Name: cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of drosophila testes
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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Los autores desean agradecer a Michael Anderson para establecer en el laboratorio Lee estos métodos aceptados para el estudio de la espermatogénesis con asesoramiento de expertos de Karen Hales. H. Oda y Y. Akiyama-AOD ofrecida generosamente la γ-tubulina-GFP de stock volar. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH R01 a LAL (GM074044).

1. Testículos Disección <ol><li> Anestesie moscas en una botella o frasco con una corriente de CO 2 y la transferencia a una almohadilla de mosca. </li><li> Ordenar moscas bajo un microscopio de disección usando un pequeño pincel, y recoger un número apropiado (dependiendo del experimento) de los machos de Drosophila de los genotipos deseados. Los hombres jóvenes (0-2 días de edad) son ideales para el examen de las células a través de las primeras etapas de la espermatogénesis (por ejemplo espermatogonias, espermatocitos y espermátidas tempranas post-meióticas), mientras que los machos ligeramente mayores (2-5 días de edad) son ideales para el examen de las células en las últimas etapas de la espermatogénesis (en particular, maduran los espermatozoides). </li><li> Use unas pinzas para quitar las alas de cada vuelo (para evitar que las moscas que flotan en el líquido durante la disección). </li><li> Añadir ~ 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (NaCl 130 mM, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) en una gota a una disección plato cubierto con silicona porun fondo negro. Otras soluciones acuosas se han utilizado con éxito para la disección testículos 3. </li><li> Punto fórceps hacia la parte anterior de la mosca, agarrarlo por el tórax, y sumergirlo en la gota de PBS. Mientras observa a través del microscopio de disección, utilice otro par de pinzas para agarrar y tirar de los genitales externos (estructura de color marrón oscuro situado en el extremo posterior del abdomen ventral) posteriormente hasta que se separe del abdomen. En la mayoría de los casos, los testículos, las vesículas seminales y las glándulas accesorias serán removidos del abdomen, junto con los órganos genitales externos, si fuera necesario, introduzca un solo par de pinzas en el abdomen y se burlan de los testículos. </li><li> Separe los testículos y las glándulas accesorias genitales externos utilizando dos pares de pinzas en la caída de PBS (Figura 2). Testículos de tipo salvaje se distinguen fácilmente de los tejidos blancos vecinos por su color amarillo. Proceda inmediatamente al paso 2. </li><li> Para aislar los testículos de los machos pharate (i.. E incluido dentro de la caja de pupa), un paso adicional primero se debe realizar que implica la eliminación de la marcha de la caja de pupa; este paso ha sido descrito previamente en otro lugar 31. Proceda con la disección como para los testículos adultos a partir del paso 1.2. </li><li> Para aislar los testículos de los machos de larvas, lleve a cabo una modificación de un protocolo para el aislamiento de ovarios de larvas de Drosophila 32. Brevemente, las larvas macho se puede distinguir de larvas hembra por la presencia de un par de estructuras grandes, claras ovales (testículos de larvas) incrustados en el tercio posterior de la grasa corporal. Para aislar los testículos de larvas, desollar parcialmente abierta la larva macho para aislar los testículos y el cuerpo de grasa que rodea el abdomen como se describe para el aislamiento de ovarios de larvas. Proceder inmediatamente al paso 2 del protocolo descrito en el presente documento; los testículos más tarde pueden ser eliminados del cuerpo grasa justo antes de montar (pasos 2.3 o 3.14) como se describió para los ovarios 32. </li></ol><ol><li> Use un par de pinzas para colocar suavemente 2-3 pares de testículos en una gota de 4-5 ml de PBS en una cubierta de vidrio cuadrado deslizamiento. Tenga en cuenta que puede necesitar la relación del número testículos al volumen de PBS para ajustar: el exceso de líquido evitar que las células se propaguen correctamente cuando aplastado, mientras que demasiado poco líquido hará que las células revienten cuando aplastada. Opcional: Uso cubierta siliconada desliza para minimizar la adherencia de tejido para cubrir deslizamiento en el paso 3.2. </li><li> Use un par de pinzas para rasgar cada testículo en una posición apropiada para maximizar la presencia de los tipos de células de la línea germinal deseadas en la preparación (tenga en cuenta que los contenidos de los testículos en su mayoría será la salida de la región desgarrada sobre el portaobjetos durante el aplastamiento paso.) Para enriquecer espermatogonias y espermatocitos, rasgar el testículo adyacente a su extremo apical (nivel 1, la Figura 2B). Para enriquecer espermatocitos y espermátidas, desgarro abrir los testículos a un position ligeramente basal al nivel 1 (nivel 2, la Figura 2B). Para enriquecer las células germinales más maduras, rasgar los testículos más cerca de donde comienza la curvatura (nivel 3, Figura 2B). </li><li> Con suavidad, coloque un portaobjetos de vidrio sobre la hoja de la cubierta para aplastar los testículos; no presione manualmente como el peso de la hoja de la cubierta es suficiente para obtener una muestra adecuada aplastada. Trate de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Opcional: Uso revestido de poli-L-lisina portaobjetos para promover la adhesión de tejido se deslice en el paso 3.2. </li><li> Utilice la preparación inmediata (idealmente dentro de 15 minutos de preparación) para observar células vivas por microscopía de contraste de fase, porque las moscas transgénicas con expresión de las proteínas marcadas con fluorescencia en los testículos, las células vivas pueden ser examinadas por microscopía de fluorescencia en este paso. Por otra parte, proceder a la fijación y la tinción de anticuerpos (Protocolo n º 3). </li><li> Absorber suavemente el exceso de líquido bajo el cubreobjetos usando una limpieza wipe para permitir que el aplanamiento de la preparación hasta que las células germinales son claramente enfocado. </li></ol> 3. Formaldehído La fijación y la tinción de anticuerpos <ol><li> Snap congelar cada diapositiva que contiene los testículos aplastados (del Protocolo 2) usando un par de pinzas de metal para sumergirlo brevemente en nitrógeno líquido (nitrógeno líquido hasta que se detiene el burbujeo). </li><li> Retire la hoja de la cubierta inmediatamente usando una cuchilla de afeitar. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio preenfriado lleno de etanol al 95% enfriado con hielo (grado espectrofotométrico, exento de metanol). Almacenar a -20 ° C durante 10 min. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas a un estante de portaobjetos de vidrio lleno con 4% de formaldehído en PBS más 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Guarde a temperatura ambiente durante 7 min. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio lleno de PBS. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 1x. Realice todos los lavados descartando la solución en la parrilla corrediza de vidrio ( <em&gt; Ie. vertiendo hacia fuera) y la sustitución con solución fresca. </li><li> Desechar el PBS y sumergir los portaobjetos en PBS-T durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x. </li><li> El bloqueo de paso (opcional): Sumergir los portaobjetos en PBS más 1% de BSA durante 45 min a temperatura ambiente. </li><li> Use una barrera hidrofóbica lápiz para dibujar un círculo en la diapositiva alrededor del tejido aplastado (fácilmente visible a simple vista) con el fin de limitar las soluciones de anticuerpos (agregado en los pasos 3,9 y 3,11). El tejido debe mantenerse húmedo en todo momento durante la realización de la inmunotinción. </li><li> Añadir 30-40 ml de anticuerpo primario (diluido en PBS-T, 1:400 a 1:50, dependiendo de anticuerpo) en el tejido dentro del círculo. Si se ha realizado el bloqueo, diluir anticuerpo primario en PBS-T más 1% de BSA. El anticuerpo anti-gamma-tubulina (para la tinción de los centrosomas en la Figura 4) se diluyó 1:100. Incubar en una cámara oscura húmeda (por ejemplo. Caja de plástico cerradacon toallas húmedas de papel) durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS durante 5 min a temperatura de habitación 3x. Si se realizó el bloqueo, lavar dos veces en PBS-T y una vez en PBS (5 min a temperatura ambiente, cada una). </li><li> Añadir 30-40 ml de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (diluido 1:400 en PBS) a los tejidos y se incuba en la oscuridad durante 1-2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x. </li><li> Añadir 30-40 ml de solución de DAPI (0,2 mg / ml en PBS) para el tejido dentro del círculo. </li><li> Con suavidad, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Si deben aparecer burbujas de aire, mueva con cuidado alrededor de la hoja de la cubierta sin destruir la calabaza hasta que las burbujas se escapan de los lados de la hoja de la cubierta. </li><li> Utilice una toallita de limpieza para borrar el exceso de DAPI de los bordes de la diapositiva. </li><li> Sellar el cubreobjetos a la diapositiva utilizando el esmalte de uñas transparente. </li><li> Utilice esta preparacióndentro de los próximos 3 a 4 horas para ver las células immunostained por microscopía fluorescente. Para el almacenamiento a largo plazo de las diapositivas (hasta por lo menos varias semanas), utilice un medio difícil montar a base de glicerol con DAPI, y almacenar a -20 ˚ diapositivas C. </li><li> Alternativamente, fijar muestras en metanol en lugar de formaldehído (dependiendo del antígeno). Después de completar todo el protocolo hasta el paso 3.2, sumerja las diapositivas de los testículos aplastados en metanol durante 10 minutos a -20 º C y continúe con el paso 3.5 en adelante. </li></ol>

