הפרוטוקול שלנו מאפשר הדמיה של חילוף חומרים מרחבי של אינטראקציות מיקרוביאליות המתרחשות במהלך זיהום. פיתחנו תהליך עבודה זה של ספקטרומטריית מסות הדמיה עבור תרביות משותפות של חיידקים הגדלים על מודלים של אגר ורקמות. ניתוח מצעים לא מסורתיים כגון תרביות חיידקים הגדלים על אגר מציב אתגרים רבים.
באמצעות הפרוטוקול שלנו, ניתן לייבש דגימות חיידקים כראוי כדי להקל על יישום מטריצת MALDI בניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה עוקבת. שיטה זו ישימה באופן נרחב למגוון מטבוליטים, פתוגנים מיקרוביאליים או מחלות, וסוגי דגימות שבהם נדרשת מדידה מרחבית של ביוכימיה תאית או רקמתית, במיוחד כאשר בוחנים סוגי דגימות הדורשים התייבשות לפני ניתוח. לאחר הכנת המקרו-מושבות של תרביות החיידקים, הסירו את מושבות חיידקי האגרוז המותקנות על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ITO מחומר האריזה.
הניחו את הדגימות בקופסה יבשה עם חומר ייבוש למשך 48 עד 72 שעות בטמפרטורת החדר. בדקו ויזואלית את המושבות לאיתור עיוותים במשטח האגר. לאחר מכן, סגרו את קו הוואקום לתא הדגימה, והפעילו את מתג ההפעלה למשאבת השדרה הסיבובית כדי לאפשר למשאבת הוואקום להתחמם ולהשיג לחץ ואקום תקין.
הפעל את שנאי המתח המשתנה כדי לחמם את חוט הלהט הכרוך סביב התא. התאם את ספק הכוח המשתנה עד שהטמפרטורה הפנימית של תא הוואקום תגיע לכ -50 מעלות צלזיוס. בזמן שהמשאבה מתחממת, הכניסו תרחיף של קרח יבש ו-100% אתנול לתוך המעבה של מלכודת הקור.
פתחו את תא הוואקום באמצעות מפתח ברגים כדי לשחרר את מהדקי האוגן מבד כפול בקוטר 16 מ"מ. הכניסו את דגימות האגרוז לתא, ואטמו את החדר היטב עם מהדקי אוגן בד כפולים בקוטר 16 מ"מ. לאחר מכן פתח את שסתום המשאבה כדי לפנות את החדר, ואפשר לדגימות להתייבש במשך 60 עד 120 דקות.
בסיום, אווררו באיטיות את תא הוואקום ללחץ הסביבה על ידי סגירת השסתום במשאבת השדרה הסיבובית, ופתיחת אוגן הוואקום לאוויר הסביבה. פתחו את התא כפי שהודגם קודם לכן, והוציאו את דגימת האגרוז המיובשת מהחדר. השתמש 1, 5-Diaminonaphthalene MALDI מטריצה עבור ספיחה חיובית שלה יינון של חומצות אמינו מצב יון שלילי.
מחברים את הדגימה למגש הריסוס, וטוענים את התמיסות המוכנות לקו הריסוס. באמצעות תוכנת המחשב, ציין את הפרמטרים הדרושים לציפוי אחיד של תרכובת המטריצה. עקוב אחר רצף הריסוס עד לסיומו.
הוציאו את הדגימה ממגש הריסוס ואחסנו אותה בארון ייבוש עד לניתוח. הכנס את הדגימה המצופה מטריצה למתאם השקופיות של מיקרוסקופ צלחת היעד MALDI. חרטו לפחות שלושה סמנים פיקטיביים המקיפים את אזור הדגימה באמצעות סמנים קבועים.
השתמש בסורק שטוח כדי לקבל תמונה אופטית של שקופית המיקרוסקופ כולל סמני הנאמנות. כעת הגדירו שיטת מכשיר ספקטרומטריית מסות כמתואר בכתב היד. במצב יונים שליליים, בחר את חלון המסה של 100 דלתון ממסה במטען 100 עד 200 להעשרת אות פאזת גז באמצעות צבירה רציפה של גישת יונים נבחרים המקיפה את המסה על ידי ערכי מטען של המטבוליטים המעניינים.
פתח את תוכנת רכישת התמונה של המכשיר והשתמש באשף ההתקנה כדי להגדיר את שם הקובץ והמיקום, את מצב רכישת MS, אזורים מעניינים לדגימה ואת הרזולוציה המרחבית של התמונה. למד את הדגימה באמצעות הסמנים הפידוקיאליים מהתמונה האופטית כדי לסנכרן עם נשא דגימת המכשיר. לאחר מכן הגדר את אזורי העניין בתמונה האופטית באמצעות כלי בחירת אזורי העניין של התוכנה.
לאחר שכל הפרמטרים הוגדרו, התחל את רצף הרכישה כדי לרכוש באופן סדרתי ספקטרום מסה בכל פיקסל על פני אזור העניין המוגדר. לאחר רכישת התמונה, שמור את הנתונים עם סיומת קובץ MIS שהיא תבנית קובץ ספציפית לספק עבור פלטפורמות ספקטרומטריית מסה של הדמיה. פתח את קובץ הנתונים בחבילות תוכנה flexImaging או SCiLS, או יצא לתבנית נתונים שאינה קניינית, כגון mzML, והצג באופן חזותי באמצעות תוכנה ניטרלית של הספק.
