وأيد هذا العمل عن طريق منحة G12-RR003060 من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR / RCMI، منح SC1HD068129 من المعهد الوطني يونيس شرايفر الصحة والإنسان لتنمية الطفل، ومؤسسة العلوم الوطنية CBET 0754158 وPSC-62337-00 جامعة مدينة نيويورك 40 من جامعة مدينة نيو نيويورك.

بروتوكول التالية يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان التي وضعتها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في كلية مدينة نيويورك. 1. التنبيب الحيوان (10-20 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الجراحة، وإعداد حل قارع الأجراس الثدييات. تجميع الأدوات الجراحية، وسادة التدفئة، والتنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة على مقاعد البدلاء (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس نفاذية حاجز الدم في الدماغ جعل 10 مل من 1٪ مصل بقري الزلال (BSA) في حل قارع الأجراس وحل TRITC-ديكستران 155 دينار في 8 ملغ / مل في 1٪ BSA الحل، الحل فلتر مع 25 ملم حقنة مرشح (0.2 ميكرومتر حجم المسام) وتخزينها في حقنة المغطاة احباط في الظلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان باستخدام isoflurane و. استخدام 5.0٪ لتحريض و1.5-3.0٪ للصيانة. بدلا من مزيج من الكيتامين (41.7 ملغ / كلغ) وزيلازين (2.5 ملغم / كغم من الجسم) يمكن استخدامها. عمق التخدير يمكن فحصها من قبل قرصة أخمص قدميه المنعكس منالأطراف العلوية والسفلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تدار جرعات لاحقة من الكيتامين (41.7 ملغ / كغ من وزن الجسم) وزيلازين (2.3 ملغم / كغم من وزن الجسم) في الزيادات من ⅓ من الحد الأقصى للجرعة لتجنب جرعة زائدة. فمن المستحسن استخدام جهاز التنفس الصناعي القوارض لمواجهة الناجم عن زيلازين الاكتئاب في الجهاز التنفسي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجرو تخدير ملقاة على الجانب الظهري وتأمين رئيسها مع مخروط البلاستيكية المستخدمة لتقديم مخدر (الشكل 3A). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين الحيوان مع شريط لاصق على أطرافه الصدارة والذيل (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بديل لتأمين رأس الجرو هو استخدام لوحة الرأس تعلق على قضيب معدني. ملاحظة: تأكد من تعيين سادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية لتجنب انخفاض حرارة الجسم (الشكل 3A). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص (الشكل 2B) لجعل واحدة طولية وأربعة شقوق جانبية على الجلد المغطي الرقبة (الشكل 3B). باستخدام تقنية حادة، تشريح الجلد ووضعه جانبا باستخدام ملقط (أرقام 2C و 3C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الجلد أسفل باستخدام شريط لاصق. استقرار الرأس في وضع أفقي (الشكل 3C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص الربيع (الشكل 2D) وتقنية حادة، الغدد دفعة وطبقات الدهون جانبا لفضح القصبة الهوائية (الشكل 3C). تحديد موقع الشرايين السباتية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الشرايين السباتية بعيدا عن القصبة الهوائية. ملاحظة: ثقب السباتية يمكن أن يؤدي إلى فقدان كميات هائلة من الدم والموت من الجرو. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص الربيع (الشكل 2D) تشريح العضلات الطولية التي تغطي القصبة الهوائية. قطع العضلات الطولية الموجودة تحت (3D الشكل) القصبة الهوائية. ملاحظة: يجب أن تكون واضحة للعيان حلقات القصبة الهوائية (الشكل 3E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدامملقط (الشكل 2C)، وتعادل قطعتين من الخيط حول القصبة الهوائية. وقطعة واحدة من خياطة تأمين أنبوب التهوية وسيتم استخدام موضوع الثاني لإغلاق منقاري القصبة الهوائية إلى نقطة الإدراج أنبوب التهوية (الشكل 4A). ملاحظة: بلل تتعرض الأنسجة بانتظام مع حل قارع الأجراس لمنع الجفاف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص الربيع (الشكل 2D) إجراء شق على واحدة من حلقات القصبة الهوائية التي تقع بين اثنين من المواضيع وضعت في الخطوة 1.6.1 (الشكل 4C). ملاحظة: تأكد من أن أي سائل يدخل القصبة الهوائية مفتوحة. سوف السوائل في القصبة الهوائية يسبب الاختناق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج أنبوب التنبيب (الشكل 4B) في القصبة الهوائية وتشديد موضوع أقل لضمان الحصول عليها. باستخدام ملقط (الشكل 2C)، وتشديد موضوع العليا لإغلاق الخلفي القصبة الهوائية إلى نقطة الإدراج من أنبوب التنبيب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tighteن وتقليم نهايات اثنين من المواضيع (الشكل 4D-F). ملاحظة: بخار داخل أنبوب التنبيب هو علامة جيدة من السيطرة على تدفق الهواء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور تبديل العرض isoflurane وإلى التنفس الصناعي. ضبط حجم المخ ومعدل التهوية وفقا لوزن الحيوان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الأنسجة المحيطة يتعرض مع المطاط الصناعي (الشكل 5A). الحفاظ على سطح مبلل ونظيفة. </li></ol></li></ol> 2. القصبة الهوائية وإزالة العضلات لفضح الجمجمة (5-10 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص الربيع (الشكل 2D) لقطع القصبة الهوائية المجاورة للأنبوب التهوية. أداء اثنين من التخفيضات على طول الجدار العضلي للالشدق لفضح نهاية الذيلية من الحنك (الشكل 5B). ملاحظة: إذا لزم الأمر، واستخدام cauterizer لوقف النزيف. سوف يسبب النزيف غير المنضبط موت الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيفالمنطقة باستخدام كميات وفيرة من قارع الأجراس الحل (الشكل 5C). تحديد الفجوة بين الفقرات الماضي والعظام باسيل القذالي (الشكل 5D). ملاحظة: إن الفجوة بين عظام الجمجمة معلما مفيدا لتحديد هياكل الدماغ. يقع الزيتون السفلي تحت هذه الفجوة. يقع مجمع الزيتوني متفوقة السمعية تحت العظم القذالي باسيل في الاتجاه منقاري من هذه الفجوة (انظر أيضا الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف المنطقة باستخدام ملقط (الشكل 2C) ومقص الربيع (الشكل 2D). لا ثقب الأوعية الدموية. ملاحظة: إذا لزم الأمر، يكوي لوقف النزيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد منطقة معرضة نظيفة من الدهون والأنسجة العضلية، ينبغي أن الفضاء الفاصل بين عظم القذالي باسيل وفقرة مشاركة تكون مرئية (الشكل 5D). </li></ol></li></ol> 3. القحف (15-30 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام microdrill أو متطرفالمطهر الصوتية. تحديد موقع الجدار الإنسي من الفقاعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقيقة الجمجمة بجعل شكل مقلوب D حتى الشرايين الكامنة مرئية (الشكل 5E). ملاحظة: الشريان القاعدي (BAS) يعمل على رأس خط الوسط الدماغ. الشريان المخيخي السفلي الأمامي (الأيكا) فروع على المستوى الثنائي، ويمكن استخدامها بشكل موثوق كمعلم كما أن لديها موقف ثابت في الحيوانات المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما ضعفت الجمجمة، وكسر برفق باستخدام إزميل تشريح (الشكل 2E). إزالة قطعة العظم مع ملقط (الشكل 2C). بدلا من ذلك، رفع وكسر الجمجمة باستخدام إبرة عازمة. ملاحظة: كرر هذا الإجراء حتى حجم وشكل من حج القحف هو المناسب للتجربة كان مقررا. ينبغي أن وبا والأيكا تكون مرئية من خلال غشاء الجافية (الشكل 5F). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف المنطقة عدة مرات مع حل قارع الأجراس الطازجة. باستخدام ماصة سنوياس يجف سطح غشاء الجافية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، واستخدام إبرة خياطة لإزالة غشاء الجافية دون تشريد أو كسر وبا الشرايين معلما والأيكا. ملاحظة: عند ثقب الجافية السائل النخاعي سوف تتدفق. تنظيف المنطقة مع حل قارع الأجراس والحفاظ مبلل في كافة مراحل التجربة. </li></ol></li></ol> 4. الكهربية التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد polytrode وفقا لتصميم التجربة (الشكل 7A). استخدام الفرشاة الجميلة لمعطف polytrode مع الجاذبة. نقل الحل الجاذبة في أنبوب microcentrifuge 1 مل، وتراجع الفرشاة في الحل وضرب بلطف وpolytrode تحت التوجيه البصري (أي باستخدام المجسام). تبدأ في غيض من التحقيق ومواصلة بعناية حتى يتم المغلفة جميع أقطاب موحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القطب الأرض داخل تجويف الفم. تحميل polytrode في 7B حامل القطب (الشكل </stronز&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مكبر للصوت وتحقق من أن كافة الاتصالات تعمل بشكل جيد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القطب فوق بس في نقطة فرع الأيكا (موقف صفر). نقل الكهربائي إلى نقطة الهدف المطلوب باستخدام منقاري الأطراف تنسيق (الشكل 7C) المناسبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطب كهربائي على سطح الدماغ ونقلها إلى العمق المطلوب في الخطوات من 5-10 ميكرون. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تسجيل وفقا لتصميم التجريبية. حفظ البيانات لمزيد من التحليل. </li></ol> 5. ثنائي الفوتون التصوير التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على المجهر. تعيين الطول الموجي الإثارة واستخدام عامل تصفية الانبعاثات المناسبة. الإثارة في 800 نانومتر و607 ± 45 نانومتر الفرقة تمرير تصفية الانبعاثات تعمل بشكل جيد لتصوير TRITC-ديكستران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد اليمين أو اليسار الشريان السباتي. باستخدام تقنية كليلة تشريح الشريان السباتي من الأنسجة الضامة المجاورة أو الأعصاب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقاء وعقد السباتيالشريان مع مرقئ. التعادل ثلاث قطع من خياطة حول الشريان السباتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشديد موضوع أقرب إلى الجانب القلب لوقف تدفق الدم وترك الأخريين المواضيع فضفاضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص غرامة لإجراء قطع صغير في زاوية 45 درجة على الشريان السباتي بين موضوع وموضوع ربط فضفاضة المقبل. ملاحظة: تنظيف الدم مع ورقة ماصة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية الشريان السباتي. إدراج أنابيب تمتلئ حل TRITC-ديكستران في خفض على الشريان السباتي حوالي 5 ملم الموجهة نحو عميق رأس الجرو. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشديد الأخريين المواضيع حول الشريان لعقد أنابيب والشريان معا. تشديد المواضيع، وتقليم والمطاط الصناعي إضافة إلى مزيد من الاستقرار. ملاحظة: يتم توصيل الطرف الآخر من الأنبوب مع حقنة تحتوي على محلول TRITC-ديكستران (المعد في الخطوة 1.1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح حقنة على ضخ حقنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعةسرعة في الشريان السباتي معدل تدفق الدم من الجرو. بدوره على ضخ حقنة لبضع ثوان وتحقق يدويا أن محلول الصبغة يمكن حقنه في الشريان السباتي. ملاحظة: على افتراض أن معدل تدفق الدم في الشريان السباتي من الفئران الكبار (240-280 ز) حوالي 3 مل / دقيقة 14، ومعدل تدفق الدم عن الجرو الفئران (على سبيل المثال P10 الجرو وزنها 15-25 غ) ويمكن حساب ل مجموعة ،16-،3 مل / دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان تحت المجهر الهدف. حقن ديكستران فلوري في مجرى الدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مجالات الاهتمام على الدماغ البطني مع الهدف الهواء 5X. التبديل إلى الهدف 20X 40X أو (الغمر بالماء، NA = 0.5 أو 0.8، على التوالي) لتركيز المنطقة ذات الاهتمام (ROI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التصوير وضبط المعلمات الحصول على الصور (مثل التعرض الوقت، قوة الليزر، وزيادة كاشف) حتى كثافة مضان في الأوعية الدموية من العائد على الاستثمار هو الأمثل (أيليس منخفضا جدا ولكن ليس لالمشبعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على ضخ حقنة لحقن محلول الصبغة في الشريان السباتي والحصول على سلسلة زمنية في المستوى البؤري ثابت. </li></ol></li></ol> 6. رعاية الحيوان الإجراء التالي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا هو إجراء المحطة. في نهاية التجربة على الحيوانات يجب أن يتم التخلص مع جرعة زائدة من بنتوباربيتال (100 ملغ / كغ، والحقن داخل الصفاق) أو أي وسيلة أخرى من القتل الرحيم التي وافقت عليها المبادئ التوجيهية القتل الرحيم الرابطة الأميركية للطب البيطري. ملاحظة: الإرواء من خلال القلب مع حل قارع الأجراس يتبع مع ​​حل تثبيتي ينصح لمزيد من التحليل النسيجي. </li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Sigler, A., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+imaging+of+fine+structure+in+the+rodent+brain:+before,+during,+and+after+stroke.">In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke.</a> Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).</li><li>Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+blood-brain+barrier+solute+permeability+and+brain+transport+by+multiphoton+microscopy.">Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy.</a> ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).</li><li>Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+study+of+superior+olivary+nuclei.">Microelectrode study of superior olivary nuclei.</a> Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).</li><li>Goldberg, J., Brown, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+binaural+neurons+of+dog+superior+olivary+complex+to+dichotic+tonal+stimuli:+some+physiological+mechanisms+of+sound+localization.">Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization.</a> J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).</li><li>Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+auditory+units+in+the+superior+olivary+complex+I:+responses+to+sounds+and+classifications+based+on+physiological+properties.">Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties.</a> Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).</li><li>Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recordings+from+cat+trapezoid+body+and+HRP+labeling+of+globular+bushy+cell+axons.">Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons.</a> J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).</li><li>Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns.">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li><li>Rodr&#237;guez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+precision+of+the+mouse+calyx+of+Held+synapse.">Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse.</a> J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).</li><li>Tritsch, N. X., Rodr&#237;guez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+action+potentials+in+hair+cells+pattern+auditory+neuron+activity+before+hearing+onset.">Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset.</a> Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).</li><li>Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Kv+channel+expression+and+neuronal+excitability+in+rat+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+maintained+in+organotypic+culture.">Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture.</a> J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).</li><li>Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., R&#252;bsamen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+postnatal+development+of+spontaneous+and+acoustically+evoked+discharge+activity+of+principal+cells+of+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body:+an+in+vivo+study+in+mice).">Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice).</a> J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Villal&#243;n, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., G&#243;mez, B., Di&#233;guez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carotid+blood+flow+in+anesthetized+rats:+effects+of+carotid+ligation+and+anastomosis.">Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis.</a> Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).