מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG, גרמנית Research Foundation) תחת מספר מענק FO 315/4- ותכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופית (FP7/2007-2013) על פי הסכם גרנט מס בריאות F2-2009-241,778 ל CF.

1. זריעה של תאי האנדותל לתוך צלחות גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפח את תאי אנדותל כלי הדם במוח עכבריים (cEND) בבקבוק התרבות T75, שינוי המדיום (DMEM המכיל 10% FCS, 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) פעמיים בשבוע, עד שיגיע למפגש. (לדור וההנצחה של תאי אנדותל כלי הדם במוח, אנא עיין Burek et al, 2012;. פורסטר ואח&#39;, 2005 21,19.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS). הסר את PBS וtrypsinize את התאים עם פתרון טריפסין-EDTA חם 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד ששכבת התאים מפוזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 8 מיליליטר מדיום התרבות לתוך התאים. הקש בקבוק מספר פעמים לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק מוחלט מבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני פיפטה עם תאים מנותקים למעלה ולמטה. מערבולת את הבקבוק כדי לערבב suspensi התאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 μl של ההשעיה התא, הכניס לתוך hemocytometer ולספור את מספר התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את צפיפות תאי זרע ו20,000 תאים / 2 ס&quot;מ לתוך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך collagen1 precoated תרבות צלחות 6 גם גמישה בעל תחתית (57.75 ס&quot;מ 2) בהיקף כולל של 3 מ&quot;ל / היטב. לכל אחד יש גם שטח של 9.62 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שמחוברות אחת. לשנות את התרבות בינוני פעמיים בשבוע. </li></ol> 2. התמיינות תאים לפני הפגיעה הנגרמת על מתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את התרבות בינונית של התאים עם מדיום התמיינות (DMEM המכיל 1% סרום-הפשיטו עגל בסרום עוברי (ssFCS), 50 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li></ol> 3. פגיעה הנגרמת על מתיחה של תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התקן בקר פציעת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את העיכוב עד 50 אלפיות שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לחץ הרגולטור ל -15 PSI ולחץ על ההדק כמה פעמים, עד שלחץ השיא הרשום הופך להיות יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לחץ הרגולטור לערך הרצוי. השתמש בטבלת מס &#39;1 כמדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת התרבות גמישה בעל תחתית 6 היטב (57.75 ס&quot;מ 2) למחזיק המגש. ודא כי הבורר גם מוגדר היטב בגודל הנכון (כלומר גם גדול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תקע מתאם חוזקה מעל הבאר. החזק את התקע בחוזקה למקומו ביד אחת ואילו השני דוחפת את היד על ההדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את שיא הלחץ שנוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לשים את הצלחת בחזרה לתוך 37 ° C חממת האורך הרצוי של זמן או להשתמש באופן מיידי להצלחת ניסויים או הערכה. </li></ol> 4. הערכה של פגיעה למתוח על ידי assay ספיג דיי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר שהתאים היו strחרוט (שלב 3.7), להוסיף 30 μl של פתרון 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל של כדאיות כתם שפועל כסמן cytotoxicity (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד) למדיום הסלולרי התרבות (הערה: 10 μl של הפתרון לצבוע הוא לשמש עבור כל מ&quot;ל של מדיום תרבות תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם התוספת של הצבע לתאים, להציג באופן מיידי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 5. הערכה של פגיעה על ידי מתיחת קטט דהידרוגנאז (LDH) שחרור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר מתיחת התאים (שלב 3.7), להסיר 200 μl של מדיום תרבית תאים מהבאר. לעשות את אותו הדבר עבור כל נקודת זמן שלאחר פציעה שאתה רוצה לכלול בחקירה של LDH שחרור שלך (כלומר, לדוגמה: 30 דקות, שעה 1, 2 שעות, וכו &#39;.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תרבית תאים בינוניות בהגדרה הגבוהה ביותר של microcentrifuge במשך 5 דקות כדי להסיר כל פסולת תא. הסר את supernatant ולהשתמש בזה לשלבים שאחריו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאתה hשד &#39;סיים שלב 5.1 ולקח את הדגימות הדרושות שאתה רוצה יש לי מהנקודות הזמן השונות שהיית רוצה לחקור, lyse התאים באמצעות פתרון תמוגה הכלול בערכת LDH assay (ראה בטבלת משלים של חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 100 μl של מדיום assay נכלל בassay kitto כל גם צלחת 96 בארות המסופקת בערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 100 μl של מדיום תרבית התאים ללא תא לשתי בארות מקבילות של צלחת 96-בארות כלולות בערכת assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה ב 492 ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+traumatic+brain+injuries:+a+global+perspective.">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li><li>Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma:+a+review.">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li><li>Albert-Weissenberger, C., Sir&#233;n, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+traumatic+brain+injury.">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li><li>Morrison, B., Elkin, B., Doll&#233;, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury.">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li><li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+alterations+in+[Ca2+]i+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia:+an+in+vitro+model+for+neural+trauma.">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li><li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma.">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li><li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture:+characterization+of+the+model+using+astrocytes.">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li><li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal,+glial+and+endothelia+cells+(Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase.">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li><li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth.">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li><li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity.">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li><li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells.">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+voltage-dependent+Mg2++blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons.">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li><li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury.">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li><li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li><li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells:+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta.">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li><li>F&#246;rster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li><li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier.">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li><li>Burek, N. M., Salvador, E., F&#246;rster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model.">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li><li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons.">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li><li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury.">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li><li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury.">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li><li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li><li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat:+Part+2:+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins.">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

