עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר הלאומית הצרפתית (ANR-14-CE02-0010). אנו מודים ד&quot;ר בנימין שדה וד&quot;ר אלודי Lanet לקריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים למר מישל תרז על עזרתו עם עריכת וידאו.

1. הכנה של 20 עד 50% (w / v) מעברי צבע סוכרוז הערה: הדרגתיים עשויים 4 שכבות של סוכרוז (50%, 35% ו -2 שכבות של 20%) בצינור ultracentrifuge 13.2 מ&quot;ל. מניסיוננו, מזיגת סוכרוז 20% בשתי שכבות נפרדות משפרת באופן משמעותי את איכות הכנות polysome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות המניות. ודא כי כל הפתרונות הם RNAse ו DNAse בחינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח 10X: 400 mM Tris-HCl pH 8.4, 200 מ&quot;מ KCl ו -100 מ&quot;מ MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 פתרון M סוכרוז: עבור 200 מ&quot;ל, לפזר 137 גרם של סוכרוז פתרון 1X מלח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון סוכרוז בסולט פתרון, כמתואר בטבלה 1, להכין הדרגתיים. הכרכים הנתונים הם שש הדרגתיים. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריכוז סוכרוז סופי </td><td> סוכרוז 2M (מ&quot;ל) </td><td> פתרון מלח 1X (מ&quot;ל) </td><td> כרך סופי. (מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8.8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12.9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7.4 </td><td> 17.6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. דילולים של תמיסת סוכרוז להכין שש הדרגתיים. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים שכבות לפי טבלה 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שכבת סוכרוז </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (מ&quot;ל) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1.35 </td></tr></tbody></table> נפח טבלה 2. של תמיסת סוכרוז לכל שכבה. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמזג כל שכבה, לשמור על הצינורות בתוך C -40 ° או מקפיאה -80 מעלות צלזיוס עד הקפאה מוחלטת לפני הוספת ההשכבה סוכרוז הבאה. מקפיא מושגת בדרך כלל לאחר 2 שעות ב -40 מעלות צלזיוס, אבל מחכה כ -6 שעות לפני לשפוך את השכבה הבאה מומלץ. שכבת 20% האחרונה אפשר להקפיא או הוסיפה טרי ביום הניסוי. הערה: הקפאת כל שכבה לפני הוספת הבאה מונעת מכל ערבוב או הפרעה של השכבות. הדרגתיים יכולים להישמר C -40 ° או -80 ° C במקפיא במשך שישה חודשים לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זה כבר לא נעשה, להוסיף את שכבת 20% האחרונים ההדרגתיים ביום הניסוי. לאחר מכן, תן ההדרגתי להפשיר בחדר קר או מקרר. </li></ol> 2. הכנת תמציות Cytosolic הערה: אנו recommבסופו של שימוש בשני מילויים לדגימה ביולוגית. 300 מ&quot;ג הוא הכמות האופטימלית של חומר צמחי להכין שני מילויים כשעובדים עם 6 ימים שתילי thaliana ארבידופסיס ישנים. כשעובד עם פחות רקמות translationally פעילות, כמות חומר צמחי ניתן להגדיל עד 600 מ&quot;ג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים ישנים קציר ששת ימים גדלו על ½ Murashige ו Skoog 8 בינוניים בתוספת 1% סוכרוז או מדיה מקבילה ידי מהיר הקפאה בחנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומר צמחי טוחנים במכתש ועלי precooled עם חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 300 מ&quot;ג של חומר אבקת בצלחת במשקל precooled. בצע פעולה זו במהירות כדי למנוע הפשרת המדגם. הערה: שמור על דגימות קפואות לתקופה שלא תעלה על שבוע אחד במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.4 מ&quot;ל של חיץ polysome precooled (4X תמיסת מלח, 5.26 מ&quot;מ EGTA, 0.5% (v / v) פולי Octylphenoxy (ethyleneoxy אתנול), מסועף, 50 μg.ml -1 cycloheximide, 50 μg.ml 1chloramphenicol) ו homogenize ידי ערבוב עם קצה פיפטה. העבר לשתי צינורות 1.5 מ&quot;ל. לעבוד במהירות כדי למנוע את הדגימות מן ההתחממות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C ב microcentrifuge כדי גלולה פסולת. הערה: כדי למנוע השפלה RNA, תמיד לשמור על דגימות ב 4 ° C, השתמש פתרונות חינם RNase / DNase ולעבוד בתנאים חינם RNase / DNase. הפרין ניתן להוסיף למאגר polysome, לריכוז סופי של 300 μg.ml -1, כדי לשפר את ההגנה RNA. עם זאת, מאז הפרין יכול להפריע ניתוח במורד זרם, זה יהיה חייב להיות מוסר במהלך שלב משקעי RNA על ידי ביצוע משקע ליתיום כלוריד במקום משקעי אתנול (הערה השווה 4.7). </li></ol> 3. פרופיל Polysome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות פיפטה את supernatant מבלי להפריע גלולה. אם שברי צמח כבר pipetted, חזור על שלב 2.5. טען את supernatant על גבי שיפוע ידי בעדינות pipetting על דפנות הצינור בזרם קבוע. השתמש שיפוע אחד לכל צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים precooled דליים צנטריפוגות ב 175,000 XG במשך שעה 2. 