אז מטרת השיטה בכתב היד שלנו היא לספק ניתוח השוואתי של מסלולי איתות בתאי מיאלואידים באמצעות מערכות אדם ועכבר. זה עוזר להגדיר איזה מסלול איתות מעורב במורד הזרם של קולטני זיהוי דפוס נבחרים. אז שיטה זו היא פשוטה ליישום.
הוא מסתמך על תכשירי תאים ראשוניים ותרכובות ייחוס מאומתות, החיוניות להבהרת מנגנוני איתות. הדגמת ההליך תהיה Ratiba Touil ו אדלין Unterreiner, בהתאמה מדען עמית מחקר בקבוצה שלנו. במכסה המנוע של זרימה למינארית קבעו זוג מספריים סטרילי, ליטר אחד ושקית ניילון.
מניחים את מעיל באפי שהושג בעבר לתוך המקוון ולהשתמש במספריים כדי לפתוח אותו בזהירות. באמצעות פיפטה 25 מ"מ להוסיף 100 מ"ל של PBS בתוספת 2 מילימולר של EDTA. מערבבים על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה.
ואז להעביר 25 מ"ל של מעיל באפי מדולל לתוך שישה צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל כי יש כל מולאו מראש עם 15 מ"ל של שיפוע צפיפות מבוסס פוליסכריד. צנטריפוגה הצינורות במשך 20 דקות ב 800 גרם עם האצה מתונה ללא הפסקה כדי לאפשר הפרדת תאים המבוססים על הצפיפות שלהם. לאחר צנטריפוגה שלוש שכבות יהיו גלויות, גלולה המכילה תאי דם אדומים וגרנולוציוטים, שכבה עליונה עשויה פלזמה, וטבעת לבנה המכילה תאים מונונוקלאריים בדם היקפיים.
השתמש פיפטה 10 מ"ל לקצור את טבעות PBMC ולהעביר אותם לתוך צינור חדש 50 מ"ל. למעלה עם PBS ו- EDTA. בצע שלוש שטיפות רצופות עם ירידה בזמן הצנטריפוגה והמהירות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר הכביסה הסופית, לחץ מחדש את גלולה ב 25 מ"ל של חיץ תריס קר קרח כדי lyse תאי הדם האדומים על ידי לחץ אוסמוטי. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר עד שהוא הופך להיות ברור. לאחר מכן הוסיפו 25 מ"ל של מאגר הפרדה כדי לעצור את התגובה.
צנטריפוגה ב 150 גרם במשך שמונה דקות כדי לשטוף את הפתרון. יוצקים את העל-טבעי ומורידים מחדש את גלולת הכדור עם חיץ ההפרדה. לאחר ספירת התאים, לדלל אותם בתרבות בינוני עד 12, 500 תאים לגם.
להפיץ 30 מ"ל של ההשעיה תא זה לתוך כל באר של צלחת 384 היטב. לאחר מכן להוסיף 15 microliters של פתרונות מורכבים מרוכזים ארבע פעמים לכל באר preincubate את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. אם תרצה, להוסיף גם LPS לריכוז הסופי של 1 ננוגרם למיליליטר או Zymosan מדולדל לריכוז סופי של 100 מק"ג לכל מ"ל.
ואז לה הדגירה את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת לקחת 10 microliters של supernatant למדוד את רמות אלפא TNF המופרש. כדי להתחיל את הדילול הסדרתי, לדלל את פתרון המניות MLT-827 עם בינוני להגיע לריכוז של 8 micromolar ללכת אחד.
בצע דילול טורי של שישה שלבים 1:5 באמצעות מדיום עם 0.08%DMSO. כדי להתכונן לבדיקות מנה אחת, לדלל את MLT-827, AFN700, ותרכובת 11 פתרונות מלאי עם בינוני להגיע לריכוז של 4 micromolar ללכת אחד. ראשית, מוסיפים 2 מ"ל של מים סטריליים נטולי אנדוטוקסין ל -10 מ"ג של Zymosan מדולדל.
וורטקס פתרון המניה הזה כדי הומוגניזציה זה. עליות הפתרון ולאחר מכן לאחסן את aliquots ב 20 מעלות צלזיוס. במחקר זה PBMCs אנושיים ותאי טחול העכבר מגורים עם Zymosan מדולדל, אגוניסט דקטין-1, או lipopolysaccharide, אגוניסט TL4.
שחרור אלפא NTNF ב supernatant נמדד לאחר 20 שעות. הן האדם והן העכבר מסמן את המתחם MLT-827 באופן סלקטיבי חוסם ייצור אלפא TNF מונע על ידי מסלול Dectin-1 אבל לא על ידי מסלול TLR4. במונוציטים מגורה עם LPS, הייצור של אלפא TNF הוא כמעט לחלוטין נפסל על ידי AFN700 אבל זה לא רגיש Cpd11, אשר עולה בקנה אחד עם התלות של מסלול TLR4 בפעילות NF-kappa B ואת התלות שלה על פעילות SIC.
לעומת זאת, ייצור אלפא TNF המונע על ידי Dectin-1 ו- MODCs מראה רגישות ל- MLT-827, AFN700 ו- Cpd11. זה מספק ראיות נוספות למעורבות של מפל איתות CBM SIC במסלול Dectin-1. ייצור בטא IL-1, IL-6 ו-IL-23 רגיש גם לשלושת המעכבים, מה שמצביע על מנגנונים רגולטוריים הדומים ל-TNF אלפא.
עם זאת, ההשפעה המוגבלת שנראתה על הייצור של IL-8 מרמזת כי ציטוקין זה יש מנגנון רגולטורי מובהק. העלאת ריכוזי Trehalose-dibehenate מעל 50 מק"ג למ"ל מובילה לייצור אלפא TNF, IL-6 ו- IL-1 בטא, שהסתמכו על פעילות paracaspase מאלט1 על פי אפקט החסימה של MLT-827. תוצאות דומות נראו כאשר מאתגרים את MODCs עם ריכוזים הולכים וגדלים של Zymosan מדולדל כדי לעורר Dectin-1.
שיטה זו אפשרה להראות כי PARACASPASE MALT1 מווסת באופן סלקטיבי קולטן דמוי לטין מסוג C. זה חיוני כדי להשתמש תרכובות התייחסות מאופיין היטב. שים לב להליך לדילול פתרונות המניות.
זה קריטי עבור מתחם עם מבודדות מוגבלת.
