. לא &quot;לגרוף&quot; את פני השטח של השקופיות עם pipet. אל תעשה שימוש חוזר pipet בשקופיות שונות, כדי למנוע זיהום של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את השקופיות לייבוש למשך הלילה במנדף. רכיבים גרעיניים מסיסים יישבו על פני השטח השקופיות ולהיקשר אליו. לניסויים גדולים, מתכנן את השימוש בחלל לצעד הייבוש חשוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתייבש, תוצאות אופטימליות מתקבלות על ידי התקדמות לשלב immunostaining באותו היום. עם זאת, פתרון סוכרוז המיובש מטביע כרומוזומים התפשטות ב&quot; דבש &quot;המאפשר הקפאה של דוגמאות: ניתן להעביר שקופיות לתיבת שקופיות פלסטיק ומאוחסנות ב -20 ° C במשך שנים. </li></ol> 3. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות בתמונה 0.2%-פלו למשך 30 שניות. כדי להסיר דבש. שקופיות להישען עלקצה, עם הקצה מונח על מגבת נייר, כדי להסיר תמונה-פלו שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות ב1x TBS במשך 5 דקות לשטוף. הסר נוזל עודף על ידי נשען שקופיות על קצה, אבל לא נותן להם להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות חלבית צד עד, pipet 300 μl TBS / BSA לשקופית מעבר לחלק unfrosted של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתא לח על RT במשך 15 דקות. (מיכל פלסטיק גדול מרופד במגבות נייר מים רוויים בתיבת שקופיות לוחית מתכת או פלסטיק מחוררת עם מגבות נייר רוויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים שקופיות על ידי מנוחה קצה קצר של השקופית על מגבת נייר ונשען השקופית נגד תמיכה מתאימה (כגון מדף מבחנה). אל תאפשר משטח לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחיל 80 μl של חיץ TBS / BSA המכיל את הדילול המתאים של נוגדן ראשוני. אם נוגדן הגבלה, להשתמש 40 μl וcoverslip 22 מ&quot;מ x 22. לסרום ארנבת גולמי, זה בדרך כלל בין דילול 1/50 ו1/500. הערה:בצע titrations להכנות נוגדן חדשים. ההכנה לדלל ביותר שתשואות גבוהות אות מעל הרקע נבחרה. כדי לשלוט על הרמה של מכתים רקע, צריכים להיות מוכנים מזן המוטציה המחיקה המתאים ו / או שקופיות כפולות גרעינים צריכים להיות מוכתם בדם לפני חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip 22 x 50 מ&quot;מ מלוטש בשקופית הימנעות בועות. לעשות זאת על ידי החזקת coverslip בין האגודל והאצבע לאורך הקצה הארוך בעמדות ליד קצה אחד קצר. מחזיק coverslip בביחס זווית של 30 מעלות כדי להחליק, הרחוק ביותר מקצה קצר האצבעות הוא הוריד עד שהיא נחה בשקופית רק בתוך קצה &quot;השלולית&quot; הקרוב ביותר לאזור החלבית של השקופית. אז לאט לאט להוריד את coverslip בתנועה חלקה עד האצבעות מחזיקות את מגע שקופיות הספסל, ולאחר מכן שחרר. אל תנסה להתאים את המיקום של coverslip רגע שנוחת. הערה: אם מרווחי כרומוזום הוכנו עלcoverslips המודבק (ולא ישירות על פני השטח של שקופיות), coverslip מדגם זה יישאר מודבקים לשקופית בכל שלבי הצביעה וכביסה. Coverslip נוסף יוצב על גבי coverslip המדגם להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה במהלך מכתים ולאחר מכן הושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בתא לח אטום ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק העברת הקצה החלבית השקופיות למדף צביעת שקופיות זכוכית ולצלול בצנצנת מכתים המכילה TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לטבול את השקופית למעלה ולמטה כדי להסיר את coverslip. נסה לא להשתמש בכוח רב מדי כדי לעשות את זה. שטוף את שקופיות 2x 10 דקות על ידי השריית בTBS. הסר שקופיות ממדף וניקוז נוזל עודף על ידי הנגיעה קצה למגבת נייר. אל תתנו יבש פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אור עמום, מייד להוסיף 80 μl TBS / BSA המכיל דילול פי 1/1000 של נוגדן fluorochrome מצומדות המשני (או 40 μl עם coverslip 22 x 22 מ&quot;מ). מודעהcoverslip ד כמו קודם ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 בתא הלח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverslips כמו קודם, לנקז שקופיות, ולאפשר משטח לייבוש באוויר ל1-2 שעות בחושך. שקופיות להישען על מגבות נייר כמו קודם. הערה: אם הפצה בוצע על coverslip רכוב, לנתק את coverslip מהשקופית לפני הייבוש. אז coverslips מיובש כפי שתואר עבור שקופיות בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אור מאופק, להוסיף כ -30 μl של הרכבה בינונית מכיל DAPI (שלוש 10 טיפות μl) ולאחר מכן להוריד את coverslip בזהירות. אם המרווחים הם על coverslips, למקם את הטיפות של מדיום הרכבה בשקופית נקייה ולהפחית את coverslip, צד כרומוזום למטה, לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדיין באור עמום, לחכות 2 דקות לcoverslip להתיישב ולאטום קצוות של coverslip עם לק ברור. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות שטוחות. הערה: למיקרוסקופיה STED, הר עם להאריך זהב. השתמש 30 μl של להאריך זהבללא DAPI ולאפשר לרפא לילה. איטום עם לק הוא מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בשקופיות על ידי מיקרוסקופ epifluorescence widefield עם 40 או אובייקטיבי 100X באמצעות מסנן להגדיר מתאים לDAPI להתמקד. לחלופין לאחסן את השקופית בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. לא להקפיא. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

שמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae מציעים יתרונות רבים ללימודים של מנגנונים מולקולריים של תהליכים ביולוגיים, כוללים המחקר של חלבונים השולטים פונקצית כרומוזום. למרות שיש יתרונות ידועים של שמרי ניצנים למחקרים גנטיים, מולקולריים, וביוכימיים, מחקרי ציטולוגית של ההפצה של חלבונים בגרעין התא מסובך על ידי גודלו הקטן. יש שמרי הגרעין הטיפוסי בקוטר של פחות ממיקרון אחד, וזה רק על 5 פעמים גבול הרזולוציה של אור הנראה. לפיכך, כמות המידע על ההפצה של חלבונים גרעיניים שניתן להשיג מimmunostaining הקונבנציונלי או באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוגבלת. גישה שימושית לאפיון הפצת subnuclear של חלבונים היא משטח כרומוזום הפצה. גישה זו כרוכה בהסרת קיר התא, שיבוש תא וקרום גרעין, וllowing תוכן בלתי מסיס של הגרעין להתיישב על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. רכיבים מסיסים אלה כוללים את המטריצה ​​הגרעינית וכרומוזומים. בנוסף מאפשר הסרת תוכן גרעיני מסיס, אשר משפרת את היכולת לזהות חלבונים מחויבים הכרומטין, כרומוזום הפצת תוצאות שיטה