45 דקות ב 4 ° C, בתוך ultracentrifuge (למשל 32,000 סל&quot;ד כשמשתמשים הרוטור SW41). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת איסוף שיפוע כמתואר באיור 1. קובט UV יש pathlength 1 מ&quot;מ. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> איור 1. מערכת איסוף Gradient. קובט UV מחובר על ידי צינורות פוליוויניל כלוריד צינור נימי זכוכית יורד לתחתית השיפוע. שיפוע התקדמות דרך בזכות מערכת משאבה peristaltic. OD 260 קורא ברציפות ו -2 מ&quot;ל שברים נאספים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של</a>נתון זה. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את אספן חלק כדי RT, ולהגדיר את הקרוסלה במהירות שתאפשר גביית 2 מ&quot;ל שברים. השתמש צינורות אוסף מראש מקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השברים מלמטה למעלה באמצעות צינור נימי זכוכית המחוברים באמצעות צינורות פוליוויניל כלוריד למערכת אוסף השיפוע. השתמש סרט פרפין פלסטיק כדי לאבטח את החיבור בין צינורות פוליוויניל כלוריד ואת צינור נימי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה ב 260 ננומטר מלמטה העליון של השיפוע. כאשר השיפוע כולו נאסף, ומקום הצינורות האוספים על קרח לפני מיצוי RNA. </li></ol> 4. RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינת השברים שנאספו משני הדרגתיים, ב 50 מ&quot;ל כתרי צינורות צנטריפוגה, כדלקמן: Polysomes: שברים 1 עד 3 (12 מ&quot;ל) Monosomes: חלק 4 (4 מ&quot;ל) Supernatant: שברים 5 ו -6 (8 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל חלק, להוסיף 1 כרך. hydrochloride guanidine 8M,50 מיקרוגרם מובילים אקריליק ו -1.5 vol. isopropanol. הערה: מנשא אקריליק הוא acrylamide ליניארי, משמש coprecipitant כדי לשפר את ההתאוששות של חומצות גרעין במהלך משקעי אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי היפוך הצינורות המשקע O / N ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 175,000 XG במשך שעה 1 ב 4 ° C, בתוך ultracentrifuge (32,000 סל&quot;ד ב הרוטור SW32). אם השלב משקעים מתבצע בתוך שפופרת אשר אינה עולה בקנה אחד עם ultracentrifugation, והעברת צינור מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את גלולה ב 200 חיץ TE μl RNAse ללא (10 mM Tris-HCl pH 7.5 - 1 מ&quot;מ EDTA). מעביר צינור 1.5 מיליליטר טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ RNA על ידי הוספת 1 כרך. מים פנול רווי (pH 6.6) ו 1 כרך. כלורופורם: אלכוהול isoamyl (24: 1). מערבבים נמרצות. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 20 דקות ב 4 °. מעביר את השלב המימי לצינור 1.5 מיליליטר חדש. הערה: פנול חומצה (pH 4.5) ניתן להשתמש כדי למזער זיהום הדנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">המשקע RNA על ידי הוספת 1/10 vol. 3 נתרן אצטט M ו- 3 vol. 100% אתנול. אפשר משקעים ב -80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות או O / N ב -20 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. הערה: אם אתה משתמש הפרין למאגר polysome (הערה השוו 2.5), לבצע ליתיום כלוריד (LiCl) ממטרים במקום משקעים אתנול כדי להסיר כל שמץ של הפרין כראוי שעלולה להפריע ניתוח במורד הזרם 9. לאחר החילוץ, להוסיף LiCl לריכוז סופי של 2.5 מ &#39;אפשר משקעים במשך 30 דקות ב -20 ° C או O / N ב 4 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם אתנול 500 μl 75%. האוויר היבש גלולה ו להתמוסס 30 μl חיץ TE. הערכת איכות RNA על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose 1.2% חינם RNAse (100V, 15 דקות) או על ידי שיטות אלקטרופורזה נימי. </li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים גולמיים ייצא תוכנת ניתוח גרפית ונתונים. הערה: כפי שניתן לראות בתרשים 2A ו- B, את הפרופילים גלם לתת מידע איכותי: מספר פסגות polysome כי ניתן לראות, את גובה שיא monosome, ואת הנוכחות של הכתף המתאים יחידות משנה הריבוזום בחינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיזוג פרופילים על מנת לאפשר השוואה של פרופילים בין דגימות. השתמש בכלי קורא מסך כדי לקבוע את ערך X של שיא monosome עבור כל דגימה וליישר את פסגות monosome ידי הסרת נקודות נתונים נוספות בתחילת העקומות. זהה את הנקודה הנמוכה ביותר של העקומה ולקבוע ערך Y שלה (שימוש באפשרות קורא המסך). הגדר את הערך Y הנקודה הנמוכה ביותר ל -0 באמצעות הפונקציה &quot;סט עמודות ערך&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את