Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 dal NIH per Q. Li, e dai fondi IMPACT dal Dipartimento di Medicina a UAB di Q. Li. Il sostegno del Fondo Molette e Auburn University è apprezzato. Ringraziamo anche le assistenze tecniche da Ms. Pulin Che e Mr. Volodymyr Musiienko durante il corso dei lavori.

1. Le cellule, virus e antivirale Compounds <ol><li> Mantenere cellule BSR, un derivato di criceto neonato (BHK) rene alveoli 10, in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina. </li><li> Per tutti e tre saggi, cellule piastra in DMEM con 1% FCS, 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina, ottimizzata in precedenza 5. Questo mezzo è indicato come terreno di coltura per tutti e tre saggi. </li><li> Incubare tutte le celle in incubatrice a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità. </li><li> Targa-purificare e propagare il tipo 10 BTV (BTV-10) come descritto in precedenza 8. Diluire BTV-10 nel mezzo di saggio per ogni saggi designati. </li><li> Sciogliere tutti i composti di prova in DMSO per formare uno stock con concentrazione a 10 mm. Conservare le scorte a -20 ° C. </li><li> Diluire composti a concentrazioni desiderate utilizzando terreno di coltura per il designatod saggi 2. </li></ol> 2. Saggio-based CPE Uso CTG Kit <ol><li> Seed cellule BSR in una micropiastra 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) con MicroFlo selezionare dispenser. La densità di semina è di 5.000 cellule / pozzetto, e il volume di semina è di 20 microlitri per l&#39;analisi di efficacia antivirale. </li><li> Incubare le cellule per 2-3 ore sino cellule ottenere aderente alla piastra di fondo. </li><li> Aggiungere composto antivirale con una concentrazione finale di 10 mM di ciascun pozzetto. Mescolare completamente. </li><li> Diluire BTV a titolo desiderato e aggiungere 5 ml BTV con denotato MOI a ciascun bene. Per il controllo bene, aggiungere 5 ml di mezzi di dosaggio. Incubare le cellule infettate per 72 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità. </li><li> A 72 hpi, disgelo ed equilibrare tampone CTG e il substrato CTG liofilizzato a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Ricostituire la soluzione omogenea reagente CTG miscelando il liofilizzato enzima / substrato e il reagente tampone secondo thle istruzioni e del produttore. </li><li> Equilibrare le piastre di saggio a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aggiungere un volume uguale (25 microlitri) di reagenti CTG a ciascun pozzetto da un dispenser. Dopo incubazione per 15 minuti a temperatura ambiente al buio, misurare segnali di luminescenza utilizzando un lettore multi-mode con un tempo di integrazione di 0,1 sec. </li></ol> 3. Dose-risposta Assay <ol><li> Seme cellule BSR in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un distributore, con una densità di semina di 5000 cellule / pozzetto in un volume semina di 20 microlitri per saggio antivirale efficacia e 25 pl per test di citotossicità, rispettivamente . </li><li> Incubare le cellule per 2-3 ore a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità fino cellule sono ben attaccato alla piastra. </li><li> Saggio processo in una zona quarto della piastra a 384 pozzetti per ogni composto (equivalente ad una piastra a 96 pozzetti), come mostrato nella Tabella 1. Allocare otto repliche per ogni concentrazionein un singolo dosaggio. Assegnare la prima colonna come controllo positivo senza aggiungere composti e virus, e l&#39;ultima colonna (12 °) come controllo negativo aggiungendo virus solo senza composti. </li><li> Diluire composti a 50 mM in mezzo di saggio e aggiungere alla colonna 2 ° a 20 pl / pozzetto di saggio antivirale efficacia. Mescolare il composto cinque volte usando 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 25 mM. </li><li> Utilizzando 8-channel pipetta semi-automatico, trasferire 20 microlitri miscela in 2 ° colonna per colonna successiva (3 °), mescolare bene per formare una concentrazione di 12,5 micron. Ripetere questo processo trasferendo 20 microlitri miscela di colonna 3 al colonna successiva (4 °) per formare un altro diluizioni doppie con una concentrazione di 6,25 pM. Ripetere questa diluizione seriale