את ההשפעות של פגיעה מכאנית במבחנה נחקרו ושיטות הוקמו במשך האסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים 8, 9, 22. יש, עם זאת, נכון להיום עדיין לא ידוע במודל במבחנה של פציעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית. מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק 6. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמש כמודל של מחסום דם המוח (BBB), כגון מה מתנות הפרוטוקול שלנו עשויות להיות שימושית. פרוטוקול זה עושה שימוש בתאי cEND, מודל שהוקם BBB במעבדה שלנו. מאז התמוטטות BBB לעתים קרובות תועדה בחולי TBI וTBI קשור לעתים קרובות לשיבוש BBB אשר עלול לגרום להיווצרות בצקת 23, 24, שיטת prèsented כאן עשויים דווקא לשמש בביצוע מחקרי BBB ביחס לTBI. במודל זה, חשוב לטפל בכמה מעלות מפציעת מתיחה מוחלות על התאים. באותה מידה כמו התאים נפצעו בכל מקרה, ועם כל מה כמות הלחץ מוחל, מידת פגיעה שיכול להשפיע על תאי האנדותל שונה בהרבה מאוד מסוגי תאים אחרים. תאי האנדותל אבי העורקים הם עמידים יותר בפני פגיעה מלמתוח האסטרוציטים או תאי גלייה מעורבים 9. בנוסף, הם לתקן במהירות רבה יותר לאחר פציעה בהשוואה לסוגי התאים האחרים. לכן, לתאי מוח, תאי אנדותל במיוחד cEND, כמות גדולה יותר של פציעת מתיחה יש צורך לייצר רמה גבוהה של פציעה. אפשר להשיג את המידה הרצויה של פגיעה על ידי יישום הלחץ המקביל שצוין בטבלת 1. לתאי cEND, לעומת זאת, פגיעה קשה היא מועדפת בשל התנגדותם למתח. מבחני שנערכו הראו LDHשככל שהמידה של עליות מתיחה, יותר LDH מופרש לתוך הנוזל העליון. לעומת זאת, בתאים שקבלו כמות נמוכה של פציעת מתיחה הופקו LDH בסכום דומה כדי לשלוט בתאים. כפי שצוין בפרוטוקול, יש לדאוג שהכמות המתאימה של מדיום משמשת מאז עלייה או ירידה בכמות בינונית עלולה לגרום להבדלים בלחץ השיא להחיל את הבארות. לדוגמה, המכיל 5 מ&quot;ל גם של נוזל רושם שיא בלחץ הממוצע של 4.0 PSI ואילו גם ריק רושם ממוצע של 3.8 PSI כאשר לחץ psi 45 מוחל. לכן, הדרך הטובה ביותר הוא לדחוף את ההדק מספר פעמים על שליטה גם על מנת להבטיח כי לחץ השיא שיופק מתאים לכמות הרצויה. בניסויים שלנו השתמשנו כדאיות כתם כדי לקבוע את האפקט של מתיחה לחדירות של קרום התא. אופטיקה של צלחות התרבות גמישות התחתיות ששמשנו אותנו מאפשרת לנו VIEW התאים המוכתמים ישירות מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, כשרוצים לבצע מחקרי immunolabelling ישירות לאחר המתיחה פציעה, עלולים להתעורר קשיים. ראשית, בגודל ובעובי של הצלחת עלול להוות בעיה עם כמה פלטפורמות צפייה מיקרוסקופ. שנית, אופטיקה של הקרום גמיש של גם עשויה להיות מכשול כדי לנקות צפייה. למרות המגבלות הנ&quot;ל, לעומת זאת, הליך המתואר יכול לשמש כמודל לפגיעה מכאנית במבחנה של BBB. פגיעה מוחית טראומטית (TBI) כוללת שני רכיבים, כלומר, איסכמיה וטראומה. איסכמיה יכולה להתרחש כפגיעה משנית בעקבות TBI במקרים שבם יש אובדן דם חמור וכתוצאה מכך לחץ דם נמוך או כתוצאה מנפיחות במוח המגביל את אספקת חמצן למוח. זה נחשב נזק מושהה, nonmechanical מייצג תהליכים פתולוגיים ברציפות ביוזמת ברגע של פציעה 25. המופע של היפוקסיהפגיעה מוחית טראומטית חמורה חרו נפוצה 26. קיפוח גלוקוז חמצן (OGD) הוא השיטה כרגע בשימוש לאיסכמיה מודל במבחנה. לפיכך, חשיפת תאים לOGD כעלבון משנית לתאים לאחר מתיחה יכולה לחקות את השכיחות של TBI אחרי איסכמיה. לפיכך, כדי לשפר את המודל הנוכחי שלנו במבחנה של TBI ודפוס זה קרוב ככל האפשר לTBI בפועל כפי שהוא מתרחש in vivo, בעתיד אנחנו גם יעסיקו OGD בשילוב עם פציעת מתיחה.