יחס polysomes / monosomes ידי שילוב השטח מתחת לעקומה מפרופילי גלם (איור 3 ג). השתמש בכלי בורר נתונים להגדרת הגבול של האזור כדי להיות משולב. ואז להשתמש בפונקציה לשלב (ניתוח-מתמטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמלהעקומות אל פסגת monosome ידי חלוקת כל נקודות הנתונים של עקומה ידי ערך Y של הפסגה של פסגת monosome (נקבעו באמצעות כלי קורא המסך). בחר את העמודה, ולאחר מכן תחת-מתמטיקה ניתוח, בחר לנרמל ולבחור את &quot;מחולק לסכום מסוים&quot; שיטות. שלב זה מאפשר השוואה של הרמה היחסית של polysomes (איור 3D). </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> איור 2. פרופילים polysome נציג. ארבידופסיס thaliana wild-type (wt, אקוטיפ Col-0) ושתילים מוטציה גדלו במשך שישה ימים על ½ Murashige ובינוניים Skoog תחת photoperiods יום ארוך (16 שעות אור, 8 שעות חושך). ת: פרופילי polysome גלם מן השתילים WT. B: פרופילי polysome גלם מן שתילי מוטציה. C: קביעת אחוז polysomes ו monosomes ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה D: Profi Polysomeles מנורמל שיא monosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Nelson, C. J., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+in+plant+biology.">Protein turnover in plant biology.</a> Nat Plants. 1 (3), 15017 (2015).</li><li>Warner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economics+of+ribosome+biosynthesis+in+yeast.">The economics of ribosome biosynthesis in yeast.</a> Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).</li><li>Amthor, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+McCree-de+Wit-Penning+de+Vries-Thornley+Respiration+Paradigms:+30+Years+Later.">The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later.</a> Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).</li><li>Preiss, T., W Hentze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starting+the+protein+synthesis+machine:+eukaryotic+translation+initiation.">Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).</li><li>Baerenfaller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+proteomics+reveals+Arabidopsis+thaliana+gene+models+and+proteome+dynamics.">Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics.</a> Science. 320 (5878), 938-941 (2008).</li><li>Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopurification+of+Polyribosomal+Complexes+of+Arabidopsis+for+Global+Analysis+of+Gene+Expression.">Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression.</a> Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis protocols. , (2006).</li><li>Piques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+and+transcript+copy+numbers,+polysome+occupancy+and+enzyme+dynamics+in+Arabidopsis.">Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis.</a> Mol syst biol. 5 (314), 314 (2009).</li><li>Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+Profiling+Analysis.">Polysome Profiling Analysis.</a> bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).</li><li>Y&#225;ng&#252;ez, E., Castro-Sanz, A. B., Fern&#225;ndez-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress.">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS One. 8 (8), (2013).</li><li>Sormani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublethal+cadmium+intoxication+in+Arabidopsis+thaliana+impacts+translation+at+multiple+levels.">Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels.</a> Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).</li><li>Lanet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+for+translational+repression+by+Arabidopsis+microRNAs.">Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs.</a> Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).</li><li>Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rice+cis-Natural+Antisense+RNA+Acts+as+a+Translational+Enhancer+for+Its+Cognate+mRNA+and+Contributes+to+Phosphate+Homeostasis+and+Plant+Fitness.">A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness.</a> Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting.">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470 (10), (2010).</li><li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis.">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

