המחברים מבקשים להודות למייקל אנדרסון להקמה במעבדה לי שיטות המקובלות אלה לחקר תאי זרע עם ייעוץ מקצועי מקארן חאלס. ה &#39;עוד וי&#39; אקיאמה-Oda סיפקו בנדיבות γ-טובולין-GFP לטוס מניות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01 לLAL (GM074044).

1. Dissection אשכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים בבקבוק או בקבוקון באמצעות זרם של CO 2 ולהעביר למשטח לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין זבובים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מכחול קטן, ולאסוף מספר מתאים (תלוי בניסוי) של הזכרים דרוזופילה של גנוטיפים הרצויים. זכרים צעירים (בן 0-2 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים המוקדמים של תאי זרע (למשל spermatogonia, spermatocytes, וspermatids פוסט meiotic המוקדם), ואילו גברים מעט מבוגרים (בן 2-5 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים הסופיים של תאי זרע (בפרט, להבשיל זרע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להסיר את הכנפיים מלטוס (כדי למנוע מהזבובים צפים בנוזל בזמן נתיחה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 500 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (130 mM NaCl, 7 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 3 מ&quot;מ לאא 2 PO 4; PBS) בירידה לצלחת לנתיחה מצופה סיליקון עלרקע שחור. תמיסות מימיות אחרות שימשו בהצלחה לאשכים לנתיחה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודת המלקחיים לכיוון הקדמי של הזבוב, לתפוס אותו על ידי בית החזה, ולטבול אותו בטיפת PBS. במהלך הצגה מבעד למיקרוסקופ לנתח, להשתמש בזוג נוסף של מלקחיים לתפוס ולמשוך את אברי המין החיצוניים (מבנה בצבע חום כהה הממוקם בקצה האחורי של בטן הגחון) בדיעבד עד שהוא מתנתק מהבטן. ברוב המקרים, האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטת אבזר יוסרו מהבטן יחד עם אברי המין החיצוניים, אם לא, להכניס זוג אחד של מלקחיים לתוך הבטן ולהקניט את האשכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשכים נפרדים מבלוטת אבזר ואברי מין חיצוני באמצעות שני זוגות מלקחיים בירידת PBS (איור 2). אשכים wild-type בקלות להבחין בין רקמות שכנות הלבנות לפי צבעם הצהוב. פנה מייד לצעד 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד אשכים מזכרי pharate (i<html> .. הדואר הסגור בתוך המקרה גלמי), צריך קודם לבצע צעד נוסף שכרוך בהסרה לטוס מהמקרה גלמי; שלב זה כבר תואר בעבר במקום אחר ביום 31. להמשיך עם נתיחה כלאשכים למבוגרים מתחילים בצעד 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד אשכים מזכרי זחל, לבצע שינוי של פרוטוקול לבידוד השחלות זחל דרוזופילה 32. בקצרה, זחלי זכר ניתן להבחין בין זחלים נשיים על ידי הנוכחות של זוג המבנים גדולים, ברורים, סגלגלים (אשכים זחל) משובצים בשליש האחורי של השומן בגוף. כדי לבודד אשכים זחל, באופן חלקי לפשוט את העור לפתוח את זחל הזכר לבודד את האשכים ושומן הגוף סביב מהבטן כפי שתואר עבור הבידוד של השחלות זחל. פנה מייד לשלב 2 של הפרוטוקול המתואר במסמך זה; האשכים יכולים להיות מאוחר יותר הוסרו מהגוף השומן רק לפני ההרכבה (שלבים 2.3 או 3.14) כפי שתואר לשחלות 32. </li></ol>ss = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. לדוגמא הכנה והדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים למקום בעדינות 2-3 זוגות של אשכים בירידה של 4-5 מיליליטר של PBS על להחליק את מכסה זכוכית מרובע. שים לב שהיחס בין מספר אשכים לPBS עוצמת שמע עשוי צריך להיות מותאם: יותר מדי נוזלים ימנעו תאים מלהתפשט כראוי כאשר נמעכו, ואילו נוזל מעט מדי יגרום לתאים להתפוצץ כאשר מעוך. אופציונאלי: כיסוי siliconized שימוש מחליק כדי למזער את ההיצמדות של רקמות כדי לכסות להחליק בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג המלקחיים לקרוע פתוח כל אשך בעמדה מתאימה כדי למקסם את נוכחותם של סוגי התאים הרצויים בתאי מין בהכנה (שים לב שהתוכן של האשך תהיה בעיקר יציאה מהאזור הקרוע לשקופית במעיכה צעד.) כדי להעשיר לspermatogonia וspermatocytes, לקרוע לפתוח את האשך סמוך לקצה הקודקוד שלה (ברמה 1, איור 2). כדי להעשיר לspermatocytes וspermatids, דמעה לפתוח את האשך בקופהition מעט בסיס לרמת 1 (רמה 2, איור 2). כדי להעשיר את תאים בתאי מין בוגרים יותר, קורע את האשך קרוב יותר למקום שבי