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R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li><li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes.">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li><li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis.">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aunque los testículos de los de tipo salvaje moscas pueden ser fácilmente identificados por su color amarillo (a diferencia de los tejidos blancos vecinos), los testículos de las moscas mutantes blancos son de color blanco y por lo tanto a veces se puede confundir con el intestino. Mayoría de las cepas transgénicas, que son típicamente en un fondo blanco, también tienen testículos blancos porque el gen de mini-blanco que se encuentra en P-elementos no promueve la acumulación ...

Testículos de Drosophila son un sistema modelo ideal para el estudio de muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de células madre, la meiosis, y el desarrollo del esperma 13-18. Los espermatocitos y sus husos meióticos son grandes y por lo tanto, conveniente para el análisis citológico, y los puntos de control del ciclo celular relajado durante la espermatogénesis facilitar el estudio de mutaciones en los genes del ciclo celular. Diferentes tipos de células se pueden observar en la progresión ordenada a lo largo de la longitud de los testículos, y cualquier interrupción de la espermatogénesis pueden conducir a cambios en esta disposición general. Estas características, combinadas con herramientas genéticas Drosophila han facilitado el análisis mutacional de la espermatogénesis 21-23. Las etapas de la espermatogénesis de Drosophila han sido bien definido. Células de la línea germinal que se desarrollan de forma sincrónica dentro de quistes progresan secuencialmente a través de las etapas de la espermatogénesis a lo largo de la longitud de los testículos. Durante boª de la mitosis y divisiones meióticas de las células germinales masculinas, la citocinesis ocurre de forma incompleta de manera que las células hijas permanecen conectadas por puentes citoplásmicos conocidas como canales de anillo (Figura 1). La punta apical del testículo contiene una población de células madre de línea germinal que da lugar a células de espermatogonias, que se someten a cuatro divisiones mitóticas con la citocinesis incompleta para generar quistes 16 de células de espermatocitos primarios. Después de la fase S premeiotic, espermatocitos primarios entran G2, un período de crecimiento prolongado de ~ 90 horas durante el cual aumenta el volumen celular ~ 25 veces. La progresión a través de la meiosis I y la meiosis II resultados en la formación de quistes 32 de células de espermatocitos secundarios y quistes 64 de células de espermátides haploides, respectivamente. Las espermátidas redondas, inmaduros experimentan una amplia remodelación celular para formar espermatozoides maduros. Células post-meióticas, en particular, los haces de alargamiento y espermátidas maduras, ocupan gran parte del volumen de los testículos. Tque el transporte de los espermatozoides éxito funcional a las moscas hembras requiere la coordinación entre las diferentes partes del sistema reproductor masculino, que se compone de varias estructuras apareadas (los testículos, las vesículas seminales y glándulas accesorias) y un único conducto eyaculador (Figura 2). Los espermatozoides se producen en los testículos y se almacenan en las vesículas seminales hasta la cópula 24. Las glándulas accesorias contienen células secretoras que producen el líquido seminal. El esperma de la migración de las vesículas seminales se mezclan con el líquido seminal dentro del conducto eyaculador, que está conectado tanto a las vesículas seminales y las glándulas accesorias. Esta mezcla de espermatozoides y fluido seminal se bombea en última instancia fuera del macho en la vagina de la hembra volar a través de la bombilla de la eyaculación situado en el extremo posterior del macho abdomen 25. Las proteínas en el líquido seminal son esenciales para el almacenamiento prolongado de espermatozoides dentro de los órganos especializados conocidos como espermatecas en el representantetracto roductiva de las hembras de Drosophila 26. Excelente métodos para el aislamiento de los testículos de Drosophila y visualización de células en diversas etapas de la espermatogénesis están disponibles en la literatura científica 3-12. Estamos aquí añadimos a este conjunto de conocimientos mediante la presentación de ejemplos de estos protocolos con una demostración en video que lo acompaña. El protocolo para la preparación de los testículos en vivo muestras para microscopía de contraste de fase se basa en un método descrito previamente 27. El protocolo para la fijación de formaldehído y la inmunotinción de testículos también se basa en un método descrito previamente 28. Los enfoques descritos en el presente documento se han utilizado en muchos estudios de Drosophila espermatogénesis (por ejemplo, para evaluar las funciones de la dineína, un motor de microtúbulos menos de extremo-dirigido, durante la espermatogénesis de Drosophila). Además de los protocolos básicos, se proporcionan sugerencias para varying la disección con el fin de enriquecer las espermatogonias, espermatocitos, o espermatozoide maduro. Diferentes métodos para el procesamiento de los testículos de tal manera que los quistes o bien permanecen intactas o se interrumpen, se describen, según sea necesario. Una ventaja en el uso de testículos de Drosophila como sistema modelo es que, en comparación con los ovocitos y embriones de Drosophila, anticuerpos y colorantes pueden penetrar fácilmente en las células después de su dispersión de los testículos, y se requieren menos etapas de lavado, por lo tanto, los protocolos se pueden realizar en un tiempo relativamente tiempo corto.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Clear nail protector</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Use according to manufacturer&#039;s directions to siliconize cover slips</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delicate task wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jar, screw cap</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Single frosted microscope slides</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Optional (to replace untreated microscope slides )</td></tr><tr><td>Square cover glass</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Pattern 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS stereoscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objective</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of drosophila testes