The protocol we present here is an easy and cheap method for generating polysome profiles and isolating mRNAs associated with polysomes, single ribosomes or free of ribosomes. A wide range of different polysome fractionation methods is described in the literature. The method we have described here has been optimized to keep only the necessary compounds and has been adapted for plant material. In particular, we reduced the amount of detergent11 and added chloramphenicol to the buffer to fix the chloroplastic ri...

סינתזת חלבון היא תהליך חיוני ויקר במרץ בכל התאים 1. קודם כל, התאים חייבים להשקיע אנרגיה בייצור של מכונות תרגום, הריבוזומים. לדוגמא תא שמרים שעדיין מתחלק מייצר ככל 2,000 ריבוזומים לדקה. כזה הייצור דורש עד 60% של פעילות תעתיק הכולל עד 90% מהפעילות שחבור הכולל של התא 2. בנוסף, אנרגיה נדרשת לסינתזה של חומצות אמינו, aminoacyl-tRNA ו קשרים פפטידיים. בצמחים, הוספת חומצה אמינית אחת על עלויות שרשרת הפפטיד מן 4.5 ל 5.9 מולקולות של ATP 3. לכן, אין זה מפתיע כי התרגום של mRNA לחלבון הוא אתר עיקרי של רגולציה, במיוחד כאשר מדובר בהתמודדות עם תנאי סביבה משתנה. צעד החניכה של תרגום, כלומר את שיוכה של mRNA עם הריבוזום, הוא המטרה העיקרית של ההסדרהתרגום 4. כתוצאה מכך של הסדרת התרגום וכן צעדים רגולטוריים שלאחר תעתיק אחרים, רק 40% של וריאציות בריכוז החלבון יכול להיות מוסבר על ידי mRNA שפע 5,6. לכן, המחקר של mRNA הכולל נותן מידע עני יחסית על שפע חלבון. מצד שני, העמותה של mRNA עם ריבוזומים נותן תובנות טובות יותר שפע החלבון על ידי מתן גישה mRNAs המעורבים התרגום. mRNAs המתורגם באופן פעיל משויך כמה ריבוזומים במבנים שנקראו polysomes. לעומת זאת, mRNAs מתורגם גרוע ישויך רק אחד הריבוזום (monosome). כתוצאה מכך, מעמדם translational של mRNA יכול להיות מוערך על ידי מעקב אחר הקשר שלה עם ריבוזומים 7. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של polysomes מן שתילי thaliana ארבידופסיס בת שישה ימים, הבידוד הבא של RNA, ואת ניתוח התוצאות. Polysomes ו monosomes מופרדים באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז. הדרגתיים נאספים לשישה שברים. חלק מן השברים הם אספו להשיג שלושה שברים מופרדים היטב: polysomes, monosomes ואת שבריר אור (הנקרא להלן supernatant), אשר מכיל את יחידות משנה ריבוזומלי 60S ו 40S בחינם mRNAs שאינם משויכים עם ריבוזומים. ניתן לאמוד פעילות תרגום עולמית על ידי יצירת יחס polysome / monosome, אשר נקבע על ידי שילוב של השטח מתחת לעקומה, ועל ידי השוואת פרופילי polysomes. mRNAs וחלבונים אז המחולצים שברים שונים ומשמש לניתוח על ידי RT-PCR, qRT-PCR, כתם הצפון, microarray, כתם או פרוטאומיקה המערבי. פרוטוקול זה יאומת לצמחים ורקמות אחרים. הציוד נדרש לבצע פרוטוקול זה מצוי לרוב ברוב המעבדות: אין צורך לעושה שיפוע. הקפאת כל שכבה לפני הוספת הבאה למנועs מכל תערובת או הפרעה של השכבות. לא דוקר צינור משמש לאיסוף שיפוע אשר יכול להיות מושגת על ידי טבילה של צינור נימי זכוכית של ההדרגה. לכן, צינורות ultracentrifuge יקר להישאר ניזוק וניתן להשתמש בהן שוב ושוב פעמים רבות. ביחד, זה הופך את הפרוטוקול הנוכחי שיטה קלה וזולה עבור פרופיל polysome.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube, thinwall, polyallomer - 38.5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary tube</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima series</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon R3607 polyvinyl chloride tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Polyvinyl chloride tubing, 2.29 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fraction collector Model 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>UV cuvette</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Quartz flow-through cuvette</td></tr><tr><td>UV Spectrophotometer</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Read every 0.0125 sec</td></tr><tr><td>All chemicals</td><td>Any</td><td></td><td>Use only Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free water</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol, branched (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide (acryl carrier)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>RNA precipitation carrier</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Analysis software</td></tr></tbody></table>

