وأيد هذا المشروع من خلال منحة 1R03MH08127-01-02 و7R03MH08127 من المعاهد الوطنية للصحة لQ. لي، والأموال IMPACT من قسم الطب في البنك العربي المتحد إلى Q. لى. هو محل تقدير الدعم من صندوق Molette وجامعة أوبورن. نحن نشكر أيضا المساعدات الفنية من السيدة Pulin تشي والسيد فولوديمير Musiienko أثناء العمل.

1. الخلايا، والفيروسات والمركبات المضادة للفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا BSR، وهو مشتق من الطفل الهامستر الكلى (BHK) الخلايا 10، في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تحتوي على 5٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجميع المقايسات الثلاث، لوحة الخلايا في DMEM مع 1٪ FCS، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، كما الأمثل سابقا 5. يشار هذه الوسيلة كما مقايسة المتوسطة لجميع المقايسات الثلاثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة، وتنقية نشر 10 نوع BTV (BTV-10) كما هو موضح سابقا 8. تمييع BTV-10 في مقايسة المتوسطة لكل فحوصات معينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل جميع مركبات اختبار في DMSO لتشكيل الأوراق المالية مع التركيز على 10 ملي. تخزين الأسهم في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع مركبات لتركيزات المطلوب باستخدام مقايسة المتوسطة لالمكلفد المقايسات 2. </li></ol> 2. الفحص استنادا CPE-باستخدام CTG كيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا BSR البذور إلى 384 صفيحة ميكروسكوبية جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق MicroFlo حدد موزع. كثافة البذر هو 5،000 خلية / جيدا، وحجم البذر هو 20 ميكرولتر لتحليل فعالية المضادة للفيروسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 2-3 ساعة حتى الحصول على خلايا ملتصقة إلى لوحة بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مركب مضاد للفيروسات مع تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى كل بئر. مزجها تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع BTV لعيار المطلوب وإضافة 5 ميكرولتر BTV مع تدل وزارة الداخلية إلى كل بئر. للتحكم بشكل جيد، إضافة 5 ميكرولتر من وسائل الاعلام الفحص. احتضان الخلايا المصابة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 72 HPI، ذوبان الجليد وتتوازن CTG العازلة وحكومة تصريف الأعمال الركيزة مجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها. إعادة تشكيل متجانس حل كاشف CTG عن طريق خلط مجفف بالتجميد انزيم / الركيزة وكاشف العازلة وفقا لالتعليمات الشركة الإلكترونية لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن لوحات مقايسة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو (25 ميكرولتر) من الكواشف CTG إلى كل بئر من قبل موزع. بعد احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وقياس الإشارات التلألؤ باستخدام قارئ متعدد الأوضاع مع الوقت التكامل من 0.1 ثانية. </li></ol> 3. الفحص الجرعة والاستجابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا BSR البذور إلى 384 صفيحة ميكروسكوبية جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق موزع، مع كثافة البذر من 5،000 خلية / جيدا في حجم البذر من 20 ميكرولتر لفحص فعالية المضادة للفيروسات و 25 ميكرولتر من أجل سمية الخلايا الفحص، على التوالي . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 2-3 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة حتى الخلايا هي التي تعلق على لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص عملية في منطقة الربع من لوحة 384 جيدا لكل مركب (أي ما يعادل 96 لوحة جيدا)، كما هو مبين في الجدول رقم 1. تخصيص ثمانية مكررات لكل تركيزفي فحص واحد. تعيين العمود الأول باسم مراقبة إيجابية دون إضافة مركب والفيروسات، والعمود الأخير (ال 12)، والسيطرة السلبية بإضافة الفيروس فقط دون المركبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المركبات إلى 50 ميكرومتر في مقايسة المتوسطة وإضافة إلى العمود 2 الثانية في 20 ميكرولتر / جيد للفيروسات فعالية الفحص. مزج مركب خمس مرات باستخدام ماصة 8 قنوات شبه التلقائي إلى تركيز 25 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 8 قنوات شبه التلقائي، ونقل 20 ميكرولتر خليط 2 في العمود الثاني إلى العمود التالي (3 ش)، وتخلط جيدا لتشكيل تركيز 12.5 ميكرومتر. كرر هذه العملية عن طريق نقل 20 ميكرولتر من خليط العمود 3 الثالثة إلى العمود التالي (4 عشر) لتشكيل التخفيف شقين آخر مع تركيز 6.25 ميكرومتر. كرر هذا التخفيف المسلسل شقين حتى العمود ال 11. نضح وتجاهل 20 ميكرولتر من الخليط في العمود ال 11 بعد إضافة وخلط شركاتس اوند. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة BTV-10، على أساس من 0.01 وزارة الداخلية، إلى كل بئر من العمود إلى العمود 2 11 مع حجم 5 ميكرولتر / جيد. بعد إضافة الفيروس، ينبغي تركيز مركب النهائي في كل عمود يكون: 20 ميكرومتر في العمود 2، 10 ميكرومتر في العمود 3، واستمر مع التخفيف من شقين وصولا الى العمود 11 مع تركيز النهائي من 0.04 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من المتوسطة إلى العمود 1 كما خلية التحكم فقط (إيجابية) و 5 ميكرولتر / جيد من BTV إلى العمود 12 كما العدوى BTV التحكم فقط (سلبي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المركبات إلى التركيز الأولي من 200 ميكرومتر لسمية الخلايا الفحص. وبالمثل، إضافة 25 ميكرولتر / جيد من مركب إلى العمود 2 5x ومختلطة مع 8 قنوات ماصة شبه التلقائي إلى تركيز 100 ميكرومتر. لا تضيف BTV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ سلسلة التخفيف من شقين بواسطة الشفط 25 ميكرولتر من العمود إلى العمود 2 3 المجاورة، واستمرت حتى العمود الأخير (ال 12). في العمود 12، وبعد الاختلاط، ونضح وتجاهل 25 ميكرولتر من مixture. تركيز النهائي في العمود 2 ينبغي أن تكون 100 ميكرومتر ويجب أن يكون العمود 12 عشر عند 0.2 ميكرومتر. العمود 1 هو سيطرة خلية فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل فعالية وسمية الخلايا المضادة للفيروسات المقايسات، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2 و 80-95٪ الرطوبة لمدة 72 ساعة بعد العلاج. قياس بقاء الخلية باستخدام عدة CTG كما هو موضح أعلاه (بروتوكول الخطوات 2،5-2،7). </li></ol> 4. الوقت من إضافة (قسم) الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا BSR البذور من 1-24 عمود في صفيحة ميكروسكوبية 384 جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق موزع على 5،000 خلية / جيدا وحجم البذر هو 15 ميكرولتر / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل مركب، والاستفادة من كافة الأعمدة الأربعة والعشرين مع ثمانية النسخ المتماثلة لكل نقطة في نصف الساعة من لوحة 384 جيدا (الجدول 2). تعيين العمود 1 كخلايا التحكم فقط عن طريق إضافة 10 ميكرولتر / جيد المتوسطة الفحص. العمود علامة 24 كما العدوى BTV التحكم فقط (مراقبة سلبية) وذلك بإضافة 5 ميكروليتر / الفحص جيدا والمتوسطةفيروس د 5 ميكرولتر / جيد في وزارة الداخلية من 0.01 إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الأعمدة الزوجية من العمود 2-22 المضادة للفيروسات كما عمود تقييم فعالية في مختلف عدوى آخر ساعة (HPI). في هذه الأعمدة، تصيب الخلايا مع 5 ميكرولتر / جيد BTV في وزارة الداخلية من 0.01. في HPI مختلفة، وأيضا إضافة 5 ميكرولتر / مجمع المخفف جيدا إلى كل بئر لتشكيل الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد. لتدل -2 و -1 HPI إضافة المجمع لخلايا BSR قبل الإصابة BTV. ل0 HPI، إضافة المجمع وBTV للثقافة في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في موازاة ذلك، تعيين الأعمدة الفردية من العمود 3-23 كما مركب تسيطر فقط، منها مجمع أضيفت في مختلف نقاط الوقت كما المعينة (-2، -1، 0، 1، 2، 4، 8، 16، 24، 48 HPI). في هذه الأعمدة، إضافة 5 ميكرولتر المتوسطة / الفحص جيدا و5 ميكرولتر / جيد المخفف مجمع لتشكيل الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 مع 80-95٪ الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بقاء الخلية في 72 HPI استخدام عدة CellTiter-جلو كما هو موضح سابقا (بروتوكول الخطوات 2،5-2،7). </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة كافة البيانات أولا باستخدام المناسبة البرمجيات في المنزل استنادا إلى إشارات الانارة التي تم الحصول عليها عن طريق قارئ متعدد الأوضاع. تحديد القيمة المتوسطة (متوسط) والانحراف المعياري (STDEV) لكل معاملة، فضلا عن الاختلافات معامل (CV)، الأمر الذي يتطلب قيمة لا يزيد عن 10٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيانات التي تتم معالجتها من البرنامج أعلاه إلى أداة البرمجيات biostatic والرسوم البيانية. تنفيذ تحليل الانحدار غير الخطية لتحديد قيم EC 50 CC و50. </li></ol>