העקמומיות מתחילה (רמה 3, תרשים 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות שקופית מיקרוסקופ זכוכית על להחליק את המכסה למחוץ את האשכים; לא להפעיל לחץ באופן ידני כמו המשקל של להחליק את המכסה בלבד מספיק כדי להשיג מדגם מעוך כמו שצריך. נסה להימנע מלכידת בועות אוויר. אופציונאלי: מיקרוסקופ השתמש פולי-L-ליזין מצופה מחליק לקדם היצמדות של רקמות כדי להחליק בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתכשיר באופן מיידי (באופן אידיאלי בתוך 15 דקות של הכנה) להתבונן תאי חיים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד; לזבובים מהונדסים עם ביטוי של חלבונים מתויגים fluorescently באשכים, ניתן לבדוק תאי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב זה. לחלופין, להמשיך עם קיבעון ומכתים נוגדן (פרוטוקול 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פתיל את נוזלי עודפים מתחת coverslip באמצעות ניקוי wipe לאפשר השטחת ההכנה עד תאי הנבט הם בבירור בפוקוס. </li></ol> 3. פורמלדהיד קיבוע ונוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד להקפיא כל שקופית המכילה אשכים מעוכים (מפרוטוקול 2) באמצעות מלקחי מתכת כדי לטבול אותו בקצרה בחנקן נוזלי (עד חנקן נוזלי מפסיק מבעבע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תלוש לכסות באופן מיידי באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למדף זכוכית שקופית prechilled מלא באתנול 95% קרים כקרח (הכיתה spectrophotometric, נטול מתנול). חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות בפורמלין 4% ב-PBS בתוספת 0.1% טריטון X-100 (PBS-T). לאחסן בטמפרטורת חדר למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות PBS. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 1x. לבצע את כל שוטף על ידי השלכת פתרון במעמד שקופיות זכוכית ( <em&gt; כלומר. על ידי שפיכתו החוצה) והחלפה עם פתרון טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את PBS ולטבול את השקופיות ב-PBS-T ל30 דקות בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת צעד (לא חובה): לטבול את השקופיות ב PBS בתוספת BSA 1% ל45 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעט מחסום הידרופובי לצייר עיגול בשקופית סביב רקמה מעוכה (נראית בקלות בעין) על מנת להגביל את פתרונות הנוגדנים (הוסיפו בצעדי 3.9 ו3.11). הרקמות צריכה להישמר לחה בכל העת בעת ביצוע immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן ראשוני (בדילול מלא PBS-T, 1:400 ל1:50, בהתאם לנוגדנים) לרקמה בתוך המעגל. אם החסימה בוצעה, לדלל נוגדן ראשוני ב-PBS-T בתוספת BSA 1%. נוגדן אנטי גמא טובולין (לצביעת centrosomes באיור 4) היה מדולל 1:100. דגירה בתא לח, כהה (קופסא פלסטיק סגורה לדוגמא.במגבות לחות נייר) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר 3x. אם החסימה בוצעה, לשטוף פעמים PBS-T ופעם אחת ב-PBS (5 דקות בטמפרטורת חדר כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן fluorophore מצומדות המשני (בדילול 1:400 ב-PBS) לרקמות דגירה בחושך במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 30-40 מיליליטר של תמיסת DAPI (0.2 מ&quot;ג / מיליליטר PBS) לרקמה בתוך המעגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות להחליק את מכסה זכוכית על הרקמות, לטפל כדי למנוע לכידת בועות אוויר. אם בועות האוויר אמורות להופיע, לנוע בזהירות סביב להחליק את המכסה מבלי להרוס את הקישואים עד שהבועות לברוח מן הצדדים של להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ניקוי לנגב למחוק DAPI העודף מהקצוות של השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום להחליק את המכסה לשקופית באמצעות לק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתכשיר זהבתוך 3-4 שעות הבאות כדי להציג תאי immunostained על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור אחסון לטווח ארוך של שקופיות (עד לפחות כמה שבועות), יש להשתמש באמצעי תקשורת קשה הר מבוסס גליצרול עם DAPI, ושקופיות חנות ב -20 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לתקן את הדגימות במתנול במקום פורמלדהיד (תלוי באנטיגן). לאחר שסיים את הפרוטוקול כולו דרך שלב 3.2, לטבול את השקופיות של אשכים מעוכים במתנול 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס ולהמשיך בשלב 3.5 ואילך. </li></ol>