an easy method for plant polysome profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

בספרות, פרופילי polysome לעתים קרובות מוצגים מתוך שבריר האור לשבר כבד כתוצאת הדרך ההדרגתית נאספת, כלומר מלמעלה עד למטה. מאז בפרוטוקול המתואר כאן ההדרגתיים נאספים מלמטה למעלה, את הפרופילים אנו מראים להתחיל עם השבר העבה (polysomes) וללכת שבר האור (יחידות מהשנה...

Watch this Scientific Journal Video about An Easy Method for Plant Polysome Profiling at JoVE.com

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

an-easy-method-for-plant-polysome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  Aix-Marseille Université. This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Video: An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Biochemistry

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Developmental Biology

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper describes methods optimized to isolate plant-derived polyribosomes and their associated mRNAs to be analyzed using RNA-sequencing. First, cytoplasmic lysates are obtained through homogenization in polysome- and RNA-preserving conditions from whole, frozen soybean nodules. Then, lysates are cleared by low-speed centrifugation, and 15% of the supernatant is used for total RNA (TOTAL) isolation. The remaining cleared lysate is used to isolate polysomes by ultracentrifugation through a two-layer sucrose cushion (12% and 33.5%). Polysome-associated mRNA (PAR) is purified from polysomal pellets after resuspension. Both TOTAL and PAR are evaluated by highly sensitive capillary electrophoresis to meet the quality standards of sequencing libraries for RNA-seq. As an example of a downstream application, after sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to obtain differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels. In summary, this method, in combination with RNA-seq, allows the study of the translational regulation of eukaryotic mRNAs in a complex tissue such as the symbiotic nodule.

This protocol describes a method for eukaryotic polysome purification from intact soybean nodules. After sequencing, standard pipelines for gene expression analysis can be used to identify differentially expressed genes at the transcriptome and translatome levels.

טיהור פוליזום מגושים סימביוטיים של פולי סויה

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Neuroscience

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...