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא אחד הגורמים המובילים למוות בעולם. כ -10 מיליון בני אדם מושפעים מדי שנה על ידי שהופך אותו TBI בריאותי משמעותי והבעיה רפואית 1. בשל כך, שונים in vivo ו במודלים חוץ גופית של TBI כבר הוקם ופותח על מנת ללמוד מנגנוניה 2,3,4. הבנה טובה יותר של TBI יכולה לעזור לשפר את הטיפול בחולה ולהפחית את התמותה המשויכת, תחלואה, ועלות. מודלים רבים לפגיעה מוחית אשר מנצלים גם in vivo ו במבחנת שיטות קיימים. במודלי vivo יכול לחקות את האירוע הממשי של פגיעת הראש. עם זאת, בשל מורכבותו של מצב vivo, נגישות לרקמות של עניין הופך להיות מוגבל 2. בהבנה את התגובה הפיזיולוגית של תאים בודדים, כתוצאה מפגיעה שנגרמה, חשוב שהתאים מבודדים מההשפעות המערכתיות אשרעלול לעכב או לשנות את תגובת 5 פרט. מסיבה זו, מודלים סלולריים של טראומה מספקים יתרונות חשובים על פני מודלים של בעלי חיים מאז הסביבה מכאנית של התאים ניתן לשלוט בדיוק 6. במערכות מבחנה שמעסיקות את השימוש של עומס מכאני לתאים או רקמות כדי לקבוע שינויים הנגרמים על ידי שיטה כזו של פגיעה פותחו. לדוגמה, שיטה ללימוד ההשפעה של פגיעה מכאנית לתאים כבר נקבעה להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה ותאי האנדותל אבי העורקים 7,8,9. במודל טראומת מבחנה שהוקם לחקר מכרסמים ותגובתיות astrocyte אנושי 10 הועסקה מכשיר שליטה בלחץ זהה למה שאנו משתמשים למודל שלנו. אותה השיטה יושמה כדי לגרום ניזק ע&quot;י מתיחה בתאי עכבר מוח microvessel אנדותל (bEnd3) 11 ו נוירונים בקליפת המוח 12,13 וכן, endoth מוחיןתאי elial מחזירונים יילוד 14. מכשיר deforms התחתון של התרבות היטב וכך לייצר מתיחת פגיעה מכאנית 10. היא גורמת פגיעה על תאים בתרבית על ידי היישום של לחץ אוויר מעל לתאים. לחץ זה יכול להסיט את הקרום שעליו התאים גדלים, ובכך מותח את התאים. דרגות שונות של מתיחה (כלומר &quot;נמוך,&quot; מתון &quot;, או&quot; חמור &quot;) יכולות להיות מושגת על ידי קביעת משך דופק לחץ האוויר ועצמת בהתאם. שיטה זו של פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר בקורלציה עם פגיעה טראומטית בvivo 7. יתר על כן , שיטה זו של פציעה מאפשרת שליטה המדויקת של הסביבה תאית והוא יכול בקלות להיות מועתק. למרות שגישה דומה הייתה בשימוש כבר הרבה סוגי תאים אחרים במוח כולל bEnd3, המודל שלנו הוא של יתרון בכך שהוא עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבריים (cEND) שנוצרובמעבדה שלנו. קו זה תא הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB). בתרביות תאים במבחנה המשמשות כמודלים BBB צריך להחזיק מאפיינים שיאפשר להם לשמש כמסך חדירות. קריטריון חשוב אחד במודל תאים במבחנה להיות מנבא של חדירות BBB הוא שזה צריך להחזיק ארכיטקטורת תא פיזיולוגית מציאותית 15. למרות bEnd3 תאים ייחודיים להציג ציר דמוי קשקש מורפולוגיה בתרבות 16, הם מפגינים התנהגות המוךפו&quot;גנטי סדירה במבחנה שבו הם יוצרים חללים דמויי ציסטה ולא את המבנים צינורי הרגילים בפיברין ג&#39;לי 17. יתר על כן, כאשר התאים הוזרקו לעכברים עובריים ואת הרך הנולד, הם מושרה במהירות צמיחה גידולים קטלניים לעכברים עובריים, אך לא בעכברי בני יומם וצעירים. הוא הציע ובכך שאחד או יותר מתהליכים המסדירים את צמיחה נורמלית, הגירה, ובידול האנדותל שונו או eliminatאד בקו תא זה 18. מצד השני, הערכה מורפולוגית, immunocytochemical של מדידות שטף האנדותל וביטוי סמן BBB, bioelectric, ולהוכיח כי paracellular BBB המודל cEND שלנו היא אכן מודל מתאים של BBB 19. האנדותל מוח in vivo מאופיין בחדירות הדוקות ביותר עם ​​התנגדות חשמלית טרנס אנדותל (TEER) נעה בין 2,000-5,000 Ωcm 2. ללימודים של נכסי מכשול microvasculature מוח לתרופות, יש לשקול מגבילי paracellular ואטימות של התאים. ברוב תאי אנדותל נימי במוח (BCEC), זה לא נשמר כTEER תערוכת התאים הנע 50-100 Ωcm 2 20. BEnd3 שורת תאי אנדותל המוח הונצח מייצר ערכי TEER של לא יותר מ -60 Ωcm 2 15. בניגוד התמיינות של תאי cEND עם מדיום המכיל סרום מופחת תצוגהערכים הנעים TEER 300-500 Ωcm 2 19,21. עד כה, במודלים חוץ גופית של פגיעת מתיחה בתאי האנדותל במוח בתרבית הם נדירים. לפיכך, במודל חוץ גופית לטראומה בגלל פציעת מתיחה באמצעות תאי מוח אנדותל בתרבית המשמשים כמודל של BBB עשוי להיות שימושית. בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל במבחנה שיכול לחקות את ההשפעה בפועל שתאי מוח, תאי אנדותל כלי הדם במוח במיוחד של BBB, מקבלים במהלך TBI. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהסכום של פגיעה מוחל על התאים, כמו גם ניתן לשלוט בקלות בסביבה תאית באופן מדויק המאפשר שחזור קל של ניסיוני ההגדרה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