<ol>
	<li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries.">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Drosophila+testes.">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila.">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+staining+of+Drosophila+testes.">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell.">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes.">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li><li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis.">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li><li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology.">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li><li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+male+Drosophila.">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li><li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage:+Partners+behind+the+scenes.">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li><li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster:+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis.">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li><li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males.">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li><li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster.">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tokens+of+love:+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products.">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li><li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster.">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li><li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila:+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene.">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li><li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+twinstar,+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin/ADF+homologue,+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis.">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li><li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis.">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li><li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis.">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li><li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila.">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries.">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li><li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster.">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li><li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study.">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li><li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes.">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis.">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li><li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes.">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li><li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis.">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות שהאשכים של זבובים פראי מסוג ניתן לזהות בקלות בשל צבעם הצהוב (בניגוד לרקמות שכנות הלבנות), האשכים של זבובים שעברו מוטציה לבנים הם לבנים ולכן לעתים ניתן להתבלבל עם הבטן. זנים מהונדסים ביותר, אשר בדרך כלל ברקע לבן, יש גם אשכים לבנים בגלל גן המיני לבן ש...

האשכים דרוזופילה הם מערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים ביולוגיים רבים, כולל רגולציה של תאי גזע, מיוזה, ופיתוח זרע 13-18. Spermatocytes וצירי meiotic שלהם הם גדולים, ולכן נוחים לניתוח ציטולוגית, ומחסומי מחזור התא רגועים במהלך spermatogenesis להקל על המחקר של מוטציות בגנים מחזור התא. ניתן להבחין בסוגים שונים של תאים בהתקדמות הורה לאורכו של האשכים, ושיבוש כלשהו בתאי זרע יכול להוביל לשינויים בהסדר הכולל הזה. תכונות אלה בשילוב עם כלים גנטיים דרוזופילה הקלו ניתוח מוטאציות של תאי הזרע 21-23. השלבים של spermatogenesis דרוזופילה כבר מוגדרים היטב. תאים בתאי מין שמתפתחים באופן סינכרוני בתוך ציסטות התקדמות רציפות בשלבים של תאי זרע לאורכו של האשך. במהלך בוה המיטוטי וחטיבות meiotic של תאי נבט הזכר, cytokinesis מתרחש באופן חלקי כך שתאי הבת להישאר מחוברים על ידי גשרי cytoplasmic המכונים תעלות טבעת (איור 1). קצה הקודקוד של האשך מכיל אוכלוסייה של תאי גזע בתאי מין שמעוררת תאי spermatogonial, אשר עוברים ארבע חטיבות המיטוטי עם cytokinesis שלם כדי לייצר ציסטות 16 תאים של spermatocytes העיקרי. לאחר שלב S premeiotic, spermatocytes העיקרי להיכנס G2, תקופת צמיחה ממושכת של ~ 90 שעות שבמהלכו עליות נפח סלולארי ~ פי 25. התקדמות דרכי מיוזה ומיוזה השנייה תוצאות בהיווצרות ציסטות 32 תא של spermatocytes המשני וציסטות 64 תא של spermatids הפלואידים, בהתאמה. Spermatids לא בשלה, העגול עובר שיפוץ נרחב סלולארי כדי ליצור זרע בוגרים. תאים שלאחר meiotic, בפרט הצרורות של מתארך וspermatids הבוגר, תופסים הרבה הנפח של האשך. Tהוא הובלה מוצלחת של זרע פונקציונלי לזבובים נשיים דורשת תיאום בין החלקים השונים של מערכת הרבייה הגברית, שמורכבת מכמה מבני זיווג (האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטות עזר) ותעלת שופכה אחד (איור 2). זרע מיוצר בתוך האשכים ומאוחסן בתוך שלפוחית ​​הזרע עד הזדווגות 24. בלוטות האבזר מכילות תאי הפרשה המייצרים את נוזל זרע. הזרע נודד משלפוחית ​​הזרע מעורבב עם נוזל זרע בתוך צינור השופכה, אשר מחובר לשתי שלפוחית ​​הזרע ובלוטות האבזר. תערובת זו של זרע ונוזל זרע נשאבת סופו של דבר מחוץ לזכר לתוך הנרתיק של הנקבה לעוף בנורת השפיכה ממוקמת בקצה האחורי של 25 בטן הגברית. חלבונים בתוך נוזל הזרע הם חיוניים לאחסון ממושך של זרע בתוך איברים מתמחים המכונים spermathecae בנציגמערכת roductive של נקבות דרוזופילה 26. שיטות מצוינות לבידודה של אשכים דרוזופילה ויזואליזציה של תאים בשלבים שונים של תאי זרע זמינות בספרות המדעית 3-12. אנחנו בזאת להוסיף לגוף זה של ידע על ידי הצגת דוגמאות של פרוטוקולים אלה עם הפגנת וידאו נלווית. הפרוטוקול להכנת דגימות אשכים חיים למיקרוסקופ שלב בניגוד מבוסס על שיטה שתוארה לעיל 27. הפרוטוקול לקיבעון פורמלדהיד וimmunostaining של אשכים מבוססים גם על שיטה שתוארה לעיל 28. הגישות המתוארות כאן נעשו שימוש במחקרים רבים של תאי זרע דרוזופילה (לדוגמא, על מנת להעריך את התפקידים של dynein, מנוע microtubule מינוס מכוון סופו של דבר בתאי זרע דרוזופילה). בנוסף לפרוטוקולים הבסיסיים, הצעות ניתנות לvaryinגרם לנתיחה על מנת להעשיר לspermatogonia, spermatocytes, או זרע בוגרים. שיטות שונות לעיבוד האשכים כך שציסטות או יישארו ללא שינוי או הם שיבשו במידת הצורך מתוארים. יתרון בשימוש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל הוא כי בהשוואה לביציות דרוזופילה ועוברים, נוגדנים וצבעים יכולים בקלות לחדור לתאים הבאים פיזורם מהאשכים, ושלבי כביסה פחות נדרשים, ולכן ניתן לבצע פרוטוקולים באופן יחסי זמן קצר.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Clear nail protector</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Use according to manufacturer&#039;s directions to siliconize cover slips</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delicate task wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jar, screw cap</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Single frosted microscope slides</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Optional (to replace untreated microscope slides )</td></tr><tr><td>Square cover glass</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Pattern 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS stereoscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objective</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of drosophila testes

