Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione G12-RR003060 da NIH / NCRR / RCMI, concedere SC1HD068129 dall&#39;Istituto Nazionale di Eunice Shriver del Child Health &amp; Human Development, National Science Foundation CBET 0.754.158 e PSC-CUNY 62337-00 40 presso la City University di New York.

Il seguente protocollo segue le linee guida per la cura degli animali stabiliti dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC) presso il City College di New York. Intubazione Animal 1. (10-20 min) <ol><li> Prima dell&#39;intervento, preparare la soluzione Ringer mammiferi. Montare gli strumenti chirurgici, rilievo di riscaldamento, ventilazione e piccoli animali in panchina (Figura 2). <ol><li> Per misure di barriera ematoencefalica permeabilità fanno 10 ml di 1% di siero albumina bovina soluzione (BSA) in Ringer e dissolvono TRITC-destrano 155 kD a 8 mg / ml in soluzione BSA 1%, soluzione di filtro da 25 mm filtro a siringa (0,2 micron dimensione dei pori) e conservare in una siringa foglio coperto nel buio. </li></ol></li><li> Anestetizzare l&#39;animale con isoflurano. Utilizzare 5,0% per l&#39;induzione e il 1,5-3,0% per la manutenzione. In alternativa una miscela di ketamina (41,7 mg / kg) e xilazina (2,5 mg / kg di peso corporeo) può essere utilizzato. Profondità dell&#39;anestesia può essere controllato da punta pizzico riflessoestremità superiori e inferiori. <ol><li> Dosi successive di ketamina (41,7 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (2,3 mg / kg di peso corporeo) devono essere somministrati con incrementi di ⅓ della dose massima per evitare un sovradosaggio. L&#39;uso di un ventilatore roditore è raccomandato per contrastare la depressione respiratoria xilazina indotta. </li></ol></li><li> Posizionare il cucciolo anestetizzato sdraiato su un fianco dorsale e fissare la testa con il cono di plastica utilizzato per fornire l&#39;anestetico (Figura 3a). <ol><li> Fissare l&#39;animale con nastro adesivo sugli arti anteriori e la coda (Figura 3a). </li><li> Un&#39;alternativa per fissare la testa del cucciolo è quello di utilizzare una piastra testa attaccata ad una barra di metallo. Nota: Assicurarsi che il pad di riscaldamento è impostato a 37 ° C per evitare l&#39;ipotermia (Figura 3a). </li></ol></li><li> Utilizzare forbici (Figura 2b) per fare uno longitudinale e quattro incisioni laterali sulla pelle sovrastante il collo (Figura 3b). Usando una tecnica smussato, sezionare la pelle e metterlo da parte con pinze (figure 2c e 3c). <ol><li> Tenere la pelle verso il basso con del nastro adesivo. Stabilizzare la testa in posizione orizzontale (figura 3c). </li></ol></li><li> Utilizzando le forbici a molla (Figura 2d) e la tecnica schietto, ghiandole spinta e strati di grasso da parte per esporre la trachea (Figura 3c). Identificare la posizione delle arterie carotidi. <ol><li> Mantenere le arterie carotidi dalla trachea. Nota: Puntura carotidi può comportare la perdita massiccia di sangue e la morte del cucciolo. </li></ol></li><li> Utilizzando le forbici a molla (figura 2d) sezionare i muscoli longitudinali relativi alla trachea. Tagliare i muscoli longitudinali situati sotto la trachea (Figura 3d). Nota: Gli anelli tracheali devono essere chiaramente visibili (Figura 3e). <ol><li> Utilizzopinza (Figura 2c), legare due pezzi di sutura intorno alla trachea. Un pezzo di sutura sarà fissare il tubo di ventilazione ed il secondo thread viene utilizzato per chiudere il rostrale trachea al punto di inserimento tubo di ventilazione (Figura 4a). Nota: Inumidire il tessuto esposto regolarmente con soluzione di Ringer per prevenire la disidratazione. </li></ol></li><li> Utilizzando le forbici a molla (figura 2d) fanno un&#39;incisione su uno degli anelli tracheali situate tra i due fili posti in fase 1.6.1 (Figura 4c). Nota: Assicurarsi che nessun liquido entra nella trachea aperta. Liquido nella trachea provoca asfissia. </li><li> Inserire il tubo di intubazione (Figura 4b) nella trachea e serrare il filo inferiore per fissarlo. Utilizzando pinze (Figura 2c), serrare il filo superiore per chiudere posteriore trachea al punto di inserimento del tubo di intubazione. <ol><li> Serraren e tagliare le estremità dei due fili (Figura 4d-F). Nota: vapore all&#39;interno del tubo intubazione è un buon segno di controllo del flusso d&#39;aria. </li></ol></li><li> Prontamente commutare l&#39;alimentazione isoflurano al ventilatore. Regolare il volume della corsa e il tasso di aerazione secondo il peso dell&#39;animale. <ol><li> Sigillare il tessuto circostante esposta con elastomero (figura 5a). Mantenere la superficie inumidito e pulito. </li></ol></li></ol> 2. Trachea e rimozione Muscle per esporre il cranio (5-10 min) <ol><li> Utilizzare forbici a molla (figura 2d) per tagliare la trachea adiacente al tubo di ventilazione. Effettuare due tagli lungo la parete muscolare della cavità buccale per esporre la fine caudale del palato (Figura 5b). Nota: Se necessario, utilizzare un cauterizer per fermare le emorragie. Sanguinamento incontrollato causerà la morte dell&#39;animale. </li><li> Pulire ilzona con abbondanti quantità di soluzione di Ringer (Figura 5c). Identificare il divario tra l&#39;ultima vertebra e l&#39;osso basi-occipitale (Fig. 5d). Nota: Il divario tra le ossa è un punto di riferimento teschio utile per individuare le strutture del tronco cerebrale. L&#39;oliva inferiore si trova sotto questa lacuna. Il complesso olivary superiore uditivo si trova sotto l&#39;osso basi-occipitale in direzione rostrale da questo gap (vedi anche figura 1). </li><li> Pulire l&#39;area con pinze (Figura 2c) e forbici a molla (Figura 2d). Non forare i vasi sanguigni. Nota: Se necessario, cauterizzare per fermare le emorragie. <ol><li> Dopo l&#39;area esposta è pulita di grasso e di tessuto muscolare, lo spazio che separa l&#39;osso basi-occipitale e l&#39;ultima vertebra deve essere visibile (figura 5d). </li></ol></li></ol> 3. Craniotomy (15-30 min) <ol><li> Utilizzare un microdrill o di un ultradetergente sonic. Individuare la parete mediale della bulla. <ol><li> Sottile il cranio facendo una forma D invertita fino a quando le arterie sottostanti sono visibili (Figura 5e). Nota: L&#39;arteria basilare (bas) corre sulla parte superiore della linea mediana del tronco cerebrale. L&#39;arteria cerebellare inferiore anteriore (AICA) le succursali a livello bilaterale e può essere utilizzato in modo affidabile come un punto di riferimento in quanto ha una posizione costante in diversi animali. </li><li> Quando il cranio è assottigliato, delicatamente rompere utilizzando uno scalpello dissezione (Figura 2e). Rimuovere il pezzo di osso con una pinza (Figura 2c). In alternativa, sollevare e rompere il cranio con un ago piegato. Nota: Ripetere questa procedura fino a quando la dimensione e la forma del craniotomia è appropriato per l&#39;esperimento previsto. Le bas e AICA dovrebbero essere visibili attraverso la membrana dura (Figura 5f). </li></ol></li><li> Pulire l&#39;area più volte con soluzione di Ringer fresca. Uso pa assorbenteds asciugare la superficie della membrana dura. <ol><li> Se necessario, utilizzare un ago di sutura per rimuovere la membrana dura senza spostare o rompere le arterie punto di riferimento bas e AICA. Nota: Dopo dura pungere liquido cerebrospinale scorre fuori. Pulire la zona con soluzione di Ringer e mantenere inumidita tutto l&#39;esperimento. </li></ol></li></ol> 4. Elettrofisiologia Experiment <ol><li> Selezionare il polytrode secondo il disegno esperimento (Figura 7a). Utilizzare un pennello fine per rivestire la polytrode con DII. Trasferire la soluzione DII in una provetta 1 ml, immergere il pennello nella soluzione e colpire delicatamente la polytrode sotto la guida visiva (vale a dire utilizzando uno stereoscopio). Inizia la punta della sonda e continuare con cura fino a quando tutti gli elettrodi sono rivestite in maniera uniforme. <ol><li> Posizionare l&#39;elettrodo di terra all&#39;interno della cavità orale. Caricare il polytrode nel 7b portaelettrodo (Figura </strong&gt;). </li><li> Accendere l&#39;amplificatore e verificare che tutti i collegamenti funzionano bene. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;elettrodo sopra bas al punto di diramazione di AICA (posizione zero). Spostare l&#39;elettrodo al punto di destinazione desiderato utilizzando l&#39;apposito rostrale-laterale coordinate (Figura 7c). <ol><li> Posizionare l&#39;elettrodo sulla superficie del cervello e spostarlo fino alla profondità desiderata in intervalli di 5-10 micron. </li></ol></li><li> Eseguire la registrazione secondo il disegno sperimentale. Salvare i dati per ulteriori analisi. </li></ol> 5. Due fotoni Imaging Experiment <ol><li> Accendere il microscopio. Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione e di utilizzare un filtro per le emissioni appropriato. Eccitazione a 800 nm e ± 45 nm filtro per le emissioni passa-banda lavoro 607 bene per l&#39;imaging TRITC-destrano. </li><li> Identificare destra o sinistra carotide. Usando la tecnica smussato sezionare l&#39;arteria carotide dai tessuti connettivi o nervi adiacenti. <ol><li> Scegli e tenere la carotidearteria con una pinza emostatica. Tie tre pezzi di sutura intorno alla carotide. </li><li> Tendere il filo più vicino al lato del cuore per arrestare il flusso di sangue e lasciare gli altri due fili sciolti. </li><li> Usare le forbici pregiati per fare un piccolo taglio ad un angolo di 45 ° sulla carotide tra il filo legato e la successiva filo allentato. Nota: pulire il sangue con carta assorbente. </li></ol></li><li> Cannulate la carotide. Inserire il tubo riempito con soluzione TRITC-destrano nel taglio sulla carotide circa 5 mm di profondità orientate verso la testa del cucciolo. <ol><li> Serrare gli altri due fili intorno all&#39;arteria per tenere il tubo e l&#39;arteria insieme. Stringere i fili, tagliare e aggiungere elastomero per stabilizzare ulteriormente. Nota: L&#39;altro lato del tubo è collegato con la siringa contenente soluzione TRITC-destrano (preparato al punto 1.1). </li></ol></li><li> Fissare la siringa sulla pompa a siringa. <ol><li> Setla velocità del flusso sanguigno carotide del cucciolo. Attiva la pompa a siringa per pochi secondi e controllare manualmente che la soluzione colorante può essere iniettato nella carotide. Nota: Supponendo che il tasso di flusso di sangue nella carotide di ratto adulto (240-280 g) è di circa 3 ml / min 14, il flusso sangue per un cucciolo di ratto (es. P10 cucciolo pesa 15-25 g) può essere calcolato per intervallo 0,16-0,3 ml / min. </li></ol></li><li> Mettere l&#39;animale nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo microscopio. Iniettare la destrano fluorescente nel flusso sanguigno. <ol><li> Identificare le aree di interesse sul tronco encefalico ventrale con un obiettivo di aria 5X. Passare a un obiettivo 20X o 40X (immersione in acqua, NA = 0.5 o 0.8, rispettivamente) per mettere a fuoco la regione di interesse (ROI). </li><li> Inizia imaging e regolare i parametri di acquisizione di immagini (ad esempio tempo di esposizione, la potenza del laser, il guadagno del rivelatore) finché l&#39;intensità di fluorescenza nel sistema vascolare del ROI viene ottimizzato (cioènon troppo basso ma non saturo). </li><li> Accendere la pompa a siringa per iniettare la soluzione colorante nella carotide e acquisire una serie temporale in un piano focale fissa. </li></ol></li></ol> 6. Animal Care Seguendo la procedura <ol><li> Questa è una procedura terminale. Alla fine di un esperimento animali devono essere sacrificati con una overdose di pentobarbital (100 mg / kg, iniezione intraperitoneale) o qualsiasi altro metodo di eutanasia approvato dalla American Veterinary Medical Association Linee guida eutanasia. Nota: perfusione attraverso il cuore con la soluzione di Ringer seguito con una soluzione di fissativo è raccomandato per ulteriori analisi istologica. </li></ol>

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	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il tempo è un fattore critico. Un ricercatore esperto dovrebbe essere in grado di completare questo protocollo in 1 ora (passi 1-3). I tempi indicati per le diverse fasi assumono un medio-alto livello di competenza. Tracheotomia e intubazione corretta e tempestiva sono fondamentali, in quanto scarso controllo ventilazione può portare ad asfissia e la morte dell&#39;animale. Liquidazione attenta dei tessuti muscolari e adipose è molto importante anche perché gli errori possono portare a sanguinamento incontrollato e la morte dell&#39;animale. Allo stesso modo, quando si prepara l&#39;arteria carotide per l&#39;inserimento cannula, bisogna stringere e tagliare l&#39;arteria con attenzione, se il nodo del filo si allenta sanguinamento incontrollato avrà luogo. Infine, la craniotomia deve essere fatta con attenzione, senza interrompere i punti di riferimento vascolare. Rimozione incurante dello strato meningea esterna (dura) può portare a gravi emorragie e danni della fornitura arteriosa. Impostazioni di ventilazione sono scelti secondo l&#39;età dell&#39;animale.La maggior parte dei fornitori commerciali forniscono utili informazioni su tali impostazioni. Esperimenti sui ratti di età superiore a P15 richiedono l&#39;uso di un grande ventilatore animale. Animali adulti non possono avere bisogno di ventilazione se anestetizzati con ketamina / xylazina, ma l&#39;intubazione è consigliato per evitare fluido entrare nella trachea. Una limitazione principale di questo protocollo è che gli esperimenti possono essere eseguiti soltanto acutamente. Nel nostro laboratorio abbiamo effettuato esperimenti di durata compresa tra due e fino a dieci ore. Una seconda limitazione è che gli esperimenti devono essere effettuati sotto anestesia. Pertanto, la scelta di anestesia è una variabile importante da considerare nella pianificazione e progettazione di esperimenti. Un problema correlato è che gli animali neonati possono essere particolarmente sensibili al sovradosaggio. Ad esempio, se si sceglie di ketamina / xilazina mix, calcolare la dose in base al peso del cucciolo e somministrare farmaci a ⅓ del volume massimo. Controllare lo stato dell&#39;animale ogni 5-10 minuti da toe pinch response. Se si utilizza isoflurano, sono necessarie anche le precauzioni per mantenere un ambiente sicuro per l&#39;investigatore (corretta ventilazione, e un vaporizzatore calibrato correttamente). Lo stereomicroscopio può essere montato su un supporto flessibile per regolare l&#39;angolo di visione e facilitare la gestione spazio per posizionare elettrodi e trasferimento dell&#39;animale al microscopio a due fotoni. L&#39;uso di una batteria per alimentare il ventilatore può facilitare lo spostamento dell&#39;animale e ridurre gli artefatti elettrici durante gli esperimenti di elettrofisiologia. A tal fine, una piccola basetta (7,5 x 12 pollici) può essere utilizzato per assemblare insieme al ventilatore, rilievo di riscaldamento e la anestetizzato animale (Figura 2a). Una modifica utile ed importante per questa configurazione è l&#39;aggiunta di un dispositivo per il monitoraggio dei parametri vitali durante l&#39;intervento chirurgico. Un ossimetro o altri dispositivi analogici possono essere utilizzati a seconda del budget laboratorio. Questo protocollo è stato usato con elettrofisiologia e di imaging incontratohods, incluse registrazioni di patch clamp 8,10,11, registrazioni polytrode (Figura 7), e due fotoni di imaging 9 (figure 6 e 8). Una possibile applicazione futura sarebbe di combinare questi metodi per colpire le cellule fluorescente per la registrazione elettrofisiologica 16. Le nuove applicazioni di imaging possono anche includere 2-D o serie temporali 3-D usando la microscopia a due fotoni. Ad esempio, utilizzando bolo loading di indicatori calcio per studiare l&#39;attività del tronco cerebrale neuronale e popolazioni di cellule gliali. Come mostrato in figura 8, una soluzione colorante iniettato nella circolazione sanguigna attraverso l&#39;arteria carotide può essere utilizzato per generare immagini ad alto contrasto del cervello del sistema vascolare. Poiché il colorante fluorescente riempie il lume microvasali e si diffonde nel tessuto circostante, esso può essere utilizzato non solo per la determinazione del soluto permeabilità apparente della barriera ematoencefalica ma anche il coefficiente di diffusione del solutoficiente nel tessuto cerebrale 3. Una ragione principale per iniettare i soluti fluorescente attraverso l&#39;arteria carotidea è che la soluzione colorante può andare direttamente ai microvasi nel cervello senza andare al cuore prima come in una iniezione coda vena. Questo porta almeno due vantaggi. Uno è che la concentrazione di fluorescenza colorante nel lume microvasali può essere praticamente costante se il tasso di perfusione è fissata sul sito incannulamento. Questo assicura determinazione accurata della permeabilità barriera emato-encefalica. Un altro è che se un agente di test è incluso nel perfusato, si passerà direttamente alla barriera emato-encefalica senza essere diluito o in combinazione con altri fattori della circolazione del corpo. Nuovi esperimenti possono inoltre usufruire di animali transgenici con i giornalisti fluorescenti geneticamente codificati. Ciò fornirebbe il vantaggio che le sonde fluorescenti non avrebbero bisogno di essere caricato in situ (a meno che il progetto dell&#39;esperimentodisponga diversamente), risparmio di tempo e forse consentendo preparati intatte altre (ad esempio, finestre cranica 17). Infine, esperimenti possono essere condotti in altre regioni del tronco cerebrale come l&#39;oliva inferiore o il nucleo motore facciale. Le conoscenze su neuroanatomia e lo sviluppo delle popolazioni cellulari specifiche in una determinata specie sarà importante a questo fine, in particolare per quanto punti di riferimento anatomici possono cambiare come animali crescono (Figura 1). Ci auguriamo che questo protocollo incoraggia gli altri a studiare le strutture del tronco cerebrale ventrali utilizzo in elettrofisiologica vivo e metodi di imaging.

L&#39;uso di una craniotomia in combinazione con fluorescenza imaging e tecniche di elettrofisiologia consente monitoraggio del flusso sanguigno, barriera ematoencefalica permeabilità e misurando l&#39;attività di neuroni e cellule gliali negli animali vivi 1-3. Numerosi laboratori hanno utilizzato questo approccio per fornire una conoscenza fisiologia del cervello in condizioni di salute e di malattia, ma le lacune restano nella nostra comprensione di come questi processi si presentano durante lo sviluppo. Inoltre, la maggior parte degli studi si sono concentrati sulle regioni cerebrali che sono facilmente accessibili dalla superficie dorsale del cranio, tale che le strutture del tronco cerebrale ventrali con diversi ruoli fisiologici sono stati studiati per lo più utilizzando approcci ex vivo. L&#39;obiettivo principale di questo protocollo è quello di fornire un metodo per aprire una craniotomia sul cranio ventrale di roditori. Questo approccio è stato adattato da studi classici eseguiti nei mammiferi più grandi come cani e gatti per reco neurofisiologia sensorialirdings del tronco encefalico uditivo 4-7. In questo protocollo tuttavia, vi è il romanzo sfida di eseguire la procedura in animali neonati. Utilizzando i luoghi di interesse vascolare, questo protocollo adattato è stato utilizzato in precedenza per studiare il tronco cerebrale uditivo di ratti neonati, topi adulti e in altre regioni del tronco cerebrale, come l&#39;olivo inferiore 8-11 (Figura 1). Un vantaggio principale di una craniotomia ventrale rispetto ai metodi esistenti per studiare nuclei del tronco encefalico ventrali è che fornisce un accesso diretto alle strutture di interesse in animali vivi. Per esempio, le cellule uditive del complesso olivare superiore sono localizzati a poche decine di micrometri dalla superficie cervello, che è importante per il posizionamento mirato di sonde e per utilizzare approcci di imaging a due fotoni in cui la profondità di imaging può essere limitato a 0,5 mm dal dispersione tessuto luce e di assorbimento. Una craniotomia ventrale fornisce anche una preparazione con connessioni neurali relativamente intatte, which vengono interrotto in fettine acute e organotipica 12. A differenza di altri protocolli per esperimenti in vivo neurofisiologia in 13, un approccio ventrale può essere combinato con registrazione multi-elettrodo e metodi di imaging che forniscono informazioni sulle formazioni cellulari (Figure 6 e 7). Infine, in combinazione con questo protocollo un soluto fluorescente può essere iniettato nel sistema vascolare a misurare le variazioni barriera ematoencefalica permeabilità al soluto (Figura 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

L&#39;uso di una craniotomia per esperimenti in vivo offre l&#39;opportunità di studiare le dinamiche di diversi processi cellulari nel cervello dei mammiferi nell&#39;età adulta e durante lo sviluppo. Sebbene la maggior parte degli approcci in vivo utilizzano una craniotomia per studiare le regioni del cervello poste sul lato dorsale, le regioni del tronco encefalico come il ponte, che si trova sul lato ventrale rimangono relativamente poco studiato. L&#39;obiettivo principale di questo protocollo è quello di facilitare l&#39;accesso alle strutture del tronco cerebrale ventrali in modo che possano essere studiate in vivo utilizzando elettrofisiologica e metodi di imaging. Questo approccio consente di studio dei cambiamenti strutturali assoni a lungo raggio, pattern di attività elettrica in single ei gruppi di cellule, e cambiamenti di sangue al cervello barriera di permeabilità negli animali neonati. Anche se questo protocollo è stato utilizzato soprattutto per studiare il tronco cerebrale uditivo nei ratti neonati, può essere facilmente adattato per studi in altre specie di roditori come topi neonati, roden adultits e di altre regioni del tronco encefalico.

Elettroporazione di traccianti neuronali Il nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB) è un gruppo di cellule nel complesso olivare superiore che è stato studiato in precedenza utilizzando questo protocollo. Ad esempio, pipette patch clamp può essere utilizzato per l&#39;elettroporazione di traccianti neuronali (Figura 6) 9. Quando pipette sono posizionati vicino alla linea mediana, come mostrato in Figura 6a, il risultato è che decussating assoni afferenti sono etichettati. Un microscopio a due fotoni dotati di elevata apertura numerica dell&#39;obiettivo immersione in acqua può essere utilizzata per l&#39;immagine fibre raggiungono la MNTB, compresi rami collaterali molto fini (frecce in Figura 6b). Traccianti neurali possono anche essere consegnati al MNTB direttamente, come mostrato in Figura 6c. Il risultato è l&#39;etichettatura di cellule MNTB e assoni afferenti, come può essere apprezzato da imaging con un obiettivo ad immersione in acqua inferiore apertura numerica (figura 6d). Il main vantaggio di utilizzare l&#39;obiettivo ingrandimento minore è che un più ampio campo di vista può essere esaminata, e anche se questo si traduce in una diminuzione della risoluzione spaziale a causa della apertura numerica obiettivo inferiore, cellule MNTB individuali possono essere individuate ben (frecce nella Figura 6d) . La durata media di questi esperimenti per tutte le età P1-P5 è di 3,1 ± 1,4 ore (n = 22 cuccioli). Registrazioni Elettrofisiologia Spontanea treno di impulsi è una forma di attività elettrica dello sviluppo osservata in cellule singole MNTB prima dell&#39;inizio della dell&#39;udito 11,13. Usando questo protocollo chirurgico è anche possibile indirizzare array multielettrodi (polytrodes) al MNTB (Figura 7a-b). Il risultato è una registrazione di attività spontanea in un insieme di celle MNTB. Figura 7e mostra una registrazione polytrode rappresentante di un ratto P6. In questo esperimento, il polytrode stato rivestito con DII colorante lipofile usandoun pennello sottile (vedi punto 4.1). Dopo aver eseguito la registrazione del cervello è stata processata per analisi istologica e la posizione della traccia polytrode DII marcato è stato usato per confermare il corretto rivolti al MNTB (Figura 7d). La durata media di esperimenti per tutte le età P1-P6 è di 2,0 ± 0,7 ore (n = 33 cuccioli). Misurazione dei microvasi permeabilità Questo protocollo può anche essere utilizzato per eseguire esperimenti di imaging a due fotoni di permeabilità vascolare. Un soluto fluorescente (TRITC-destrano, MW 155 kD, Stokes raggio ~ 8,5 nm) è stato disciolto in soluzione Ringer BSA 1% e iniettato nella circolazione cerebrale tramite una cannula inserita nella carotide 14. Diversamente iniezioni vena della coda, questa procedura bypassa il cuore e introduce il soluto fluorescente direttamente nel cervello microcircolazione. Figura 8a illustra la qualità di etichettatura dei vasi sangue risultante dall&#39;utilizzo questa procedura. Dopo il continuaperfusione di soluti etichettati nel flusso sanguigno è possibile avere una sequenza al rallentatore di una regione di interesse, come mostrato in Figura 8b. L&#39;intensità di fluorescenza totale della regione di interesse è stata misurata in linea e un modello matematico utilizzato per determinare la permeabilità barriera ematoencefalica per etichetta fluorescente soluti (Figura 8c) 15. La durata media di esperimenti per tutte le età P9-P10 è di 2,3 ± 0,8 ore (n = 3 cuccioli). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Posizione relativa del ventrali strutture neurali del tronco cerebrale rispetto a punti di riferimento vascolare nel ratto neonato. Una vista laterale del cervello. B, vista ventrale del cervello. Principali vasi sanguigni sono mostrati in rosso strutture e neurali di interesse inddicato dal colore piazze. Non sono in scala. AICA = antero-inferiore arteria cerebellare; bas = arteria basilare; ICV = inferiore vena cerebrale; mca = dell&#39;arteria cerebrale media; vert = arteria vertebrale; vsp = ventrale arteria vertebrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Installazione chirurgica. Una chirurgia può essere fatto su una piccola tavola di pane (1) di riposo sulla cima di un piano stabile tavolo. Un pad di riscaldamento (2) e un piccolo ventilatore animale (3) può essere fissato al bordo di pane per facilitare lo spostamento dell&#39;intera preparazione quando necessario. Il piccolo ventilatore animale può essere alimentato da una batteria (4). Un supporto magnetico (5) può essere utilizzato per fissare il cono utilizzato per distribuire l&#39;anestetico. Il cono puòanche proteggere la testa in una posizione stabile. Se l&#39;animale non deve essere trasferito, un micromanipolatore (6) può essere utilizzato per sonde di posizione per elettrofisiologia o esperimenti tracciamento neurali. Una sorgente di luce (7) e uno stereoscopio (non nella foto) sono necessarie per visualizzare le strutture punto di riferimento durante la microchirurgia. B, piccole forbici vengono utilizzati nella fase 1.4. C, forcipe sono utilizzati in operazioni 1.4, 1.6.1, 1.8 e 1.8.1 . d, forbici a molla sono utilizzati in fasi 1.5, 1.6 e 1.7. elettroniche, sezionare scalpello viene utilizzato nella fase 3.1.2. Bar Scala in e = 1 mm, si applica a bd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Esposizione della trachea per l&#39;intubazione.una, L&#39;animale è anestetizzato, posto in posizione prona e fissato con il cono e nastro (linee tratteggiate). b, la pelle è tagliata e posta da parte per esporre lo strato di grasso sottostante. c, Il grasso sovrastante e ghiandole (mostrato in grigio) sono messi da parte per esporre la trachea. Il nastro è utilizzato per proteggere la cute sovrastante (linee tratteggiate). D, La trachea è sezionato dalla muscolatura. Posta, visualizzazione di anelli tracheali indica l&#39;eliminazione di muscolo sovrastante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Intubare l&#39;animale. Una, due fili di sutura (frecce bianche) sono legati intorno alla trachea(T). B, il tubo di intubazione (it) deve essere strettamente collegato al tubo y dell&#39;animale ventilatore. C, A tracheotomia viene fatta tra i due fili di sutura (freccia nera). D, il tubo di ventilazione è inserita e la due fili di sutura sono serrati. Le estremità dei fili sono serrati nuovamente in modo incrociato (indicato da frecce bianche e nere). Posta, Le terminazioni sutura sono legati. F, Le terminazioni di sutura vengono tagliati e l&#39;intubazione è completa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Rimozione della trachea e rendendo la craniotomia. Una, la preparazione è stabilizzato con elastomero (area all&#39;inter<html> de verde linee tratteggiate). b, la trachea è identificato e poi tagli sono fatti prima di separare la trachea lontano dal tubo di intubazione, e poi a tagliare i muscoli mandibolari (linee tratteggiate). c, pulire la superficie del cranio con smussato tecnica per rimuovere il muscolo e utilizzare la carta assorbente per rimuovere il grasso e il sangue. d, Esempio di una zona pulita mostra l&#39;ultima vertebra (v) e la basi-occipitale osso (bo). C&#39;è un divario naturale tra le due ossa (frecce nere). Posta, Utilizzo di un microdrill o detergente ad ultrasuoni sottile il cranio a forma di D rovesciata (frecce nere). Rompere delicatamente il cranio assottigliata e togliere il pezzo di osso. Vascolarizzazione punto di riferimento dovrebbe essere visibile. F, view-Alto ingrandimento dei punti di riferimento vascolari sulla superficie tronco encefalico esposta. Bas = arteria basilare; AICA = arteria cerebellare antero-inferiore. Bar Scala in b = 1 mm, vale a ce.highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Elettroporazione di traccianti neurali. Uno, un elettrodo di vetro contenente il tracciante neurale micro-ruby è stato collocato vicino alla linea mediana (cerchio rosso). Il tracciante è stata elettroporata con 7 secondi di impulsi -5 lungo μA consegnati ogni 14 secondi per 15 minuti. Dopo 1 ora di tempo di recupero della zona in scatola è stato ripreso con un microscopio a due fotoni. P1 ratto cucciolo. B, Exemplar immagine z-stack di etichettatura degli assoni afferenti al MNTB. Frecce indicano i singoli rami collaterali. C, un elettrodo di vetro riempito di micro-rubino è stato posizionato sulla parte superiore del MNTB (cerchio rosso). Il tracciante è stata elettroporazione utilizzando le stesse impostazioni descritte in un. Dopo 1 ora di tempo di recupero della zona in scatola eraripreso con un microscopio a due fotoni. P5 ratto cucciolo. D, Exemplar immagine z-pila di cellule marcate e degli assoni nel MNTB. Le frecce indicano le cellule MNTB singoli. Etichette in B e C indicano ingrandimento dell&#39;obiettivo e apertura numerica, rispettivamente. Bar Scala in una e c = 300 micron; bar scala b = 45 micron; barra della scala in d = 90 micron. AICA = antero-inferiore arteria cerebellare; bas = arteria basilare; r = rostrale; l = laterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Mirata registrazione polytrode a., Polytrode composta da 4 gambi con 4 elettrodi per gambo (cerchi neri). Sono indicate le distanze intra-e inter-gambo tra gli elettrodi. B, </strong&gt; Immagine Esemplare di esperimenti di elettrofisiologia. Un elettrodo di riferimento viene inserito nella cavità bucal e un ploytrode è collegato al headstage. P6 ratto cucciolo. C, maggiore ingrandimento dei punti di riferimento vascolare utilizzati per polytrode targeting. Il polytrode è posizionato in coordinate rostrale-laterali di indirizzare il nucleo mediale del corpo trapezoidale (riquadro rosso). D, POSTHOC analisi istologica dimostra corretta destinazione della polytrode DII rivestite (traccia polytrode è mostrato in rosso). Posta, Exemplar più -unità di registrazione. Ordine Trace è lo stesso ordine di elettrodi in un pannello. All&#39;interno di registrazioni gambo avere lo stesso colore. Bar Scala in e = 5 secondi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg"width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 8. In vivo due fotoni di imaging di microvasi cerebrali. un, immagine 2-D (compresso Z-stack) di vascolare cerebrale dopo perfusione di TRITC-destrano 155 kD nella carotide. La zona ripreso è simile a quello mostrato in figura 7c. 20x/0.5 obiettivo di immersione in acqua. P10 ratto cucciolo. B, regione di interesse (ROI) usati per misurare l&#39;intensità di fluorescenza (riquadro rosso regione chiusa). Il microvasi aveva un diametro di circa 14,2 micron e 182 micron era situato sotto la superficie tronco cerebrale. C, tipica curva di intensità di fluorescenza (valore normalizzato) in funzione del tempo. I 0 è l&#39;aumento graduale di intensità di fluorescenza del ROI quando la soluzione fluoresence appena riempie il lume del vaso. (DI / dt) 0 e 0 vengono utilizzati per determinare la permeabilità dei microvasi per il soluto. La permeabilità al TRITC-destrano 155 kD era pari al 1,5 x 10 -7 cm / sec.Bar Scala in b = 100 micron, si applica a una. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

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A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Un metodo chirurgico è descritto per esporre il cranio ventrale nei ratti neonati. Usando questo approccio, è possibile aprire una craniotomia per eseguire elettrofisiologia acuta e esperimenti di microscopia a due fotoni nel tronco cerebrale dei cuccioli anestetizzati.

Un metodo per fare una craniotomia sul ventrale Cranio di neonato Roditori

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

a-method-to-make-a-craniotomy-on-the-ventral-skull-of-neonate-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  The City University of New York, City College.  Un metodo chirurgico è descritto per esporre il cranio ventrale nei ratti neonati. Usando questo approccio, è possibile aprire una craniotomia per eseguire elettrofisiologia acuta e esperimenti di microscopia a due fotoni nel tronco cerebrale dei cuccioli anestetizzati. 

Video: A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

Un sistema completamente automatizzato ed altamente versatile per test multi-funzioni cognitive e di registrare le attività neuronali in roditori

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Il potere di Interstimulus intervallo per la valutazione di elaborazione temporale in roditori

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement learning. Understanding how the diverse neuronal inputs into the VTA control phasic DA release can provide a better picture of the circuitry that controls reward processing and reinforcement learning. Here, we describe a method that combines intra-VTA cannula infusions of pharmacological agonists and antagonists with stimulation-evoked phasic DA release (combined infusion and stimulation, or CIS) as measured by in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV). Using CIS-FSCV in anesthetized rats, a phasic DA response can be evoked by electrically stimulating the VTA with a bipolar electrode fitted with a cannula while recording in the nucleus accumbens core. Pharmacological agonists or antagonists can be infused directly at the stimulation site to investigate specific VTA receptors&#39; roles in driving phasic DA release. A major benefit of CIS-FSCV is that VTA receptor function can be studied in vivo, building on in vitro studies.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

The goal of this protocol is to directly manipulate ventral tegmental area receptors to study their contribution to subsecond dopamine release.

Infusione e stimolazione combinate con voltammetria ciclica a scansione rapida (CIS-FSCV) per valutare la regolazione del recettore dell'area tegmentale ventrale della dopamina fasica

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...