עקב אירוע התמותה הגבוהה הביא על ידי פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שיטות שתאפשר אחד כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מעורבים בזה הם שימושיים לטיפול. ישנן גם in vivo ו במבחנת שיטות זמינות למטרה זו. במודלי vivo יכולים לחקות פגיעת ראש בפועל כפי שהוא מתרחש במהלך TBI. עם זאת, בטכניקות vivo לא יכול להיות מנוצל ללימודים ברמת הפיסיולוגיה התא. לפיכך, בשיטות מבחנה הם יתרון נוסף למטרה זו מכיוון שהם מספקים גישה קלה יותר לתאים והסביבה תאית למניפולציה. הפרוטוקול שלנו מציג במודל חוץ גופית של פציעת מתיחה באמצעות TBI בתאי אנדותל כלי הדם במוח. הוא מנצל את לחץ המופעל על התאים בתרבית בבארות גמישות תחתיות. הלחץ המופעל יכול בקלות להיות בשליטה ויכול לייצר פגיעה שנעה בין נמוך לחמורים. העכבריתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) שנוצרו במעבדה שלנו הוא מודל מתאים היטב למחסום דם המוח (BBB) ​​ובכך מתן יתרון למערכות אחרות המעסיקות בטכניקה דומה. בנוסף, בשל הפשטות של השיטה, משוכפלים להגדיר קופצים ניסיוני בקלות. לכן, מודל זה יכול לשמש בחקר המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים בTBI בBBB.

תאים בתרבית על קולגן אני precoated תרבות צלחות תחתיות 6 גם גמישות (57.75 ס&quot;מ 2) נחשפו לדרגות שונות של פציעת מתיחה באמצעות המכשיר הסלולרי של האלונקה. לאחר חשיפת התאים לפגיעה, הם נבדקו תחת המיקרוסקופ לתופעות של פגיעה הנגרמת מתיחה למורפולוגיה של תאים. זה היה ציין כי מידה כמו גדולה יותר של קטע הייתה מוחלת על התאים במידה רבה יותר של עיוות תא גם יכולה להיבחן (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 1 א, תאי בקרה שלא היו נתונים לפגיעה מופיעים תאי אנדותל כלי דם במוח כצורה באופן קבוע (cEND) ללא כל אינדיקציה לנפיחות תא או עיוות. כאשר פציעת מתיחה יושמה (איורים 1 ב-D), עיוות יכולה להיבחן תחת מיקרוסקופ האור. לאחר מתיחת התאים קשה עם לחץ שיא בין 3.5-4.5 PSI, תאי cEND הופיעו חזר בו במידה ניכרת, נפוח ומעוות עם לא<html> מרחבים אינטר מסוגלים. בנוסף, ספיגה של כדאיות כתם (ריכוז 100 ננומטר סופי) עלתה גם היא כמידת פגיעת מתיחה הוגדלה (איור 2). הכדאיות בשימוש הוא כתם צבע impermeant לתאים בריאים שהופך permeant כאשר שלמות קרום הפלזמה של תאים נפגעת. הצבע לא נכלל רוב תאי הבקרה, ולכן, רק מעטים מהתאים היו מוכתמים (איור 2 א), בהשוואה לתאים מתוחים (איורים 2 ב-D). יותר תאים fluoresced ירוקים עם מידה מוגברת של פגיעה במתיחה. כסמן ביוכימי של פגיעה, שחרורו של קטט דהידרוגנאז (LDH) אנזים נבחן גם על פי הוראות יצרן. איור 3 מראה כי פציעת מתיחת תא הגדלת נגרמה שחרור הגדלת LDH. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; איור 1. בחינת אור מיקרוסקופית של תאים נורמלים לעומת פצועים. () monolayer תא מחוברות unstretched רגילה ארזה istightly והמוארכת. כאשר תאים נמתחו על ידי יישום לחץ דופק שיא של 1.8-2.0 PSI (מתיחה נמוכה, כלומר) הם מופיעים פחות קומפקטי, מרחבים מסומנים על ידי חצים (ב &#39;). כאשר התאים שנפצעו באורח בינוני עם דופק שיא לחץ 2.5-3.0, חלקם הופיעו נפוח ומעוות (C). התאים הופכים חזרו עם מתיחה חמורה של 3.5-4.5 psi, כפי שצוין על ידי חץ (ד &#39;). ההגדלה 100x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. פלואורידבדיקה מיקרוסקופית של escence תאים נורמלים לעומת תאים פגועים טופלו 2hr כתם כדאיות לאחר פציעה: תאי בקרת unstretched BD: תאים מתוחים (B - נמוך, C - מתון, D - חמור).... ההגדלה 100x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. שחרור חומצת החלב דהידרוגנז LDH () אנזים לsupernatant לאחר פציעת מתיחה. LDH משתחררים למדיום התרבות נמדד במרווחי זמן שונים לאחר פגיעה הנגרמת מתיחה. LDH בא לידי ביטוי כאחוז מסך releasable LDH LDH (בתקשורת בתוספת תאים). ערכים הם ± SEM. N עבור כל נקודת זמן הוא 5, פרט ל0 HR Value נתון למתיחה חמורה כאשר n = 3. שחרור LDH מהתאים שהיו נתונים למתיחה נמוכה ובינונית לא היה שונה באופן משמעותי מזו של פקדי unstretched ואחד מהשני. תאים שנמתחו קשות שחררו כמות גדולה יותר באופן משמעותי של LDH בהשוואה לכל דוגמאות אחרות, למעט המדגם נמתח במתינות בשעה 1. (P &lt;0.05, גורם אחד ניתוח שונה, שיטה הולם-Sidak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> טבלת מס &#39;1. מדריך ליצירת דרגות שונות של פציעת מתיחה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> לחץ רגולטור </th><th> לחץ שיא </th><th> מידת הפגיעה </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1.2-1.5 PSI </td><td> &lt;נמוך </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1.8-2.0 PSI </td><td> נמוך </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2.5-3.0 PSI </td><td> למתן </tד&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3.5-4.5 PSI </td><td> חמור </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4.8-6.0 PSI </td><td> &gt; חמור </td></tr></tbody></table>