Drosophila melanogaster es un sistema modelo de gran alcance que ha sido ampliamente utilizado para dilucidar una variedad de procesos biológicos. Por ejemplo, los estudios tanto de la mujer y las líneas germinales masculinas de Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión actual de la meiosis, así como la biología de células madre. Excelente protocolos están disponibles en la literatura para el aislamiento y formación de imágenes de los ovarios y los testículos 3-12 de Drosophila. En la presente memoria, los métodos para la disección y preparación de testículos de Drosophila para el análisis microscópico se describen con una demostración de vídeo adjunto. Un protocolo para el aislamiento de los testículos del abdomen de los hombres adultos y preparar diapositivas de tejido vivo para el análisis por microscopía de contraste de fase, así como un protocolo para la fijación y la inmunotinción testículos para el análisis por microscopía de fluorescencia se presentan. Estas técnicas se pueden aplicar en la caracterización de mutantes de Drosophila que exhiben defects en la espermatogénesis, así como en la visualización de localizaciones subcelulares de las proteínas.

Un ejemplo de un par adecuadamente diseccionado de los órganos reproductores masculinos de Drosophila se muestra en la Figura 2A. Testículos retirados desde el abdomen de la mosca macho adulto están típicamente unidos al conducto eyaculador (marrón, Figura 2A &#39;) y un par de glándulas accesorias (verde, Figura 2A&#39;) a través de un par de vesículas seminales (azul, Figura 2A &#39;) . Para separar los testículos de la mayor parte d...

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Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

26.1K vistas.  Vanderbilt University Medical Center.  Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento. 

Video: Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

El corte delgado de los preparativos de círculo para inmunohistoquímica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Investigación

Biología

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Biología del Desarrollo

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Los centrosomas de imagen en Fly Testículos

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testis y individuales masculinos quistes línea germinal: Disección, Imaging y Tratamiento farmacológico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm development. However, immunolabeling of the whole Drosophila testis is often associated with significant non-uniformity of staining due to antibody penetration. Squashed preparations only partially overcome the problem since it decreases the 3D quality of the analyses. Herein, we describe a whole-mount protocol using NP40 and heptane during fixation together with immunolabeling in liquid media. It preserves the volume suitable for confocal microscopy together with reproducible and reliable labeling. We show different examples of 3D reconstitution of spermatocyte nuclei from confocal sections. The intra- and inter-testes reproducibility allows 3D quantification and comparison of fluorescence between single cells from different genotypes. We used different components of the intranuclear MINT structure (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) as well as two components associated with the nuclear pore complex to illustrate this protocol and its applications on the largest cells of the testis, the S4-S5 spermatocytes.

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

We present here an improved protocol for the whole-mount preparation and immunostaining of Drosophila testes, suitable for confocal microscopy and also allowing reproducible and reliable labeling. We illustrate this protocol by 3D representation and quantification of colocalization experiments on the large S4-S5 spermatocytes.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de

Resumen

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