בלחץ משמעותי של כרומוזומים כך שיש לי גרעיני התפשטות קטרים ​​של 3 עד הסביבות 5 מיקרומטר (לגרעיני meiotic דיפלואידי) ו 2 עד 3 מיקרומטר לגרעיני mitotic דיפלואידי. לחץ זה מאפשר זיהוי של מסד גרעיני שקשה יחסית או בלתי אפשרי לפתרון בגרעינים שלמים. חסרון ברור לכרומוזום הפצה הוא האפשרות שהליך הפצה עשוי באופן חלקי או לחלוטין לשבש את המבנה של עניין. מדאיג במיוחד הוא שחלבון כרומוזום מחויב מסוים עלול ללכת לאיבוד כתוצאה מההליך מתפשט. שו סיבוך פוטנציאלי זהLD לזכור כאשר לפרש נתונים. דוגמא אחת של חלבון שהוא רגיש להליך הפצה היא בטא טובולין. בתנאים מסוימים, הציר, המורכב בעיקר מטובולין, נשמר במהלך הפצת 3. ויזואליזציה של הציר היא לעתים קרובות שימושית לשלב גרעינים של עניין. עם זאת, הדמיה טובולין דורשת טיפול עם מקבע ריכוז גבוה; צירים הולכים לאיבוד בתנאים הסטנדרטי המתוארים להלן. דוגמא זו ממחישה כי, בעת ניתוח ההפצה של חלבון uncharacterized בעבר, חשוב לגוון את הריכוז של מקבע כדי לקבוע כיצד רגיש החלבון הוא וריאציה כזו. למרות הדאגה לגבי ההשפעה של תנאי הפצה במבנה הכרומוזומים, השירות וכוחה של שיטת הפצה הודגם בהקשרים רבים ויש לו שירות רחב באפיון של mitotic ו, במיוחד תאי meiotic 4-7. Two שיטות הפצה נעשתה שימוש נרחב. הראשון של שיטות אלה, שפותחו על ידי השידה וג&#39;ירו 8, ימנע את השימוש בחומרי הניקוי ויכול להניב הכנות התפשטות שנראה שיש לי מורפולוגיה כרומוזום יחסית השתמרה היטב כאשר מוכתם עבור DAPI צבע DNA הספציפי. עם זאת, שיטה זו היא קשה יחסית למושלם והאיכות של גרעיני ההתפשטות משתנה באופן דרמטי, כאשר אזור אחד של שקופית בהשוואה לאזורים אחרים. בעיה זו יכולה לסבך גישות כמותיות שכרוכות הדמיה רבות גרעינים שלא נבחרו משקופית אחת, כדי למנוע הטיה רכישת נתונים. כרומוזום השני הפצת שיטה, שפותח על ידי Loidl ו1 קליין, כרוך איזון קיבעון על ידי paraformaldehyde, עם תמוגה ולחץ הכרומטין מקודם על ידי תמיסת ניקוי. כאשר מבוצעים כהלכה, שיטה זו נותנת תוצאות מאוד לשחזור עם פחות וריאציה אזור לאזור בהשוואה לשיטת השידה וג&#39;ירו. מצגת זו מתמקדת בmodifieגרסת ד של השיטה של ​​Loidl וקליין, בגלל האמינות והפשטות שלה. כרומוזום הפצה היא לא מסובכת או זמן רב; ניתן להכין עד 100 שקופיות עבור immunostaining ביום אחד. יתר על כן, הכנות ההתפשטות ניתן לאחסן במקפיא במשך שנים לפני immunostaining, ובכך מעבדות יכולות לפתח מאגר של ממרחי כרומוזום קפוא, שניתן להשתמש בי שאלות ביולוגיות חדשות להתעורר או חומרים כימיים צביעה חדשות הופכים לזמינים. שיטת כרומוזום הפצה היא נפוצה ביותר בשילוב עם immunostaining ומיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield, אבל אפשר גם להכין שקופיות לשיטות אור ברזולוציה סופר מיקרוסקופיות כגון דלדול פליטה המאולץ מיקרוסקופיה (STED).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

המראה של גרעיני התפשטות ביקורתי תלוי באיזון בין קיבעון כרומוזום ודה-דחיסה. גם כאשר ריאגנטים מאוזנת כראוי, וריאציה במידת כרומוזום דה-דחיסה יכולה להתרחש באזורים שונים של אותה השקופית ו / או בין שקופיות שונות. לפיכך, את האיכות של מרווחים באזור נתון של שקופית יש לבחון לפנ...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...