Watch this Scientific Journal Video about Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier at JoVE.com

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) ​​דגם בעל תכונות שמהוות מודל לגיטימי של BBB להקים במודל TBI מבחנה.

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K Views.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) ​​דגם בעל תכונ...

Video: Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

MRI-מודרך שיבוש של מחסום דם מוח באמצעות אולטרסאונד ממוקד Transcranial מודל עכברים

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

מודל עכברים של שיבוש מחסום דם מוח כדי לאפשר ממוקד Therapeutics Neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

השפעת דגם קליפת המוח מבוקר לפגיעה מוחית טראומטית

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

דגם רומן של טראומטית קל פגיעה מוחית לחולדות לנוער

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

חמצן גלוקוז קיפוח וReoxygenation כ<em&gt; במבחנה</em&gt; איסכמיה reperfusion פציעת דגם לחוסר תפקוד מחסום דם-המוח לומד

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between experimental animals. Several contusive SCI models have been developed to produce injuries using different mechanisms. The severity of the SCI is based on the height that a given weight is dropped, the injury force, or the spinal cord displacement. In the current study, we introduce a novel mouse contusive SCI device, the Louisville Injury System Apparatus (LISA) impactor, which can create a displacement-based SCI with high injury velocity and accuracy. This system utilizes laser distance sensors combined with advanced software to produce graded and highly-reproducible injuries. We performed a contusive SCI at the 10th thoracic vertebral (T10) level in mice to demonstrate the step-by-step procedure. The model can also be applied to the cervical and lumbar spinal levels.

We introduce a tissue displacement-based contusive spinal cord injury model that can produce a consistent contusive spinal cord injury in adult mice.

תולעת רקמות מבוססי חוט השדרה פגיעה בעמוד השדרה דגם עכברים

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

דגם עכבר של פגיעה בודדת וחזרה קלה של פגיעה מוחית טראומטית

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...