</li><li>Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+the+measurement+of+solute+permeability+of+rat+pial+microvessels.">Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels.</a> Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Ha&#252;sser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الوقت أمر بالغ الأهمية. يجب أن يكون الباحث من ذوي الخبرة قادرة على استكمال هذا البروتوكول في 1 ساعة (الخطوات 1-3). في أوقات محددة لمختلف الخطوات تفترض المتوسط ​​إلى مستوى عال من الخبرة. القصبة الهوائية المناسبة وفي الوقت المناسب والتنبيب حاسمة، لأن ضعف السيطرة التهوية يمكن أن يؤدي إلى الاختناق والموت للحيوان. إزالة حذرا من أنسجة العضلات والدهون هو أيضا مهم جدا لأن الأخطاء يمكن أن يؤدي إلى نزيف غير المنضبط وفاة الحيوان. وبالمثل، عند إعداد الشريان السباتي للقنية الإدراج، ويحتاج المرء لتشديد وقطع الشريان بعناية، وإذا كانت عقدة يصبح موضوع فضفاض النزيف غير المنضبط سوف تأخذ مكان. أخيرا، ينبغي بذل حج القحف بعناية، دون تعطيل المعالم الأوعية الدموية. إزالة الإهمال طبقة السحائي الخارجية (الجافية) يمكن أن يؤدي إلى نزيف حاد وتلف من إمدادات الشرياني. ويتم اختيار إعدادات التهوية وفقا لعمر الحيوان.توفر معظم الموردين التجاريين معلومات مفيدة حول هذه الإعدادات. والتجارب في الفئران الأكبر سنا من P15 تتطلب استخدام جهاز التنفس الصناعي الحيوانات الكبيرة. الحيوانات البالغة قد لا تحتاج تهوية إذا تخدير مع الكيتامين / زيلازين، ولكن ينصح التنبيب لتجنب السوائل دخول القصبة الهوائية. واحد القيد الرئيسي من هذا البروتوكول هو أن التجارب لا يمكن إلا أن يؤديها بشكل حاد. في المختبر لدينا قمنا بإجراء التجارب دائم بين سنتين وحتى عشر ساعات. والقيد الثاني هو أن التجارب يجب أن تتم تحت التخدير. لذا، فإن اختيار مخدر هو متغير المهم النظر في تخطيط وتصميم التجارب. وثمة مسألة ذات الصلة هو أن الحيوانات الوليد يمكن أن تكون حساسة بشكل خاص لجرعة زائدة. على سبيل المثال، اذا كان اختيار الكيتامين / زيلازين المزيج، وحساب الجرعة على أساس الوزن الجرو وإدارة المخدرات في ⅓ من الحد الأقصى للحجم. التحقق من حالة الحيوان كل 5-10 دقائق بواسطة إصبع قرصة صesponse. إذا باستخدام isoflurane و، وهناك حاجة أيضا الاحتياطات للحفاظ على بيئة آمنة للمحقق (التهوية المناسبة، والمرذاذ معايرتها). وstereomicroscope يمكن تركيبه على حامل مرنة لضبط زاوية عرض وتسهل إزالة مساحة لوضع الأقطاب ونقل الحيوان إلى مجهر ثنائي الفوتون. استخدام بطارية لتشغيل جهاز التنفس الصناعي يمكن أن تسهل نقل الحيوانية والحد من القطع الأثرية الكهربائية خلال التجارب الكهربية. تحقيقا لهذه الغاية، اللوح الصغيرة (7.5 × 12 بوصة) يمكن استخدامها لتجميع معا التنفس الصناعي، وسادة التدفئة وتخدير الحيوانات (الشكل 2A). وهناك تعديل مفيدة ومهمة لهذا الإعداد هو إضافة جهاز لرصد المؤشرات الحيوية أثناء الجراحة. على مقياس التأكسج أو الأجهزة التناظرية أخرى يمكن استخدامها تبعا للميزانية المختبر. وقد استخدم هذا البروتوكول مع الكهربية والتصوير التقىhods، بما في ذلك تسجيلات المشبك التصحيح 8،10،11 والتسجيلات polytrode (الشكل 7)، واثنين من الفوتون التصوير 9 (أرقام 6 و 8). واحد من شأنه تطبيق محتملة في المستقبل يكون الجمع بين هذه الأساليب لاستهداف الخلايا fluorescently المسمى لتسجيل الكهربية 16. تطبيقات التصوير الجديدة يمكن أن تشمل أيضا 2-D أو 3-D السلسلة الزمنية باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. على سبيل المثال، وذلك باستخدام بلعة تحميل مؤشرات الكالسيوم لدراسة نشاط الدماغ العصبية والسكان الخلية الدبقية. كما هو موضح في الشكل 8، حقن محلول الصبغة في الدورة الدموية من خلال الشريان السباتي يمكن استخدامها لتوليد الصور عالية التباين من الأوعية الدموية في الدماغ. كما يملأ صبغ مضان التجويف microvessel وينتشر في الأنسجة المحيطة بها، ويمكن استخدامه ليس فقط لحساب نفاذية المذاب واضح من حاجز الدم في الدماغ ولكن أيضا COEF المذاب نشرficient في أنسجة المخ 3. أحد الأسباب الرئيسية لحقن المواد المذابة fluorescently المسمى عبر الشريان السباتي هو أن محلول الصبغة يمكن أن تذهب مباشرة إلى microvessels في الدماغ من دون الذهاب الى قلبية للمرة الأولى كما هو الحال في حقن الوريد الذيل. هذا يجلب اثنين على الأقل من المزايا. واحد هو أن تركيز صبغ مضان في التجويف microvessel يمكن أن يكون ثابتا عمليا إذا تم إصلاح معدل نضح في موقع القسطرة. وهذا يضمن تحديد دقيق للنفاذية حاجز الدم في الدماغ. آخر هو أنه إذا كان يتم تضمين وكيل الاختبار في الإرواء، وسوف تذهب مباشرة إلى حاجز الدم في الدماغ دون أن تضعف أو جنبا إلى جنب مع عوامل أخرى من الدورة الدموية في الجسم. التجارب الجديدة أيضا قد تستفيد من الحيوانات المعدلة وراثيا مع صحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا. وهذا من شأنه توفير ميزة أن تحقيقات الفلورسنت لن تحتاج إلى تحميل في الموقع (إلا إذا كان تصميم التجربةينص على خلاف ذلك)، وتوفير الوقت والسماح لمزيد من الاستعدادات سليمة (مثل النافذة في الجمجمة 17) ربما. أخيرا، والتجارب ويمكن أن يتم في مناطق الدماغ الأخرى مثل الزيتون أو أدنى نواة المحرك الوجه. سوف المعرفة حول التشريح العصبي وتطوير السكان الخلوية محددة في نوع معين من المهم لتحقيق هذه الغاية، لا سيما المعالم التشريحية قد تتغير كما تنمو الحيوانات (الشكل 1). ونحن نأمل أن يكون هذا البروتوكول تشجع الآخرين لدراسة هياكل الدماغ البطني باستخدام الكهربية في الجسم الحي وأساليب التصوير.