<ol>
	<li>Hemati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bluetongue+virus+targets+conventional+dendritic+cells+in+skin+lymph.">Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph.</a> J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Virostatic+Agents+against+Bluetongue+Virus.">Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus.</a> PLoS ONE. 7, e43341 (2012).</li><li>Meiswinkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2006+outbreak+of+bluetongue+in+northern+Europe--the+entomological+perspective.">The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective.</a> Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).</li><li>Szmaragd, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+case+fatality+during+the+recurrence+of+BTV-8+in+northern+Europe+in+2007.">Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007.</a> Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).</li><li>Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+and+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Bluetongue+virus.">Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus.</a> Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).</li><li>Noah, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+luminescence+assay+is+effective+for+high-throughput+screening+of+potential+influenza+antivirals.">A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals.</a> Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).</li><li>Che, P., Wang, L., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+optimization+and+validation+of+an+assay+for+high+throughput+antiviral+drug+screening+against+Dengue+virus.">The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).</li><li>Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+albopictus+inhibitor+of+apoptosis+1+gene+protects+vertebrate+cells+from+bluetongue+virus-induced+apoptosis.">The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis.</a> Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).</li><li>Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MTT+and+ATP-based+assays+for+the+measurement+of+viable+cell+number.">Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number.</a> J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+human+rhinovirus+infectivity+cell-based+assay+for+identifying+antiviral+compounds.">Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds.</a> J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).</li><li>Harvey, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+packaging+cell+line+for+production+of+flavivirus+replicon+particles.">Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles.</a> J. Virol. 78, 531-538 (2004).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triaryl+pyrazoline+compound+inhibits+flavivirus+RNA+replication.">Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+protection+against+the+highly+pathogenic+H5N1+influenza+virus+by+an+antisense+phosphorothioate+oligonucleotide.">In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide.</a> Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).</li><li>Ray, D., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+flavivirus+antiviral+drug+discovery+and+vaccine+development.">Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development.</a> Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+100,000-compound+library+for+inhibitors+of+influenza+A+virus+(H3N2).">High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2).</a> J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).</li><li>Severson, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+high-throughput+screen+for+inhibitors+of+SARS+CoV+and+its+application+in+screening+of+a+100,000-compound+library.">Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library.</a> J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).</li><li>Bolken, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+potent+small+molecule+inhibitor+of+hemorrhagic+fever+New+World+arenaviruses.">Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses.</a> Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).</li><li>Van Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+cellular+screening+assay+for+the+discovery+of+HIV-1+integrase+inhibitors.">A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors.</a> J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

لتحديد الأولي من الزيارات المضادة للفيروسات، واحدة من الخطوات الرئيسية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات والتنمية هو وضع المقايسات قوية، والذي يتضمن اختيار علامة للقياس الكمي، ووضع بروتوكول بسيطة، والحصول على إشارات كافية وأقل من 10٪ السيرة الذاتية. وقد صممت معظم ...