duplice fino al 11 esima colonna. Aspirare ed eliminare 20 microlitri della miscela nella 11 esima colonna dopo l&#39;aggiunta e la miscelazione del compound. </li><li> Aggiungere BTV-10, sulla base MOI di 0,01, ad ogni pozzetto da colonna a colonna 2 11 con un volume di 5 ml / pozzetto. Dopo aver aggiunto il virus, la concentrazione del composto finale in ciascuna colonna deve essere: 20 mM in colonna 2, 10 mM in colonna 3, e prosegue con una diluizione duplice giù a colonna 11 con una concentrazione finale di 0,04 pM. </li><li> Aggiungere 5 ml di gamma medio colonna 1 come cellule di controllo solo (positivo) e 5 ml / pozzetto di BTV alla colonna 12 come infezione BTV unico controllo (negativo). </li><li> Diluire composti ad una concentrazione iniziale di 200 pM per test di citotossicità. Analogamente, aggiungere 25 microlitri / pozzetto di composto alla colonna 2 e 5x mescolato con 8 canali pipetta semiautomatico ad una concentrazione di 100 mM. Non aggiungere BTV. </li><li> Eseguire la diluizione serie duplice aspirando a 25 microlitri dalla colonna 2 alla colonna vicina 3, e continuò fino all&#39;ultima colonna (12 °). Alla colonna 12, dopo la miscelazione, aspirare e scartare 25 ml di mixture. La concentrazione finale in colonna 2 dovrebbe essere di 100 micron e la 12 esima colonna deve essere di 0,2 micron. La colonna 1 è l&#39;unico controllo cella. </li><li> Per entrambi l&#39;efficacia e la citotossicità saggi antivirali, incubare le piastre a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e 80-95% di umidità per 72 ore dopo il trattamento. Misurare la vitalità cellulare utilizzando il kit di CTG come descritto sopra (protocollo passaggi 2,5-2,7). </li></ol> 4. Time-of-Addition (ToA) Assay <ol><li> Seme cellule BSR da 1-24 colonna in una micropiastra a 384 pozzetti (nero, formato da 16 x 24) tramite un dispenser a 5.000 cellule / pozzetto e il volume semina è 15 microlitri / pozzetto. </li><li> Per ogni composto, utilizzare tutti ventiquattro colonne con otto repliche per ogni punto temporale in una metà della piastra a 384 pozzetti (Tabella 2). Assegnare colonna 1 come cellule controllo solo con l&#39;aggiunta di 10 microlitri / pozzetto terreno di coltura. Mark colonna 24 come infezione BTV solo controllo (controllo negativo) aggiungendo 5 microlitri / pozzetto dosaggio medio divirus d 5 microlitri / pozzetto a MOI di 0,01 ad un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. </li><li> Selezionare le colonne con numeri da colonna 2-22 come antivirale colonna di valutazione di efficacia in diverse ore dopo l&#39;infezione (HPI). In queste colonne, infettare le cellule con 5 ml / pozzetto BTV al MOI di 0.01. Al diversa hpi, aggiungi 5 microlitri / composto ben diluito ad ogni pozzetto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. Per il indicati -2 e -1 HPI aggiungono composto da cellule BSR prima infezione BTV. Per 0 hpi, aggiungere il composto e BTV alla cultura contemporanea. </li><li> Parallelamente, designare le colonne dispari da colonna 3-23 come composto controlla solo, dei quali composto sono stati aggiunti a diversi punti temporali come designato (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). In queste colonne, aggiungere 5 microlitri medio / pozzetto dosaggio e 5 microlitri / pozzetto diluito composto per formare un volume finale di 25 microlitri / pozzetto. </li><li> Dopo il trattamento, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 con 80-95% di umidità. </li><li> Determinare la vitalità cellulare a 72 HPI utilizzando il kit CellTiter-Glo come descritto in precedenza (protocollo passaggi 2,5-2,7). </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Elaborare tutti i dati del primo utilizzo corretto del software in-house in base ai segnali luminescenti ottenuti tramite il lettore multi-mode. Determinare il valore medio (media), la deviazione standard (DEVST) per ogni trattamento, nonché le variazioni coefficiente (CV), che richiede un valore non superiore al 10%. </li><li> Trasferire i dati elaborati dal software di cui sopra per un software biostatico e grafica. Effettuare l&#39;analisi di regressione non lineare per determinare i valori di EC 50 e CC 50. </li></ol>