באמצעות תוכנת הייחוס, הגדר חלונות מסה עבור פסגות עניין כדי ליצור מפות חום בצבע מזויף של התפלגות יונים על פני האזורים שנדגמו. בתצוגת ספקטרום המסה הממוצעת, התקרבו לשיא העניין ובחרו חלון מסה מתאים המקיף את האזור של פרופיל השיא. כעת, לחץ לחיצה ימנית על חלון המסה המסומן ובחר הוסף מסנן מסה.
תייג את המסה שנבחרה לפי ערך מטען באמצעות זיהוי טנטטיבי של המטבוליט החשוד כפי שנקבע על ידי מדידת המסה המדויקת ברזולוציה גבוהה. בחרו בסף העוצמה כדי להתאים את הטווח הדינמי של התמונה האנליטית המוצגת במפת החום של הצבע המזויף. התאימו עוד יותר את פרמטרי סינון המסה כך שחלון המסה יקיף את האזור של פרופיל הפסגה, ולאחר מכן הוסיפו את מסנן המסה.
נקו את כל ציוד ההקפאה על ידי שטיפתו באתנול 100%, והניחו לו להתייבש לפני הכנסת הדגימות לתא ההקפאה. הכינו שקופיות מיקרוסקופ מצופות ITO באמצעות אומטר כדי לזהות את צד השקופית עם הציפוי המוליך. בעזרת סופר משובץ יהלומים, חרטו ותייגו את הצד המצופה ITO של שקופית המיקרוסקופ.
לאחר מכן בצע cryosectioning על cryomicrotome מחקר. העבירו את רקמות ceca העכבר המוטבעות ב-OCT ממקפיא של 80 מעלות צלזיוס לתא ההקפאה על קרח יבש. בתוך תא הקריומיקרוטום, הרכיבו את הרקמה המוטבעת ב-OCT על צ'אק דגימה באמצעות תמיסת OCT נוספת.
לאחר שתמיסת OCT התמצקה, קבע את הצ'אק לראש הדגימה והתחל בהקפאה במרווחים של 10 עד 50 מיקרומטר כדי להגיע לעומק הרקמה הרצוי או למישור של האיבר. לאחר שמגיעים לחתך אופטימלי של הרקמה, מתחילים לאסוף חתכים בעובי 12 מיקרומטר. טפלו בעדינות את הפרוסה בעזרת מברשות צבע אמנותיות, והניחו אותה על שקופית מיקרוסקופ מצופה טפלון.
כדי להרים את הרקמה מהמגלשה המצופה טפלון, גלגלו את שקופית המיקרוסקופ המצופה ITO על גבי מקטע הרקמה. הפשירו את מקטע הרקמה למגלשת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על כף היד לחלק האחורי של המגלשה המצופה ב-ITO. ממשיכים להפשיר-הרכבה עד שמקטע הרקמה הופך משקוף למרקם אטום או מט.
לניתוח באותו יום, העבירו את שקופיות המיקרוסקופ המורכב על רקמות על קרח יבש לקופסה יבשה עם חומר מייבש לאחסון. בצע את יישום מטריצת MALDI ואת ספקטרומטריית המסה של MALDI כפי שהודגם קודם לכן. נתחו את תמונות היונים משכפלים ביולוגיים מרובים, והשוו את התוצאות לקבלת מובהקות באמצעות השוואות של קווי מתאר בעוצמה באמצעות התוכנה הסטטיסטית SCiLS.
ניתוח MALDI במצב יונים שליליים של דגימות תרבית חיידקים מאפשר איתור עשרות מטבוליטים. מדידות מסה מדויקות ברזולוציה גבוהה מאפשרות זיהוי טנטטיבי של אורניתין וארגינין. אזורי המדידה לניתוח ספקטרומטריית מסה של הדמיה מוצגים.
ספקטרומטריית מסות הדמיה של דגימות אלה מאפשרת מיפוי מרחבי של מטבוליטים של חומצות אמינו אורניתין וארגינין אשר נמצאו משתנים וממוקמים באופן דיפרנציאלי בנוכחות Enterococcus faecalis. מורפולוגיית הרקמה של ceca עכבר נגוע הודגמה באמצעות hematoxylin ו eosin צביעה. תמונות אופטיות של רקמות ceca עכבר לאחר החלת 1, 5-Diaminonaphthalene MALDI שכבת מטריצה מוצגים.
תמונות יוני MALDI עבור אורניתין וארגינין מציגות פיזור מרחבי ייחודי על פני דגימות הרקמה. השיקול החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא לשמור על ייבוש עדין וטיפול בדגימות תרבית חיידקים כדי למזער בעבוע, סדקים ועיוותים אחרים של הדגימה. לאחר ספקטרומטריית מסות הדמיה, ניתן לבצע ניתוח מיקרוסקופיה של שדה בהיר ופלואורסצנטיות של דגימות רקמה כדי להעריך את המורפולוגיה של הרקמות.
זה יכול גם לאפשר אימות ממוקד של מסלולים מולקולריים באמצעות שיטות הדמיה מבוססות נוגדנים.