BTV هو النموذج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي للفيروس في جنس الفيروسة الوقبية، والأسرة Reoviridae. BTV هي واحدة من أهم الأمراض من الماشية المحلية، بما في ذلك الأغنام والماعز والأبقار والحيوانات الأليفة الأخرى، مع 3000000000 $ / سنوات الضياع في جميع أنحاء العالم 1،2. وBTV المصلي الغريبة هو الممرض الحيوانية الهامة المدرجة في &quot;وزارة الزراعة الأميركية العليا العواقب الثروة الحيوانية مسببات الأمراض.&quot; في الآونة الأخيرة، وإعادة الظهور BTV وقد تسبب انتشار واسع للمرض في الماشية والأغنام في العديد من البلدان في جميع أنحاء شمال أوروبا 3،4. نتيجة للأهمية الاقتصادية وكنظام نموذج، كان BTV موضوع الدراسات الجزيئية والجينية وهيكلية واسعة النطاق كما تم تطوير العديد من اللقاحات. ولكن نظرا لعدم وجود فحوصات المناسبة لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات، لا توجد الأدوية المضادة للفيروسات المتاحة ضد BTV. في الآونة الأخيرة إنتاجية عالية الفرز (HTS) الحملة باستخدام BTV كما في النظام النموذجي، ونحن دeveloped، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها مقايسة على أساس CPE لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف محتملة ضد arboviruses 5. مقايسة على أساس CPE هو فحص معترف بها التي استخدمت في اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد عدد من الفيروسات التي يسببها السريع ويمكن ملاحظتها CPE / موت الخلايا المبرمج 5-7. في نظامنا، بعد الإصابة BTV، CPE هو واضح في خلايا الفقاريات، بما في ذلك هيلا، BSR، وكلوة الجنين البشري 293T 8. ويمكن رصد CPE BTV التي يسببها وكميا باستخدام مختلف أساليب الكشف عن خلية الجدوى، بما في ذلك CellTiter جلو عدة بقاء الخلية كاشف (CTG عدة) 9. يحدد هذه المجموعة عدد من خلايا قابلة للحياة في الثقافة على أساس الكميات من ATP الخلوية المقدمة، وهو ما يشير إلى وجود الخلايا الحية عملية الأيض نشطة. في ظل الظروف الأمثل، القائم على الفحص CPE المقدمة هنا أظهر جدواه مع &quot;مزيج وقياس&quot; البروتوكول خطوة واحدة، والمرونة مع إشارات الانارة مستقرة. وفي الوقت نفسه، المركبات السامة reduالوراثة بقاء الخلية سيتم استبعاد في هذا الاختبار القائم على CPE. وأظهر الفحص القائم على CPE متانة وموثوقية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد BTV، واستخدمت لفحص NIH المكتبات الجزيئية الصغيرة جزيء مستودع (MLSMR)، الأمر الذي يؤدي إلى تحديد ستة العنقودية رواية المحتملة المضادة للفيروسات مركب الرصاص (ق ) 5. عندما تم التعرف على مركب مضاد للفيروسات المحتملة باستخدام مقايسة على أساس CPE، وسوف تحتاج إلى أن تخضع لعشرة تركيز الجرعة والاستجابة فحص لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات والسمسة 2. فعالية المضادة للفيروسات، ممثلة على النحو تركيز 50٪ المثبطة (IC 50) أو التركيز الفعال 50٪ (EC 50)، هو تركيز للدواء الذي يثبط التي يسببها فيروس CPE في منتصف الطريق بين خط الأساس والحد الأقصى. السمسة الأدوية المضادة للفيروسات، أي تركيز السمسة 50٪ (CC 50)، هو تركيزمن المخدرات حمل 50٪ من السمسة بين خط الأساس والحد الأقصى. ويتم احتساب المؤشر انتقائية (SI)، كما تدل 50٪ SI (SI 50) من CC 50/50 IC الذي يحدد خصوصية المضادة للفيروسات ضد CPE التي يسببها الفيروس. وIC 50 (أو EC 50)، CC 50 و 50 SI القيم هي تدابير حاسمة لتحديد ما إذا كان مركب مضاد للفيروسات هو قوية وانتقائية لمزيد من التطوير المخدرات. عندما أظهرت المضادة للفيروسات لا سمية العلني في المختبر، ولكن الفيروس منعت يسببها CPE والفيروسية دورة الحياة الإنتاجية، فمن المهم لتوصيف وزارة الزراعة 2 منها. بدأنا هذا التوصيف من خلال تنفيذ قسم فحص لتحديد الخطوات الممكنة (ق) من دورة الحياة الفيروسية التي يتأثر المضادة للفيروسات. عموما، أضيفت مجمع المضادة للفيروسات إلى الخلايا في أوقات مختلفة قبل أو عدوى فيروس آخر. إذا أضيفت مضادات الفيروسات إلى الخلايا المصابة إضافة إلى المستهدف قTEP أثناء الإصابة، فإنه من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض النشاط بالمقارنة مع واحد والتي تم إضافتها قبل الخطوة. وبالتالي، دراسة قسم هو أمر حاسم لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات من مركب، والهدف إمكاناته، إما على دورة الحياة الفيروسية أو آلات المضيفة المشاركة في دورة الحياة الفيروسية. لجميع المقايسات الثلاثة، تم تحديد بقاء الخلية باستخدام عدة CTG التالية تعليمات الشركة الصانعة 5. هذا النظام بإخراج الإشارات الكشف التلألؤ الكافية التي يمكن تحليلها باستخدام برامج مختلفة في المنزل. تم التحقق من صحة كل فحص، وأجرى على الأقل في ثلاث نسخ مع ثمانية النسخ المتماثلة. لجميع البيانات التي تم الحصول عليها، تم تحليل ثلاثة معايير، بما في ذلك القيمة المتوسطة (AVE) والانحراف المعياري (STDEV)، وشارك في كفاءة الاختلاف (CV) لتحديد متانة مقايسة. مرة واحدة وقد تم تحديد متانة الفحص، سيتم زيادة تحليل البيانات ورسم باستخدام مختلف الاستاتيكا البيولوجية والجرافيكأدوات ج 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات محتملة ضد BTV، وضعنا، والتحقق من صحتها ثلاثة الأمثل المقايسات المقدمة هنا. وكان الفحص القائم على CPE الفحص الأولى وضعت لتقييم ما إذا كان مركب أظهر أي فعالية المضادة للفيروسات والتي استخدمت لفحص مكتبة مجمع كبير. وفي الوقت نفسه، ويمكن أيضا أن يتم تقييم السمسة من الأدوية المضادة للفيروسات باستخدام مقايسة على أساس CPE. وقد تم تصميم مقايسة بين الجرعة والاستجابة لتحديد نطاق فعالية للفيروسات المحدد، أي 50٪ تركيز المثبطة (IC 50) أو التركيز الفعال (EC 50)، فضلا عن مجموعة من السمية الخلوية (CC 50). كان يعمل مقايسة قسم لدراسة وزارة الزراعة الأولية لتحديد الآلية الأساسية من الأدوية المضادة للفيروسات الرواية خلال دورة حياة BTV الفيروسية أو تأثير ممكن على المضيف الآلات الخلوية. هذه المقايسات الحيوية لتقييم فعالية المضادة للفيروسات في نظام الثقافة الخلية، واستخدمت لأبحاثنا الأخيرة تؤديجي إلى تحديد عدد من الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV.

1. فعالية المضادة للفيروسات من مجمع تم تطوير CPE فحص خلية مقرها، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها في المختبر باستخدام القائمة على الانارة CTG عدة لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV كما هو موضح سابقا 2،5. كان يعمل الاستج?...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus at JoVE.com

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

وقد وضعت ثلاثة فحوصات، بما في ذلك تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) القائم على الفحص، فحص الجرعة والاستجابة والوقت من بين الجمع (قسم) مقايسة، إلى أقصى حد، والتحقق من صحة استخدامها لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق رواية (BTV)، فضلا لتحديد آلية ممكنة من بين العمل (وزارة الزراعة) لمضادات الفيروسات التي تم تشخيصها حديثا.

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Views.  University of Alabama at Birmingham.  وقد وضعت ثلاثة فحوصات، بما في ذلك تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) القائم على الفحص، فحص الجرعة والاستجابة والوقت من بين الجمع (قسم) مقايسة، إلى أقصى حد، والتحقق من صحة استخدامها لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق رواية (BTV)، ?...

Video: Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...