Dieses Projekt wurde durch Gewährung 1R03MH08127-01 und-02 7R03MH08127 von NIH Q. Li unterstützt und von den Mitteln aus IMPACT Abteilung für Medizin an der UAB Q. Li. Unterstützung aus der Molette Fonds und der Auburn University wird geschätzt. Wir danken auch die technischen Hilfestellungen von Frau Pulin Che und Herr Volodymyr Musiienko im Laufe der Arbeit.

1. Zellen, Virus und die antivirale Verbindungen <ol><li> Aufrechterhaltung BSR Zellen, ein Derivat von Babyhamsternieren (BHK)-Zellen 10, in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend 5% fötales Kälberserum (FCS), 100U/ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Bei allen drei Assays Platte Zellen in DMEM mit 1% FCS, 100U/ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, wie zuvor optimierten 5. Dieses Medium wird als Testmedium für alle drei Assays bezeichnet. </li><li> Alle Zellen im Brutschrank inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Plaque-Reinigung und propagieren den Typ 10 BTV (BTV-10), wie zuvor 8 beschrieben. Verdünnen BTV-10 in Assay-Medium für jeden benannten Assays. </li><li> Lösen Sie alle Testverbindungen in DMSO, eine Aktie mit der Konzentration auf 10 mM zu bilden. Bewahren Sie die Aktien bei -20 ° C </li><li> Verdünnen Sie Verbindungen zu gewünschten Konzentrationen mit Assay-Medium für den designiertend 2-Assays. </li></ol> 2. CPE-basierte Assay unter Verwendung von CTG Kit <ol><li> Seed BSR Zellen in eine 384-Well-Mikroplatte (schwarz, Format 16 x 24) über MicroFlo wählen Spender. Die Aussaatdichte beträgt 5.000 Zellen / gut, und die Aussaat Volumen 20 ul für die antivirale Wirksamkeit Analyse. </li><li> Inkubieren Zellen für 2-3 Stunden bis Zellen erhalten Anhänger der Platte gründlich. </li><li> Hinzufügen antiviralen Verbindung mit einer Endkonzentration von 10 &amp;mgr; M zu jeder Vertiefung. Mischen Sie es vollständig. </li><li> BTV verdünnen, um die gewünschten Titer und mit 5 ul BTV bezeichnet mit MOI in jede Vertiefung. Für die Steuerung gut, fügen 5 ul der Testmedien. Die infizierten Zellen für 72 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Bei 72 hpi, Tauwetter und ins Gleichgewicht CTG-Puffer und die lyophilisiert CTG Substrat auf Raumtemperatur vor der Verwendung. Die Rekonstitution der homogenen CTG Reagenzienlösung durch Mischen der lyophilisierten Enzym / Substrat und die Puffer Reagenz nach thAnweisungen des e-Hersteller. </li><li> Äquilibrieren Die Testplatten auf Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Ein gleiches Volumen (25 &amp;mgr; l) CTG Reagenzien in jede Vertiefung von einem Spender. Nach Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur in der Dunkelheit zu messen Lumineszenz-Signale mit einem Multi-Modus-Lesegerät mit einer Integrationszeit von 0,1 Sekunden. </li></ol> 3. Dosis-Wirkungs-Assay <ol><li> Samen BSR Zellen in eine 384-Well-Mikroplatte (schwarz; Format von 16 x 24) über eine Abgabevorrichtung, mit einer Aussaatdichte von 5.000 Zellen / Vertiefung in einer Aussaat von 20 &amp;mgr; l für die antivirale Wirksamkeit und 25 &amp;mgr; l Assay für Zytotoxizitätstest jeweils . </li><li> Zellen, Inkubation für 2-3 h bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit bis Zellen sind an der Platte befestigt. </li><li> Verfahren Assay in einer Viertelfläche der 384-Well-Platte für jede Verbindung (äquivalent zu einer 96-Well-Platte), wie in Tabelle 1 gezeigt. Ordnen Sie acht Wiederholungen für jede Konzentrationin einem einzigen Assay. Weisen Sie die erste Spalte als positive Kontrolle ohne Zugabe von Verbindung und Viren, und die letzte Spalte (12.) als Negativkontrolle durch Zugabe von Virus nur ohne Verbindungen. </li><li> Verdünnen Sie Verbindungen zu 50 uM in Assay-Medium und zu der 2. Säule bei 20 ul / für die antivirale Wirksamkeit Assay. Mischen Sie die Verbindung fünfmal mit 8-Kanal-semi-automatischen Pipette bis zu einer Konzentration von 25 uM. </li><li> Verwendung von 8-Kanal-Halb automatischen Pipette, 20 &amp;mgr; l-Gemisch in der 2. Spalte zur nächsten Spalte (3.) zugeben, um eine Konzentration von 12,5 &amp;mgr; m zu bilden. Wiederholen dieses Prozesses durch die Übertragung von 20 ul Gemisch aus 3. Spalte zur nächsten Spalte (4 th), eine andere zweifachen Verdünnung mit einer Konzentration von 6,25 &amp;mgr; m zu bilden. Wiederholen Sie diese zweifache serielle Verdünnung bis 11. Spalte. Absaugen und entsorgen 20 ul der Mischung im 11-ten Spalte nach dem Hinzufügen und Mischen des Layoutound. </li><li> Hinzufügen BTV-10, bezogen auf MOI von 0,01, in jede Vertiefung von Spalte 2 bis Spalte 11 mit einem Volumen von 5 &amp;mgr; l / Vertiefung. Nach der Zugabe des Virus, sollte die Endkonzentration der Verbindung in jeder Spalte werden: 20 &amp;mgr; M in Spalte 2, 10 &amp;mgr; M in Spalte 3, und weiterhin mit einer zweifachen Verdünnung bis Spalte 11 mit einer Endkonzentration von 0,04 uM. </li><li> In 5 ul Medium in die Spalte 1 als Zell nur Kontrolle (positiv) und 5 ul / BTV Spalte 12 als BTV-Infektion nur Steuerung (negativ). </li><li> Verdünnen Verbindungen zu einer Anfangskonzentration von 200 &amp;mgr; M für Zytotoxizitätstest. Ebenso werden 25 ul / Vertiefung der Verbindung der Säule 2 und gemischt mit 5 x 8-Kanal-Pipette halbautomatisch auf eine Konzentration von 100 uM. Sie BTV nicht hinzu. </li><li> Führen Sie die zweifache Verdünnungsreihe durch Ansaugen von 25 ul aus Spalte 2 in die benachbarte Spalte 3, und dauerte bis in die letzte Spalte (12.). , In Spalte 12, nach dem Mischen, absaugen und entsorgen 25 ul mixture. Die Endkonzentration in Spalte 2 ist 100 um und der 12-ten Spalte sollte 0,2 &amp;mgr; m sein. Die Säule 1 ist die Zelle nur Steuerung. </li><li> Sowohl antivirale Wirksamkeit und Zytotoxizitätstests, Inkubation der Platten bei 37 ° C mit 5% CO &amp;sub2; und 80-95% Luftfeuchtigkeit für 72 Stunden nach der Behandlung. Lebensfähigkeit der Zellen zu messen unter Verwendung der CTG-Kit, wie oben beschrieben (Schritte Protokoll 2,5-2,7). </li></ol> 4. Time-of-Addition (TOA) Assay <ol><li> Seed BSR Zellen von Spalte 1-24 in einer 384-Well-Mikroplatte (schwarz, Format 16 x 24) über einen Spender mit 5000 Zellen / Well und der Aussaat Volumen 15 ul /. </li><li> Für jede Verbindung verwenden alle vierundzwanzig Spalten mit acht Replikate für jede Zeitpunkt in einer Hälfte der 384-Well-Platte (Tabelle 2). Weisen Spalte 1 als Zellen, die nur Steuer durch Zugabe von 10 ul / Assay-Medium. Spalte 24 Mark als BTV-Infektion nur Kontrolle (Negativkontrolle) durch Zugabe von 5 ul / Assay-Medium eind 5 &amp;mgr; l / Vertiefung Virus bei einer MOI von 0,01 bis zu einem Endvolumen von 25 ul / Vertiefung. </li><li> Wählen Sie die geraden Spalten aus Spalte 2-22 als antivirale Wirksamkeit Auswertung Säule zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion (hpi). In diesen Spalten, infizieren Zellen mit 5 ul / BTV bei MOI von 0,01. Bei verschiedenen hpi, auch in jede Vertiefung werden 5 &amp;mgr; l / Vertiefung verdünnt Verbindung, um ein Endvolumen von 25 ul / Vertiefung zu bilden. Für die bezeichnete -2 und -1 hpi hinzuzufügen Verbindung BSR Zellen vor der BTV-Infektion. Für 0 hpi, fügen Sie die Verbindung und BTV mit der Kultur gleichzeitig. </li><li> Gleichzeitig bestimmen die ungeradzahligen Spalten aus Spalte 3-23 als Verbindung nur steuert, die Verbindung zu unterschiedlichen Zeitpunkten zugegeben als (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16 bezeichnet, 24, 48 hpi). In diesen Spalten werden 5 &amp;mgr; l / Vertiefung Assaymedium und 5 &amp;mgr; l / Vertiefung verdünnt Verbindung, um ein Endvolumen von 25 ul / Vertiefung zu bilden. </li><li> Nach der Behandlung inkubieren Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 mit 80-95% Feuchtigkeit. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen bei 72 hpi mit der CellTiter-Glo-Kit wie zuvor (Protokoll Schritte 2,5-2,7) beschrieben. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Bearbeiten Sie alle Daten zuerst mit den richtigen In-House-Software auf der Basis der Leuchtsignale über den Multi-Mode-Reader erhalten. Bestimmen Sie den Mittelwert (Durchschnitt), Standardabweichung (STABW) für jede Behandlung sowie die Variationen Koeffizient (CV), der einen Wert von nicht mehr als 10% erfordert. </li><li> Übertragen Sie die verarbeiteten Daten von den oben genannten Software auf eine biostatischen und Grafik-Software-Werkzeug. Führen Sie die nicht-lineare Regressionsanalyse, um die Werte der EG-50 und CC 50 zu bestimmen. </li></ol>

<ol>
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Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Für die erstmalige Identifizierung von antiviralen Hits, ist einer der wichtigsten Schritte für die antivirale Wirkstoffforschung und Entwicklung, um robuste Tests zu entwickeln, die die Auswahl eines quantifizierbaren Marker, die Entwicklung einer einfachen Protokoll, ausreichende Signale und weniger als 10% CV enthält. Die meisten biochemischen und zellbasierte Bildschirme sind für eine chemische Ausgangspunkt auf der Grundlage der robustesten, einfache und kostengünstige Assay aufgrund der erforderlichen Reprodu...

BTV ist ein Prototyp Doppelstrang-RNA-Virus aus der Gattung Orbivirus, Familie Reoviridae. BTV ist eine der wichtigsten Krankheiten von Haustieren, darunter Schafe, Ziegen, Rinder und andere Haustiere, 3 Milliarden $ / Jahr weltweit 1,2 Verlust. Die exotische BTV-Serotyp ist ein in den aufgeführten wichtig Tierpathogen &quot;USDA Hohe Consequence Tierkrankheitserreger.&quot; Vor kurzem hat die wieder auftauchende der BTV hat einen großen Ausbruch der Krankheit bei Rindern und Schafen in mehreren Ländern in Nordeuropa 3,4 verursacht. Als Ergebnis ihrer wirtschaftlichen Bedeutung und als Modellsystem hat BTV Gegenstand von umfangreichen Molekular, genetische und strukturelle Untersuchungen und mehrere Impfstoffe entwickelt worden. Aufgrund des Mangels an richtigen Tests für antivirale Wirkstoffforschung, es gibt keine antivirale Verfügung gegen BTV. In einer aktuellen Hochdurchsatz-Screening (HTS)-Kampagne mit BTV als Modellsystem, wir dntwickelt, optimiert und validiert eine CPE-basierte Assays, um potenzielle Breitspektrum antiviralen Medikamenten gegen Arboviren 5 identifizieren. CPE-basierten Assays ist ein anerkannter Test, der in der antiviralen Arzneimittelforschung gegen eine Anzahl von Viren, die eine schnelle und beobachtbaren CPE / Apoptose induziert 5-7 verwendet wurde. In unserem System, Post BTV-Infektion ist CPE in Zellen von Wirbeltieren, einschließlich HeLa, BSR und HEK 293T-8 deutlich. BTV-induzierten CPE überwacht werden könnte und quantifiziert anhand verschiedener Zelllebensfähigkeit Nachweismethoden, einschließlich der CellTiter Glo Lebensfähigkeit der Zellen Reagenzien-Kit (CTG-Kit) 9. Dieses Kit bestimmt die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Kultur, die auf die Quantifizierung der zellulären ATP dargestellt, die das Vorhandensein von lebenden Zellen metabolisch aktiv signalisiert. Unter optimierten Bedingungen, die CPE-basierte Assays hier präsentiert werden, zeigen die Machbarkeit mit dem &quot;Mix und messen&quot; ein Schritt-Protokoll und Flexibilität mit stabilen Leuchtsignalen. Inzwischen toxische Verbindungen reduCING Zelllebensfähigkeit wird in dieser CPE-basierte Assays ausgeschlossen. Die CPE-basierte Assay zeigte seiner Robustheit und Zuverlässigkeit für die antivirale Medikamentenforschung gegen BTV, und wurde verwendet, um die NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), die auf die Identifizierung von sechs neuartige antivirale Potential Cluster von Blei-Verbindung (en führt zu screenen ) 5. Wenn ein potentieller antivirale Verbindung wurde unter Verwendung des CPE-basierten Assay identifiziert wird, muss sie auf die zehn-Konzentration Dosis-Wirkungs-Assay unterzogen werden, um das Spektrum der antiviralen Wirksamkeit und Zytotoxizität 2 zu bestimmen. Die antivirale Wirksamkeit als die 50% inhibitorische Konzentration (IC 50) oder 50% effektive Konzentration (EC 50) dargestellt ist, ist die Konzentration eines Arzneimittels, die virusinduzierte CPE auf halbem Weg zwischen der Grundlinie und Maximal hemmt. Die Zytotoxizität der Virostatika, also die 50% Cytotoxizität Konzentration (CC 50), ist die KonzentrationInduzieren eines Arzneimittels 50% Zytotoxizität zwischen der Grundlinie und Maximum. Der Auswahlindex (SI), 50% SI (SI 50) bezeichnet wird, von CC 50 / IC-50, die die Spezifität der antiviralen gegen Virus-induzierten CPE bestimmt, berechnet. Der IC 50 (oder 50 EG), sind CC 50 und SI 50 Werte kritisch Maßnahmen zu bestimmen, ob eine antivirale Verbindung potenter und selektiver für die weitere Entwicklung von Medikamenten ist. Wenn ein antivirales zeigte keine offensichtliche Toxizität in vitro, noch verhindert Virus-induzierten CPE und die produktive viralen Lebenszyklus, ist es wichtig, seine MoA 2 charakterisieren. Leiteten solche Charakterisierung durch Ausführen ToA Assay, um die möglichen Schritt (e) des viralen Lebenszyklus, die durch das antivirale betroffen bestimmen. Im allgemeinen wurden antiviralen Verbindung, um Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach der Virusinfektion zugegeben. Wenn die antiviralen Medikamenten wurden in die infizierten Zellen aufgenommen, um sein Ziel zu posten sTEP im Verlauf der Infektion, wäre es in niedriger Aktivität führen, verglichen mit der, die vor dem Schritt zugegeben wurde. Somit ist ToA Studie kritisch für die Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit der Verbindungen und ihrer potentiellen Ziel entweder auf dem viralen Lebenszyklus oder dem Hostmaschinen im viralen Lebenszyklus beteiligt. Für alle drei Tests wurde die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der CTG-Kit folgende Herstellerangaben 5 bestimmt. Dieses Erfassungssystem gibt ausreichend Lumineszenz-Signale, die mit Hilfe verschiedener Inhouse-Software analysiert werden konnte. Jeder Test wurde mindestens in dreifacher Ausfertigung mit acht Repliken validiert und durchgeführt. Für alle erhaltenen Daten wurden drei Parameter, einschließlich der Mittelwert (AVE), Standardabweichung (STDEV) und Variationskoeffizient (CV) analysiert, um die Robustheit des Assays zu bestimmen. Sobald die Robustheit des Assays bestimmt wurde, werden die Daten weiter analysiert und mit verschiedenen Biostatik aufgetragen und grafisch werdenWerkzeuge 2 c.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
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assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

Um mögliche Virostatika gegen BTV zu identifizieren, haben wir entwickelt, optimiert und validiert drei Assays hier vorgestellt. Die CPE-basierte Test war der erste Test entwickelt, um zu beurteilen, ob eine Verbindung zeigte keine antivirale Wirksamkeit und wurden verwendet, um Bildschirm großen Substanzbibliothek. Inzwischen konnte die Zytotoxizität von Virostatika auch mit dem CPE-basierte Assays ausgewertet werden. Die Dosis-Wirkungs-Assay wurde entwickelt, um den Bereich der Wirksamkeit für die ausgewählte antivirale bestimmen, dh 50% inhibitorische Konzentration (IC 50) oder effektive Konzentration (EC 50), sowie dessen Bereich der Zytotoxizität (CC 50). Die Toa-Assay wurde für die erste Studie MoA den zugrundeliegenden Mechanismus der neuen antiviralen Medikamenten während der BTV viralen Lebenszyklus oder der möglichen Auswirkungen auf die Wirtszellmaschinerie bestimmen, beschäftigt. Diese Assays sind entscheidend für die Bewertung der antiviralen Wirksamkeit in Zellkultursystem, und sind für unsere jüngsten Forschungen führen verwendetten zur Identifizierung einer Reihe von neuen antiviralen Medikamenten gegen BTV.

1. Antivirale Wirksamkeit von Verbindung Die Zell-basierten CPE-Assay wurde entwickelt, optimiert und in vitro unter Verwendung des Leuchtbasis CTG Kit neuartige antivirale gegen BTV identifizieren, wie zuvor beschrieben, 2,5 validiert. Die zehn Dosis-Wirkungs-Assay wurde verwendet, um die antivirale Wirksamkeit und Zytotoxizität einer identifizierten Leitstruktur durch Messen der Anzahl von metabolisch lebensfähigen Zellen in Kultur, die auf die Quantifizierung der zellul...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham.  Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen. 