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. 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Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per l&#39;identificazione iniziale di colpi antivirali, uno dei passaggi chiave per la scoperta di farmaci antivirali e di sviluppo è quello di sviluppare analisi robuste, che prevede la selezione di un indicatore quantificabile, lo sviluppo di un protocollo semplice, ottenendo segnali sufficienti e meno del 10% CV. Quasi tutte le schermate biochimiche o basati su cellule sono progettati per fornire un punto di partenza chimica basato sulla più robusta, semplice e poco costoso saggio, causa la riproducibilità richies...

BTV è un prototipo di virus a RNA a doppio filamento in genere Orbivirus, famiglia Reoviridae. BTV è una delle malattie più importanti del bestiame domestico, tra cui ovini, caprini, bovini e altri animali domestici, con la perdita di 3.000 milioni dollari / anno nel mondo 1,2. La BTV sierotipo esotico è un importante patogeno animale elencati nella sezione &quot;USDA alta Consequence Bestiame patogeni.&quot; Recentemente, il riemergere di BTV ha causato una grave focolaio di malattia in bovini e ovini in diversi paesi in tutto il Nord Europa 3,4. Come risultato della sua rilevanza economica e come sistema modello, BTV è stato oggetto di approfonditi studi molecolari, genetici e strutturali, e sono stati sviluppati diversi vaccini. Tuttavia, a causa della mancanza di test adeguati per la scoperta di farmaci antivirali, non ci sono disponibili antivirali contro BTV. In un recente screening ad alto rendimento (HTS) campagna usando BTV come sistema modello, Developed, ottimizzato e convalidato un saggio basato CPE-per identificare i potenziali antivirali ad ampio spettro contro arbovirus 5. Saggio basato CPE-è un saggio ben riconosciuto che è stato usato nella scoperta di farmaci antivirali contro una serie di virus che ha indotto un rapido e osservabile CPE / apoptosi 5-7. Nel nostro sistema, infezioni post BTV, CPE è evidente nelle cellule dei vertebrati, tra cui HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE BTV-indotta potrebbe essere monitorato e quantificato utilizzando vari metodi di rilevamento vitalità cellulare, compreso il kit di reagenti vitalità cellulare CellTiter Glo (kit CTG) 9. Questo kit determina il numero di cellule vitali in coltura a base di quantificazione di ATP cellulare presentato, che segnala la presenza di cellule viventi metabolicamente attive. In condizioni ottimali, il saggio basato CPE-qui presentato ha dimostrato la sua fattibilità con il protocollo di un passo &quot;mix e misura&quot;, e la flessibilità con i segnali luminescenti stabili. Nel frattempo, composti tossici riduziamento vitalità cellulare sarà escluso in questo saggio basato CPE. Il saggio basato CPE-ha mostrato la sua robustezza e affidabilità per la scoperta di farmaci antivirali contro BTV, ed è stato utilizzato per schermare il NIH molecolare Biblioteche Piccolo Molecola Repository (MLSMR), che porta alla identificazione di sei romanzo gruppo di potenziali lead compound antivirale (s ) 5. Quando un composto antivirale potenziale è stato identificato utilizzando il saggio basato CPE-, esso dovrà essere sottoposto al dieci concentrazione dosaggio dose-risposta per determinare l&#39;intervallo di efficacia antivirale e citotossicità 2. L&#39;efficacia antivirale, rappresentata come la concentrazione inibitoria del 50% (IC 50) o la concentrazione efficace 50% (EC 50), è la concentrazione di un farmaco che inibisce virus-indotto CPE metà strada tra la linea di base e massimo. La citotossicità dei farmaci antivirali, cioè la concentrazione citotossicità 50% (CC 50), è la concentrazionedi un farmaco che induce il 50% di citotossicità tra la linea base e massimo. L&#39;indice selettivo (SI), indicato come 50% SI (SI 50) è calcolata da CC 50 / IC 50 che determina la specificità del CPE antivirale contro virus-indotta. L&#39;IC 50 (o 50 CE), CC 50 e SI 50 valori sono misure fondamentali per determinare se un composto antivirale è potente e selettivo per l&#39;ulteriore sviluppo della droga. Quando un antivirale ha mostrato alcuna tossicità manifesta in vitro, ma virus impedito indotto CPE e il ciclo di vita virale produttiva, è importante per determinarne la MoA 2. Abbiamo avviato tale caratterizzazione effettuando test ToA per determinare l&#39;eventuale fase (s) di virale ciclo di vita che è influenzata dal antivirale. In generale, composto antivirale sono stati aggiunti alle cellule in diversi momenti pre-o post-infezione da virus. Se gli antivirali sono stati aggiunti alle cellule infettate rispondere alla sua destinazione step durante il corso dell&#39;infezione, ne risulterebbe minore attività rispetto a quella che è stata aggiunta prima della fase. Così, studio ToA è critica per determinare l&#39;efficacia di un composto antivirale, e il suo potenziale bersaglio, sia sul ciclo di vita virale o della macchina ospitante coinvolti nel ciclo di vita virale. Per tutti e tre saggi, la vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il kit CTG seguenti istruzioni del produttore 5. Questo sistema di rilevamento emette adeguati segnali di luminescenza che potrebbero essere analizzate utilizzando i vari software in-house. Ogni test è stato convalidato ed eseguito in almeno tre esemplari con otto repliche. Per tutti i dati ottenuti, tre parametri, con un valore medio (AVE), deviazione standard (DEVST), e coefficiente di variazione (CV) sono stati analizzati per determinare la robustezza del dosaggio. Una volta che la robustezza del saggio è stata determinata, i dati saranno ulteriormente analizzati e tracciati utilizzando vari biostatics e graficamentestrumenti di C 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Per identificare potenziali farmaci antivirali contro il BTV, abbiamo sviluppato, ottimizzato e validato tre saggi qui presentati. Il saggio basato CPE-è stato il primo test sviluppato per valutare se un composto ha mostrato alcuna efficacia antivirale e sono stati utilizzati per lo screening grande libreria di composti. Nel frattempo, la citotossicità di farmaci antivirali potrebbe anche essere valutata utilizzando il saggio basato CPE-. Il dosaggio dose-risposta è stato progettato per determinare il campo di efficacia per l&#39;antivirale prescelto, cioè il 50% della concentrazione inibente (IC 50) o la concentrazione effettiva (EC 50), così come la sua gamma di citotossicità (CC 50). Il saggio ToA è stato impiegato per lo studio iniziale MoA per determinare il meccanismo alla base dei nuovi farmaci antivirali durante il ciclo di vita virale del virus o il possibile effetto su un host macchinario cellulare. Questi test sono essenziali per la valutazione dell&#39;efficacia antivirale nel sistema di coltura cellulare, e sono stati utilizzati per le nostre ricerche recenti portarezione per l&#39;identificazione di una serie di nuovi farmaci antivirali contro il BTV.

1. Efficacia antivirale del composto Il saggio CPE a base di cellule è stato sviluppato, ottimizzato e validato in vitro utilizzando il kit CTG basata luminescenti a identificare nuovi farmaci antivirali contro BTV come descritto in precedenza 2,5. Il test di risposta ten-dose è stata impiegata per riflettere l&#39;efficacia antivirale e citotossicità di un composto guida identificato misurando il numero di cellule metabolicamente vitali in coltura a base di quantificazio...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Tre saggi, tra cui l&#39;effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d&#39;azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Views.  University of Alabama at Birmingham.  Tre saggi, tra cui l'effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d'azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione. 

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunofluorescenza per Monitorare il Cellular assorbimento di Lattoferrina umana e la sua associata attività antivirale contro il virus dell&#39;epatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

All&#39;inizio virali ingresso saggi per l&#39;identificazione e la valutazione di composti antivirali

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Sviluppo e identificazione di una sottopopolazione romanzo di Human neutrofili di derivazione fagociti Giant<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...