استخدام حج القحف في تركيبة مع التصوير مضان والتقنيات الكهربية يسمح تدفق الدم الرصد، نفاذية حاجز الدم في الدماغ وقياس نشاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الحيوانات الحية 1-3. وقد استخدمت العديد من المختبرات هذا النهج إلى توفير نظرة ثاقبة فسيولوجيا الدماغ في ظروف صحية والمرض، ولكن لا تزال هناك فجوات في فهمنا للكيفية التي تنشأ هذه العمليات خلال التنمية. وعلاوة على ذلك، ركزت معظم الدراسات على مناطق الدماغ التي يسهل الوصول إليها من السطح الظهري من الجمجمة، بحيث هياكل الدماغ البطني مع الأدوار الفسيولوجية المختلفة وقد تم دراسة معظمها باستخدام فيفو السابقين النهج. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لتوفير وسيلة لفتح حج القحف على الجمجمة بطني من القوارض. وقد تم تكييف هذا النهج من الدراسات الكلاسيكية التي أجريت في الثدييات الكبيرة مثل الكلاب والقطط لريكو الفسيولوجيا العصبية الحسيةrdings من الدماغ السمعية 4-7. في هذا البروتوكول ومع ذلك، هناك التحدي الرواية من تنفيذ الإجراء في الحيوانات الوليد. باستخدام المعالم الأوعية الدموية، وقد استخدم هذا البروتوكول تكييفها سابقا لدراسة الدماغ السمعية من الفئران حديثي الولادة، والفئران الكبار ومناطق الدماغ الأخرى مثل الزيتون أدنى 8-11 (الشكل 1). والميزة الرئيسية لحج القحف بطني على الطرق القائمة لدراسة نوى الدماغ البطني هو أنه يوفر الوصول المباشر إلى هياكل الفائدة في الحيوانات الحية. على سبيل المثال، يتم ترجمة الخلايا السمعية من مجمع الزيتوني متفوقة بضع عشرات من ميكرومتر من سطح الدماغ، وهو أمر مهم لوضع المستهدفة من تحقيقات واستخدام النهج التصوير ثنائي الفوتون في عمق التصوير التي يمكن أن تقتصر على 0.5 مم تشتت الضوء وامتصاص الأنسجة. يوفر حج القحف بطني أيضا إعداد مع الوصلات العصبية سليمة نسبيا، ذوي الخوذات البيضاءتتعطل معنوى في الاستعدادات شريحة الحادة وعضوي النمط 12. وعلى النقيض من البروتوكولات الأخرى لفي التجارب المجراة الفسيولوجيا العصبية 13، ويمكن الجمع بين نهج بطني مع تسجيل متعدد القطب وأساليب التصوير التي توفر معلومات حول الفرق الخلوية (أرقام 6 و 7). أخيرا، في تركيبة مع هذا البروتوكول المذاب fluorescently المسمى يمكن حقنها في الأوعية الدموية لقياس التغيرات في نفاذية حاجز الدم في الدماغ إلى المذاب (الشكل 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Absorbant pads</td>
			<td style="width:71px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">Sugi 31603</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:216px;">Cautery</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">GEM&#160;5917</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1287-500MG</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting Chisel</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">10095-12</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DiI</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22885</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Elastomer</td>
			<td style="width:71px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">KWIK-SIL</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14060-09</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11027-12,11617-12, 11616-16</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15009-08</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:71px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">40-90-2</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Intubation tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">BIO CO-KIT</td>
			<td style="width:167px;">Choose age appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Light source</td>
			<td style="width:71px;">Spach Optics</td>
			<td style="width:119px;">Schott Ace illuminator&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Micro drill</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">MD-1200&#160;120V</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paper tape</td>
			<td style="width:71px;">Walgreens</td>
			<td style="width:119px;">Generic brand</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:216px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28145-483</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">52459-008</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZ61</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture</td>
			<td style="width:71px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">Prolene 86979</td>
			<td style="width:167px;">6-0 size</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tubing</td>
			<td style="width:71px;">Braintree Scientific, INC</td>
			<td style="width:119px;">Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120</td>
			<td style="width:167px;">Other options depending on pup&#8217;s age</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vaporizer (isoflurane)</td>
			<td style="width:71px;">Vetequip Incorporated</td>
			<td align="right" style="width:119px;">911103</td>
			<td style="width:167px;">Other options may be available from different companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ventilator (minivent)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">730043</td>
			<td style="width:167px;">Use for P0-P12 rats</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to make a craniotomy on the ventral skull of neonate rodents

استخدام حج القحف لفي التجارب المجراة يوفر فرصة للتحقيق في ديناميات العمليات الخلوية المتنوعة في أدمغة الثدييات في مرحلة البلوغ وخلال التنمية. على الرغم من أن معظم المجراة نهج استخدام حج القحف لدراسة مناطق الدماغ التي تقع على الجانب الظهري والمناطق جذع الدماغ مثل الجسر، وتقع على الجانب البطني تبقى سلوكه نسبيا. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لتسهيل الوصول إلى هياكل الدماغ البطني بحيث يمكن دراستها في الجسم الحي باستخدام الكهربية وأساليب التصوير. يسمح هذا النهج دراسة التغيرات الهيكلية في محاور عصبية طويلة المدى، وأنماط من النشاط الكهربائي في واحد ومجموعات من الخلايا، والتغيرات في نفاذية حاجز الدم في الدماغ في الحيوانات الوليد. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تستخدم في الغالب لدراسة الدماغ السمعية في الفئران حديثي الولادة، ويمكن بسهولة أن تتكيف للدراسات في أنواع القوارض الأخرى مثل الفئران حديثي الولادة، رودين الكبارالخبر ومناطق الدماغ الأخرى.

التثقيب الكهربائي من استشفاف العصبية نواة الإنسي من الجسم شبه منحرف (MNTB) هي مجموعة من الخلايا في مجمع الزيتوني المتفوقة التي تمت دراستها سابقا باستخدام هذا البروتوكول. على سبيل المثال، ماصات المشبك التصحيح يمكن استخدامها ل electroporate استشفاف العصبية (الشكل 6) 9. عندما توضع ماصات بالقرب من خط الوسط كما هو مبين في الشكل 6A، والنتيجة هي أن متصالبة محاور عصبية وارد وصفت. مجهر ثنائي الفوتون مجهزة الفتحة العددية عالية الهدف غمر المياه يمكن استخدامها لصورة ألياف الوصول إلى MNTB، بما في ذلك فروع ضمانات دقيقة جدا (السهام في الشكل 6B). ويمكن أيضا أن يتم تسليم استشفاف العصبية إلى MNTB مباشرة، كما هو مبين في الشكل 6C. والنتيجة هي وضع العلامات الخلايا MNTB ومحاور عصبية وارد، كما يمكن التقدير من قبل التصوير مع الفتحة العددية الهدف غمر المياه أقل (الشكل 6D). مميزة العين من استخدام الهدف التكبير أقل هو أن أوسع مجال الرؤية يمكن فحصها، وعلى الرغم من هذه النتائج إلى انخفاض في القرار المكانية ويرجع ذلك إلى انخفاض الفتحة العددية الهدف، وخلايا MNTB الفردية يمكن تمييزها جيدا (الأسهم في الشكل 6D) . متوسط ​​مدة هذه التجارب للأعمار P1-P5 هو 3.1 ± 1.4 ساعة (ن = 22 الجراء). التسجيلات الكهربية عفوية اطلاق انفجر هو شكل من أشكال النشاط الكهربائي في الخلايا التنموية وحظ MNTB واحد قبل بداية سماع 11،13. باستخدام هذا البروتوكول الجراحية فمن الممكن أيضا لاستهداف صفائف multielectrode (polytrodes) إلى MNTB (الشكل 7A-ب). والنتيجة هي تسجيل النشاط العفوي في الفرقة الخلايا MNTB. ويبين الشكل 7E تسجيل polytrode ممثل من الفئران P6. في هذه التجربة، والمغلفة polytrode مع الجاذبة صبغ lipophylic باستخدامالفرشاة رقيقة (انظر الخطوة 4.1). بعد أداء وتسجيل ومعالجة المخ للتحليل النسيجي، وكان يستخدم موقع المسار polytrode الجاذبة المسمى لتأكيد السليم استهداف لMNTB (الشكل 7D). متوسط ​​مدة التجارب للأعمار P1-P6 هو 2.0 ± 0.7 ساعة (ن = 33 الجراء). قياس نفاذية microvessel ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لأداء تجارب التصوير ثنائي الفوتون من نفاذية الأوعية الدموية. A المذاب الفلورسنت (TRITC-ديكستران، MW 155 دينار كويتي، ستوكس دائرة نصف قطرها 8.5 نانومتر ~) تم حله في 1٪ BSA قارع الأجراس الحل وحقنها في الدورة الدموية الدماغية من خلال قنية إدراجها في الشريان السباتي 14. على عكس الذيل حقن الوريد، وهذا الإجراء يتجاوز القلب ويدخل المذاب الفلورسنت مباشرة في دوران الأوعية الدقيقة في الدماغ. ويوضح الشكل 8A نوعية وسم الأوعية الدموية الدم الذي ينتج من استخدام هذا الإجراء. بعد المستمرنضح من المواد المذابة وصفت في مجرى الدم فمن الممكن الحصول على تسلسل الوقت الفاصل بين المنطقة ذات الاهتمام، كما هو مبين في الشكل 8B. وقد تم قياس مجموع كثافة مضان في المنطقة ذات الاهتمام حاليا ونموذج رياضي يستخدم لتحديد نفاذية حاجز الدم في الدماغ لfluorescently المسمى المواد المذابة (الشكل 8C) 15. متوسط ​​مدة التجارب للأعمار P9 P10-2.3 ± 0.8 ساعة (ن = 3 الجراء). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. الموقع النسبية من بطني الهياكل العصبية الدماغ فيما يتعلق معالم الأوعية الدموية في الفئران حديثي الولادة. لذلك، عرض جانب من الدماغ. ب، عرض البطنية من الدماغ. الأوعية الدموية الرئيسية وتظهر في الهياكل الحمراء والعصبية من الفائدة دائرة الهجرة والجنسيةicated بمربعات ملونة. لا يوجه إلى مقياس. الأيكا = الأمامي الشريان المخيخي السفلي؛ وبا = الشريان القاعدي؛ ICV = الوريد الدماغي السفلي؛ MCA = الشريان الدماغي الأوسط؛ فير = الشريان الفقري؛ VSP = الشريان الفقري بطني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. الإعداد الجراحية. لذلك، ويمكن أن يتم جراحة على لوحة الخبز الصغيرة (1) ويستريح على قمة أعلى الجدول مستقرة. ويمكن للسادة التدفئة (2) وجهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة (3) يتم تثبيتها على متن الخبز لتسهيل تحريك إعداد بأكمله عند الحاجة. التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة يمكن أن تعمل بالطاقة بواسطة بطارية (4). حامل المغناطيسي (5) يمكن استخدامها لتأمين مخروط الأنف تستخدم لتوصيل المخدر. مخروط الأنف يمكنأيضا مساعدة في تأمين الرأس في وضع مستقر. إذا لا يحتاج الحيوان الذين سيتم نقلهم، ومياداة مجهرية (6) يمكن استخدامها لتحقيقات المركز لالكهربية أو تتبع التجارب العصبية. هي مصدر الضوء (7) والمجسام (ليس في الصورة) اللازمة لتصور هياكل مهمة خلال المجهرية. ب، وتستخدم مقص صغير في الخطوة 1.4. ج، تستخدم الملقط في الخطوات 1.4، 1.6.1، 1.8 و 1.8.1 د، وتستخدم مقص الربيع في خطوات 1.5، 1.6 و 1.7. ه، ويستخدم تشريح إزميل في الخطوة 3.1.2. شريط النطاق في البريد = 1 مم، ينطبق على دينار بحريني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. فضح القصبة الهوائية لالتنبيب.لذلك، يتم تخدير الحيوان، وضعت في وضعية الانبطاح والمضمون مع مخروط الأنف والشريط (الخطوط المتقطعة). ب، يتم قطع الجلد وتوضع جانبا لفضح الكامنة وراء طبقة الدهون. ج، والدهون والغدد المغطي (كما هو موضح في الرمادي يتم دفع) جانبا لفضح القصبة الهوائية. ويستخدم الشريط لتأمين الجلد المغطي (الخطوط المتقطعة). د، يتم تشريح القصبة الهوائية من عضلات. ه، والتصور من حلقات القصبة الهوائية يشير إلى إزالة ناجحة من العضلات الفوقية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig3highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. تنبيب الحيوان. لذلك، وترتبط اثنين المواضيع خياطة (السهام البيضاء) حول القصبة الهوائية(ر). ب، وأنبوب التنبيب (عليه) يجب ان تكون مرتبطة بإحكام إلى أنبوب ذ الحيوان التنفس الصناعي. ج، ويرصد القصبة الهوائية بين المواضيع خياطة اثنين (السهم الأسود). د، يتم إدراج أنبوب التهوية و يتم شد الخيط اثنين من المواضيع. يتم شد نهايات الخيوط مرة أخرى بطريقة عبرت (المشار إليها السهام البيضاء والسوداء). ه، وترتبط النهايات خياطة. و، وقلص النهايات خياطة والتنبيب كاملة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. إزالة القصبة الهوائية وجعل حج القحف. لذلك، يتم إعداد استقر مع الإعلاميين المطاط الصناعي (منطقة<html> دي أخضر متقطع خطوط). ب، يتم التعرف على القصبة الهوائية ثم يتم إجراء تخفيضات الأولى لفصل القصبة الهوائية بعيدا عن أنبوب التنبيب، ثم إلى قطع عضلات الفك السفلي (الخطوط المنقطة). ج، تنظيف سطح الجمجمة باستخدام حادة تقنية لإزالة العضلات واستخدام ورقة ماصة لإزالة الدهون والدم. د، مثال لمنطقة نظيفة يبين فقرات الماضي (الخامس) وباسيل القذالي العظام (بو). هناك فجوة الطبيعية بين عظام اثنين (الأسهم السوداء). ه، وذلك باستخدام الموجات فوق الصوتية microdrill أو المطهر رقيقة الجمجمة في شكل مقلوب D (الأسهم السوداء). كسر بلطف الجمجمة ضعيفة وإزالة قطعة من العظام. وينبغي أن يكون معلما الأوعية الدموية مرئية. و، بترف، التكبير من معالم الأوعية الدموية على سطح الدماغ عرضة للخطر. وبا = الشريان القاعدي؛ الأيكا = الشريان المخيخي الأمامي السفلي. شريط النطاق في ب = 1 مم، ينطبق على م.highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. التثقيب الكهربائي من استشفاف العصبية. لذلك، وضعت والزجاج الكهربائي التي تحتوي على العصبية التتبع الدقيقة روبي بالقرب من خط الوسط (دائرة حمراء). تم electroporated التتبع باستخدام تسليمها الثاني 7 نبضات طويلة -5 أمبير كل 14 ثانية لمدة 15 دقيقة. بعد 1 ساعة من وقت الشفاء كان تصوير المنطقة محاصر مع مجهر ثنائي الفوتون. الفئران P1 الجرو. ب، نموذج الصورة ض المكدس لوضع العلامات محوار وارد في MNTB. تشير الأسهم إلى فروع جانبية الفردية. ج، كان وضعه والزجاج الكهربائي مليئة روبي الصغرى على رأس MNTB (دائرة حمراء). تم electroporated التتبع باستخدام نفس الإعدادات الموضحة في. بعد 1 ساعة من وقت الشفاء كانت المنطقة محاصرتصوير مع مجهر ثنائي الفوتون. الجرو الفئران P5. د، نموذج الصورة ض المكدس من الخلايا والمحاور وصفت في MNTB. السهام تشير الخلايا MNTB واحد. التسميات في b و c تشير التكبير موضوعية والفتحة العددية، على التوالي. شريط النطاق في وج = 300 ميكرومتر؛ شريط النطاق في ب = 45 ميكرومتر؛ شريط النطاق في د = 90 ميكرون. الأيكا = الأمامي الشريان المخيخي السفلي؛ وبا = الشريان القاعدي؛ ص = منقاري؛ ل = الجانبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig6highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. المستهدفة تسجيل polytrode. لذلك، Polytrode يتكون من 4 السيقان مع 4 أقطاب في عرقوب (الدوائر السوداء). يشار إلى مسافات داخل وبين ساق بين الأقطاب. ب، </stroنانوغرام&gt; صورة نموذج من التجربة الكهربية. يتم إدخال القطب المرجع في تجويف bucal وتوصيل ploytrode إلى headstage. الجرو الفئران P6. ج، عرض التكبير العالي من معالم الأوعية الدموية تستخدم لاستهداف polytrode. يتم وضع polytrode باستخدام الإحداثيات منقاري الأطراف لاستهداف نواة الإنسي من الجسم شبه منحرف (مربع أحمر). د، يوضح Posthoc التحليل النسيجي الاستهداف الصحيح للpolytrode الجاذبة المغلفة (يظهر polytrode المسار باللون الأحمر). الإلكترونية، نموذج متعدد وحدة التسجيل. أجل التتبع هو نفس النظام الكهربائي في لوحة أ. ضمن التسجيلات عرقوب لها نفس اللون. شريط النطاق في البريد = 5 ثوان. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig7highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg"العرض = &quot;600&quot; /&gt; الرقم 8. في الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير من microvessels الدماغ. لذلك، 2-D صورة (انهارت Z-كومة) من الأوعية الدموية في المخ بعد نضح من TRITC-ديكستران 155 دينار كويتي في الشريان السباتي. منطقة تصويرها هي مماثلة لتلك المبينة في الشكل 7C. 20x/0.5 الهدف الغمر بالماء. الجرو الفئران P10. ب، المنطقة ذات الاهتمام (ROI) تستخدم لقياس كثافة مضان (إطار أحمر المنطقة المغلقة). كان microvessel يبلغ قطرها 14.2 ميكرون ~ وكانت تقع 182 ميكرومتر تحت سطح الدماغ. ج، منحنى نموذجي من كثافة مضان (القيمة تطبيع) بوصفها وظيفة من الوقت. I 0 هي الزيادة خطوة في كثافة مضان في العائد على الاستثمار عندما حل fluoresence يملأ التجويف فقط حتى السفينة. (DI / ت) 0 وأنا تستخدم 0 لتحديد نفاذية microvessel إلى المذاب. تم حساب نفاذية لTRITC-ديكستران 155 دينار لتكون 1.5 × 10 -7 سم / ثانية.شريط النطاق في ب = 100 ميكرون، ينطبق على. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51350/51350fig8highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents at JoVE.com

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

ووصف الطريقة الجراحية لفضح الجمجمة البطني في الفئران حديثي الولادة. باستخدام هذا النهج فمن الممكن لفتح حج القحف لأداء الكهربية الحادة واثنين من الفوتون المجهري التجارب في الدماغ من الجراء تخدير.

وهناك طريقة لجعل حج القحف على بطني من الجمجمة الوليد القوارض

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

a-method-to-make-a-craniotomy-on-the-ventral-skull-of-neonate-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  The City University of New York, City College.  ووصف الطريقة الجراحية لفضح الجمجمة البطني في الفئران حديثي الولادة. باستخدام هذا النهج فمن الممكن لفتح حج القحف لأداء الكهربية الحادة واثنين من الفوتون المجهري التجارب في الدماغ من الجراء تخدير. 

Video: A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

كله من جبل إعداد الكبار ذبابة الفاكهة الحبل الاعصاب الاماميه للحقن صبغ الألياف العملاق

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be investigated in a single task sequence. The unique feature of this system is a custom-made, acoustically transparent chamber that eliminates many of the issues associated with auditory cue control in most commercially available chambers. The ease with which operant devices can be added or replaced makes this system quite versatile, allowing for the implementation of a variety of auditory, visual, and olfactory behavioral tasks. Automation of the system allows fine temporal (10 ms) control and precise time-stamping of each event in a predesigned behavioral sequence. When combined with a multi-channel electrophysiology recording system, multiple cognitive brain functions, such as motivation, attention, decision-making, patience, and rewards, can be examined sequentially or independently.

In this report, we present a fully automated and highly versatile system capable of simultaneously testing multi-cognitive behaviors and recording neuronal activities for rodents.

نظام آلي بالكامل وذات استخدامات متعددة لاختبار متعدد الوظائف المعرفية وتسجيل أنشطة الخلايا العصبية في القوارض

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

الليزر التقاط تسليخ مجهري - تظاهرة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية ومنطقة بطني السقيفية بكل

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

قوة إينتيرستيمولوس الفاصل الزمني للتقييم لتجهيز الزمانية في القوارض

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

في التصوير في الجسم من نقل السائل الدماغي الشوكي من خلال جمجمة الماوس سليمة باستخدام التنظير الكلي الفلوري

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry (CIS-FSCV) to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement learning. Understanding how the diverse neuronal inputs into the VTA control phasic DA release can provide a better picture of the circuitry that controls reward processing and reinforcement learning. Here, we describe a method that combines intra-VTA cannula infusions of pharmacological agonists and antagonists with stimulation-evoked phasic DA release (combined infusion and stimulation, or CIS) as measured by in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV). Using CIS-FSCV in anesthetized rats, a phasic DA response can be evoked by electrically stimulating the VTA with a bipolar electrode fitted with a cannula while recording in the nucleus accumbens core. Pharmacological agonists or antagonists can be infused directly at the stimulation site to investigate specific VTA receptors&#39; roles in driving phasic DA release. A major benefit of CIS-FSCV is that VTA receptor function can be studied in vivo, building on in vitro studies.

Combined Infusion and Stimulation with Fast-Scan Cyclic Voltammetry CIS-FSCV to Assess Ventral Tegmental Area Receptor Regulation of Phasic Dopamine

The goal of this protocol is to directly manipulate ventral tegmental area receptors to study their contribution to subsecond dopamine release.

ضخ جنبا إلى جنب والتحفيز مع المسح السريع قياس فولتامتري الحلقي (CIS-FSCV) لتقييم تنظيم مستقبلات منطقة تيغمنتال البطنية من الدوبامين التدريجي

Phasic dopamine (DA) release from the ventral tegmental area (VTA) to the nucleus accumbens plays a pivotal role in reward processing and reinforcement ...