תסיסנית היא מערכת מודל רבת עוצמה שכבר בשימוש נרחב על מנת להבהיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. לדוגמא, מחקרים של שתי נשים וקווים נבט זכר של דרוזופילה תרמו רב להבנה הנוכחית של מיוזה כמו גם ביולוגיה של תאי גזע. פרוטוקולים מצוינים זמינים בספרות לבידוד וההדמיה של השחלות ואשכים דרוזופילה 3-12. בזאת, שיטות לנתיחה והכנת האשכים דרוזופילה ניתוח מיקרוסקופי מתוארות בהפגנת וידאו נלווית. פרוטוקול לבידוד אשכים מהבטן של זכרים בוגרים והכנת שקופיות של רקמת חיה לניתוח על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד, כמו גם פרוטוקול לתיקון וimmunostaining אשכים לניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוצגים. ניתן ליישם את הטכניקות הללו באפיון של מוטציות דרוזופילה כי תערוכת דefects בתאי זרע, כמו גם בהדמיה של מגויר subcellular של חלבונים.

דוגמא של זוג גזור כהלכה של איברי הרבייה של גבר דרוזופילה מוצגת באיור 2 א. אשכים הוסרו מהבטן של זבוב זכר הבוגר מצורפים בדרך כלל לצינור השופכה (חום, איור 2 א &#39;) וזוג בלוטות אבזר (הירוק, איור 2 א&#39;) באמצעות זוג שלפוחית ​​זרע (הכחול, איו?...

Watch this Scientific Journal Video about Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes at JoVE.com

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

26.0K Views.  Vanderbilt University Medical Center.  שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה. 

Video: Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Developmental Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

הכלאה פלואורסצנטית באתרו לחקר זרע יתושים

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

מחבר זרקור: הכלאה פלואורסצנטית באתרו לחקר ספרמטוגנזה ביתוש אנופלס  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס