Ringrazio le seguenti persone per la loro assistenza nello sviluppo di questo protocollo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, e Mays Imad. Dati di spettrometria di massa e proteomica sono stati acquisiti dal Consorzio Arizona Proteomica supportato da NIEHS concessione ES06694 al SWEHSC, NIH / NCI concessione CA023074 al AZCC e dall&#39;Istituto BIO5 della University of Arizona. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal National Institutes of Health (Istituto Nazionale di Medicina Generale) da sovvenzioni 1F32GM83661-01 e 1R15GM097714-01 a Jessica E. Garb.

1. Preparazione di elettro-stimolatore Apparecchio <ol><li> Collegare il cavo di alimentazione elettro-stimolatore alla presa e collegare pedale esterno per l&#39;ingresso del segnale esterno. Nota: i cavi elettrici devono essere isolati ed erogare corrente metalliche esposte non devono essere toccati. Indossare guanti in lattice o nitrile per la protezione. Interruttore di alimentazione elettro-stimolatore deve essere in posizione OFF quando si collega il cavo di alimentazione e collegare i fili. </li><li> Collegare elettrodo positivo al terminale di uscita rosso su elettro-stimolatore (quando l&#39;interruttore di polarità è in modalità normale) e collegare l&#39;elettrodo negativo al terminale di uscita nera. Nota: Ogni filo elettrodo deve terminare con un coccodrillo. </li><li> Impostare stimolatore per le seguenti impostazioni iniziali consigliate: tensione = 7 V, Frequenza = 1 impulsi al secondo, ritardo = 0 millisecondi, duration = 200 millisecondi, gli impulsi gemelli interruttore = regolare, e l&#39;interruttore mode = off. </li><li> Uscita di test di elettrodi da collegare morsetti a coccodrillo per voltmeter puntali positivo e negativo. Accendere l&#39;interruttore di alimentazione stimolatore e fornire corrente con comando a pedale. </li></ol> 2. Preparazione di immobilizzare Pinze e altri materiali <ol><li> Immergere un polo di pinze in piuma rivestimento in plastica liquida e aspettare quattro ore per far asciugare il rivestimento. Strettamente avvolgere 15 mm di punta del polo opposto con un singolo strato di filati per cucire di cotone, e fissare filo legando l&#39;estremità in un nodo. Nota: Il filo viene utilizzato per assorbire una soluzione salina applicata che promuove la conducibilità elettrica, mentre il rivestimento in plastica fornisce isolamento per ritardare corrente. </li><li> Tagliare punta smussata dell&#39;ago ipodermico con forbici affilate e lisciare l&#39;apertura con carta vetrata. Applicare l&#39;ago di un sifone di vuoto (ad esempio, beuta per filtrazione a vuoto) tramite un tubo. Nota: L&#39;ago aspirare via l&#39;acqua e rigurgitare, e servirà a completare il circuito creato da elettrodi dello stimolatore. Il mu apertura dell&#39;agost essere abbastanza piccolo da non danneggiare il ragno, ma abbastanza grande per soluzione di vuoto senza intasarsi (ad esempio, 25 G x 1 ½ in finezza, vedere Elenco materiali). </li><li> Pinze Posizione piuma orizzontale in una posizione ben chiuso con un morsetto a due punte rivestito in vinile fissato ad una base magnetica o di apparecchi supporto fisso in campo di un microscopio da dissezione di vista, con la plastica rivestito polo di pinze sulla parte superiore e filo rivestito polo sul fondo. Nota: Il morsetto duplice viene mantenuta in una posizione stazionaria alla base magnetica da una porta pinze (vedi Elenco materiali). Un elastico può essere collegato saldamente attorno rebbi della pinza piuma, accanto al supporto del morsetto, per aggiungere ulteriore pressione per mantenere la pinza piuma in posizione chiusa attorno al ragno volta introdotto. </li><li> Fissare positivo Clip elettrodo coccodrillo di polo inferiore forcipe &#39;a monte del filo e collegare il morsetto a coccodrillo negativo per smussare ago vuoto di metallo. </li&gt; <li> Circuito di prova corrente con voltmetro mettendo cavo positivo sulla pinza polo tra filo e morsetto a coccodrillo e l&#39;immissione cavo negativo sul ferro vuoto smussato. Premere il pedale per garantire viene rilevata una corrente sufficiente e rimuovere i cavi in ​​caso di rilevamento di corrente sufficiente. </li><li> Preparare diversi tubi microcapillari per la raccolta veleno. Tenere un singolo microcapillare ad una estremità con una mano guantata e all&#39;altra estremità con una pinza di metallo sterili, ponendo orizzontalmente fine pinza-detenuti su un becco Bunsen. Tirare la microcapillare con le pinze metalliche lontano dalla fiamma per creare una punta allungata, tenendo l&#39;altra estremità in una posizione stazionaria. Nota: indossare occhiali di protezione come microcapillari possono rompersi facilmente. </li><li> Resto microcapillari preparati su una striscia di stucco di montaggio in una capsula di Petri. Esamina microcapillare termina sotto un microscopio da dissezione e creare una piccola apertura smussata alla fine tirato con pinze metalliche sterilizzati. </li><li> Label numero variabile di sterili da 0,5 ml provette. Aggiungi sterili, acqua deionizzata sterile per tubi (per esempio, 5 ml di acqua deionizzata in autoclave). Chiudere le provette e tubi posto su ghiaccio. </li><li> Preparare la soluzione salina in un bicchiere e riempire un secondo bicchiere d&#39;acqua in autoclave. </li></ol> 3. L&#39;immobilizzazione di Spider in Pinze <ol><li> Accendere CO 2 serbatoio e trasferire ragno dal chiuso fiala di plastica raccolta (vedi elenco dei materiali) in CO 2 camera con pinze di metallo lunghi. Nota: ragni vedova nera hanno veleno pericolosi; indossare sempre i guanti durante questo protocollo. </li><li> Tenere ragno in camera per 5-10 minuti o fino a quando anestetizzato e non muoversi quando dolcemente pungolati con lunghe pinze. Utilizzare trasferimento pipetta per bagnare il filo pinza con una soluzione salina. Nota: Per le linee guida sulla CO 2 parametri di anestesia per le vedove nere, fare riferimento a Spagna e Moore 19. </li><li> Recupera ragno anestetizzato da CO 2da camera di raccoglierlo per le zampe anteriori con dissettore smussato e le mani guantate. Spostare ragno anestetizzato a piuma apparecchiature pinze. Poli separati di pinze piuma chiuse e pongono cefalotorace del ragno tra i denti e permettono i rebbi di chiudere chiusa per garantire ragno è tenuta saldamente in posizione, ma non viene schiacciato. Assicurarsi che il ragno è posto lato carapace dorso verso il basso (vedi Foelix 20 per la guida di ragno anatomia), che poggia su filo rivestito polo, e sul lato ventrale del carapace di fronte al rivestimento in plastica, mentre l&#39;elettrodo positivo rimane attaccato al polo inferiore. Lavorare velocemente durante la manipolazione di ragno. </li><li> Regolare dissezione microscopio ingrandimento, messa a fuoco, e la sorgente luminosa fino cheliceri del ragno e zanne sono chiaramente visibili. </li></ol> 4. Venom Collection <ol><li> Accendere vuoto e spruzzare ragno cheliceri con una soluzione di acqua con una seconda punta smussata siringa nEedle. Aspirare via l&#39;acqua con l&#39;ago a vuoto per rimuovere le impurità. </li><li> Toccare l&#39;ago vuoto con elettrodo negativo collegato a ragno tribuna e fornire impulsi con pedale una o più volte. Vacuum via rigurgitare se necessario. Nota: ragno podio è dentro la bocca posteriore al cheliceri sulla superficie dorsale tra cheliceri e endites (vedi Foelix 20 per informazioni dettagliate ragno anatomia). Nota: Con ogni impulso, gambe contratto del ragno, e il veleno sarà visibile come gocce chiare emergono dalle zanne. </li><li> Raccogliere il veleno goccioline con punta microcapillare e mancia capillare trasferimento in 0,5 ml di tubo con acqua o soluzione tampone (soluzione sarà risucchiato nel capillare). Nota: evitare la puntura di ragno con capillare che può portare alla contaminazione emolinfa e la morte. Anche evitare la contaminazione del capillare con seta e colla da filiere. </li><li> Attaccare la siringa di trasferimento con adattatore tubo microcapillare (a parte opposta alla punta di raccolta) edsoluzione veleno ispense di nuovo nel tubo. Mettere la provetta in ghiaccio. Nota: Smaltire capillari rifiuti in un apposito contenitore nelle vicinanze. </li><li> Luogo aperto fiala di plastica raccolta, insieme con il suo tappo, vicino al ragno. Cogliere attentamente le zampe di ragno con dissettore smussato tenute in una mano e con cura piuma aperta una pinza punte con l&#39;altra mano, ragno scorrevole in raccolta flaconcino con una pinza smussato e chiudere rapidamente cap. Continuare con tubi-veleno contenente prossimo ragno e conservare in freezer -80 ° C una volta terminato. Nota: continuare ad esercitare attenzione quando si sposta il ragno dalle pinze di nuovo nel flaconcino. Assicurarsi che la fiala di raccolta e il tappo è vicina al ragno per la sua rapidità di trasferimento e indossare i guanti. </li></ol> 5. Venom Gland Dissezioni <ol><li> Due-tre giorni dopo la raccolta veleno, anestetizzare ragno in CO 2 camera (vedere il punto 3.1). Riempire carrier azoto liquido e posto accanto al microscopio da dissezione. Nota: whit lavora con l&#39;azoto liquido, l&#39;uso di protezione degli occhi e guanti criogenici. </li><li> Zona di dissezione pulito e dissettore con una soluzione che elimina la contaminazione RNasi e DNA. Riempire una piccola capsula di Petri posto sotto microscopio da dissezione con dissezione tampone (ad esempio, 1x citrato di soluzione fisiologica di sodio (SSC) buffer). </li><li> Trasferimento ragno dal CO 2 da camera di scatola di Petri e utilizzare pinze per separare rapidamente il cefalotorace con l&#39;addome. </li><li> Tenere il cefalotorace sotto il microscopio da dissezione con una pinza e posizionare il cheliceri nel campo visivo. Utilizza i taglienti estremità di una seconda coppia di pinze per tagliare cuticola unendo carapace agli aspetti laterali del cheliceri. Lateralmente cogliere il cheliceri con il secondo paio di pinze e tirare delicatamente avanti e indietro fino a ghiandole velenifere sono tirati fuori. </li><li> Ghiandole separate dal cheliceri (o lasciare collegati al cheliceri se lo si desidera) e trasferirli in un cyrosafe tubo di 0,5 ml. Luogo clostubo ed in azoto liquido. Nota: ogni dissezione non dovrebbe richiedere più di 15 minuti. </li><li> Ripetere dissezione con i ragni supplementari fino al termine. Tubi di trasferimento di azoto liquido in freezer -80 ° C. </li></ol>

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L&#39;autore non ha nulla da rivelare e senza interessi finanziari concorrenti.

Venoms rappresentano una fonte importante di proteine ​​fisiologicamente reattivi, peptidi e altre molecole con applicazioni per la scoperta di farmaci, così come per gli aspetti fondamentali della ricerca cellulare e ecologica 1-3. Tuttavia, la raccolta di veleno, in particolare da animali pericolosi o di piccole dimensioni, è un compito impegnativo. Questo protocollo dimostra come veleno e veleno ghiandole possono essere raccolti da ragni vedova nera, e conferma il successo di questo approccio tramite una combinazione di analisi MudPIT del veleno e un database di proteine ​​derivate da cDNA clonato da veleno di ghiandole 21. Anche se questo protocollo funziona bene per le vedove nere e ragni di medie dimensioni, altre tecniche di raccolta del veleno sono state impiegate per la più grande mygalomorph ragni (tarantola-simili), come ad esempio l&#39;aspirazione diretta di veleno da denti in vetro pipette ad esempio, 24. Quest&#39;ultimo approccio, tuttavia , non funziona bene per i ragni più piccoli di dimensioni che non sono aggressive. Un aspetto particolarmente critico del protocollo di raccolta veleno qui descritto è la fase iniziale di preparazione e ottimizzazione del processo di raccolta in modo che diventi più di routine, coerente e veloce. Il protocollo è inizialmente difficile da padroneggiare, ma con prove ripetute, diventa più facile e più veloce. Cautela è inoltre invitata a tutte le fasi critiche che comportano la manipolazione di ragni pericolosi, l&#39;uso di corrente elettrica, messa a punto in vetro micro capillari, e aghi da siringa. E &#39;importante indossare adeguati dispositivi di protezione individuale, come guanti di nitrile, un camice, pantaloni lunghi e scarpe chiuse, così come occhiali di protezione durante modellare micro capillari. Un altro aspetto difficile da collezione veleno è la piccola quantità di veleno prodotto da qualsivoglia ragno, in particolare le specie Latrodectus, da cui gli importi raccolti possono essere litata a 1-2 microlitri per ogni individuo al meglio. Ottenere il veleno sufficiente per applicazioni a valle, come ad esempio gel di proteine ​​o test funzionali può richiedere la combinazione di veleno da più individui in un tubo. In questi casi, il veleno dovrebbe essere combinato solo dagli individui dello stesso sesso, lo stadio ontogenetico, e la popolazione dato il riconoscimento di intersessuale, dello sviluppo e la variabilità geografica in alcuni veleni 25, 26. I ragni si possono presentare anche variare notevolmente la quantità di veleno prodotta tra gli individui, in cui importi inferiori può riflettere il recente esaurimento della ghiandola. Così può essere opportuno raccogliere veleno di alcuni giorni dopo la loro ultima poppata. Se poco veleno viene rilasciato, eccessiva corrente non deve applicare al ragno, che può causare la rottura della cuticola, portando alla contaminazione del veleno con emolinfa o la morte. La contaminazione dei campioni di veleno con ragno SIfonti lk o umani dovrebbero essere evitati attraverso l&#39;uso di materiale sterile o pulito. Nonostante queste sfide, la raccolta di veleno puro, lasciando vivo il ragno, è preferibile ai metodi che ottengono il veleno da omogenati delle ghiandole (che non separano i componenti del veleno da altre proteine ​​cellulari) e uccidono il ragno. E &#39;anche fondamentale per garantire che i campioni siano rapidamente congelati per evitare la degradazione delle proteine. L&#39;estrazione di veleno promuove la successiva produzione di veleno, stimolando in tal modo l&#39;espressione genica veleno nella ghiandola del veleno. Quindi, perché questo protocollo permette di ragni di sopravvivere veleno esaurimento, le loro ghiandole possono essere sezionati alcuni giorni dopo (uccidendo il ragno) in un punto in cui l&#39;espressione del gene veleno dovrebbe essere sufficiente per gli studi genetici, come trascrizione clonazione 10,11. Diversi importanti precauzioni devono essere prese in dissezioni ghiandola del veleno. Occorre porre l&#39;accento sull&#39;utilizzo di laboratorio equipment e reagenti che sono privi di RNasi che degradano l&#39;RNA. Pertanto si raccomanda di pulire pinze e altri materiali riutilizzabili e superfici con soluzioni che eliminano la contaminazione RNasi e DNA. Le dissezioni devono essere eseguite più rapidamente possibile e direttamente congelato per garantire ulteriormente l&#39;integrità dell&#39;RNA del tessuto. Infine, dissezioni devono essere eseguiti solo su ragni anestetizzati, dopo la loro cefalotorace e l&#39;addome sono rapidamente separati. In conclusione, questo articolo fornisce un protocollo di verifica per ottenere ragno veleno e veleno ghiandole. Venom e veleno ghiandole consentono l&#39;isolamento e la caratterizzazione dei componenti proteici e peptidici mediante approcci di proteomica e trascrittomica. Inoltre, campioni veleno possono rappresentare il punto di partenza di saggi funzionali, che determinano il potenziale biomedico e farmacologico delle loro molecole costituenti. Quasi tutti i ragni producono il veleno, e l&#39;ampia subacqueosità di componenti veleno sintetizzati da singole specie suggerisce una grande diversità di molecole di veleno sono ancora da scoprire 13. Di conseguenza, questo protocollo fornisce gli strumenti per studiare la ricca fonte di molecole biologicamente attive presenti in ragno veleni.

Veleni sono secrezioni animali prevalentemente iniettate in un altro animale a fini di predazione o di difesa, e hanno anche importanti applicazioni biologiche di rilevanza biomedica 1-3. Solo alcuni animali sintetizzano il veleno, ma la sua produzione è tassonomicamente diffusa in tutta invertebrati (ad esempio, cnidari, lumache cono, scorpioni e ragni) e vertebrati (ad esempio, i serpenti, alcuni pesci e mammiferi), perché si è evoluto in modo indipendente più volte 1,4 . Caratterizzazione biochimica di veleni mostrano tipicamente sono composti da un&#39;ampia varietà di proteine ​​e peptidi, che agiscono principalmente sul sistema circolatorio e nervoso di animali iniettati per fornire rapidamente tossine costituenti 1. Una piccola frazione di animali velenosi può costituire una minaccia per gli esseri umani, in particolare specie con distribuzioni sinantropici 5. Lo studio della composizione del veleno e le attività funzionali ha svolto un ruolo importante nellala caratterizzazione funzionale di componenti cellulari vertebrati (in particolare i canali ionici neuronali) 6 e nel chiarire processi cellulari fondamentali (ad esempio neurosecrezione) 7. Inoltre, selezionare i peptidi del veleno hanno proprietà utili in contesti biomediche, compresi i loro usi come trattamenti per il cancro e il dolore 8,9, e sono estratti per candidati cavi di droga e lo sviluppo antiveleno. Veleni anche svolgere un ruolo di primo piano nella ricerca ecologica ed evolutiva 1,4,10,11, quindi la raccolta di queste secrezioni pericolose ha molte utility. Ci sono&gt; 40.000 specie descritte di ragno (Ordine Araneae), e tutti, ma uno dei più di 100 famiglie in possesso di ragno coppie ghiandole velenifere che terminano in zanne 12. La diversità delle specie di ragni alto suggerisce che essi rappresentano la più grande clade degli organismi velenosi. Tuttavia, caratterizzazione biochimica di ragno veleni ha largely concentrata su un numero limitato di specie più spesso associati avvelenamento umano. Recenti studi di proteomica e trascrittomica di ragno veleni indicano che in genere contengono molte proteine ​​e peptidi unici 2,13,14. I progressi nella high-throughput sequencing cDNA e spettrometria di massa peptide fingerprinting ha notevolmente facilitato la scoperta di queste proteine ​​veleno 15. Tuttavia, tale lavoro ha inizio con la raccolta di veleno sufficiente e / o ghiandole velenifere dei ragni, e la documentazione dettagliata per tali tecniche sono pochi 16. Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno e veleno ghiandole di ragni vedova nera, che può essere applicato ai ragni di dimensioni simili. La collezione di veleno separatamente dalle ghiandole permette l&#39;identificazione di proteine ​​che sono secrete nel veleno al contrario di altre proteine ​​che svolgono funzioni cellulari. Vedove nere ed altrospecie atrodectus sono ampiamente riconosciuti tra i ragni più pericolosi a causa della loro veleno altamente neurotossico, che causa un forte dolore negli esseri umani, che a volte è accompagnata da abbondante sudorazione, contrazioni muscolari, ipertensione, difficoltà respiratorie e paralisi chiazze 5. Il protocollo di raccolta veleno qui presentata utilizza elettro-stimolazione per fornire corrente elettrica ai ragni anestetizzati di suscitare contrazioni muscolari e il rilascio di veleno. Goccioline Venom sono rapidamente raccolti con micro-capillari e dispensati in provette per la conservazione congelatore. Dato che il protocollo prevede procedure pericolose, deve essere eseguito esclusivamente da personale ben addestrato e cautela è invitato a passaggi chiave. Il veleno raccolto ha numerosi usi, quali la caratterizzazione e l&#39;isolamento di molecole costituenti 2, per gli esperimenti fisiologici o test funzionali 18, e per stimolare il veleno espressione genica 11. Il protocollo si conclude con una description della ghiandola del veleno dissezione e la conservazione utili per il clonaggio di geni specifici veleno, la cui espressione è stato verificato 2-3 giorni successivi veleno deplezione in diversi ragni 10,11.

<table><tbody><tr><td>Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&amp;nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td></tr><tr><td>Voltmeter</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td></tr><tr><td>Pointed Featherweight Forceps</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&amp;#189; in Precision Glide hypodermic syringe needle</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter flask 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>smaller flask sizes may also work</td></tr><tr><td>Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;#956;l Capillary Bores (Micro capillaries)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Mounting putty strip&amp;nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td></tr><tr><td>Foot switch/pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>similar models could be substituted</td></tr><tr><td>Clamp Holder</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td></tr><tr><td>Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td></tr><tr><td>Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Cotton sewing thread</td><td>Joann fabric and craft store</td><td>7245855</td><td>similar product could be substituted</td></tr></tbody></table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Veleni sono chimicamente secrezioni complesse in genere composto da numerose proteine ​​e peptidi con varie attività fisiologiche. Caratterizzazione funzionale di proteine ​​del veleno ha importanti applicazioni biomediche, tra cui l&#39;identificazione di cavi di droga o sonde per i recettori cellulari. I ragni sono la maggior parte delle specie ricca clade degli organismi velenosi, ma i veleni di solo poche specie sono ben compresi, in parte a causa della difficoltà associata a raccogliere quantità di veleno minute da piccoli animali. Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno di ragni con stimolazione elettrica, deve dimostrare la procedura sulla vedova nera occidentale (Vedova nera). Il veleno raccolta è utile per varie analisi a valle, compresa l&#39;identificazione diretta delle proteine ​​tramite spettrometria di massa, saggi funzionali, e la stimolazione dell&#39;espressione genica veleno per gli studi di trascrittomica. Questa tecnica ha il vantaggio rispetto protocolli che isotardi il veleno da intere omogenati delle ghiandole, che non separano i componenti originali veleno dalle proteine ​​cellulari che non vengono secreti come parte del veleno. Rappresentante risultati dimostrano l&#39;individuazione di noti peptidi del veleno del campione raccolto con la spettrometria di massa. La procedura di raccolta veleno è seguito da un protocollo per dissezione ghiandole velenifere ragno, con risultati dimostrano che questo porta alla caratterizzazione di proteine ​​e peptidi-veleno espresso a livello di sequenza.

La raccolta di veleno e di ghiandole del veleno dissezioni sono spesso eseguite per caratterizzare le proteine ​​del veleno e peptidi a livello di sequenza 10,11,15. Raccolta veleno può essere utilizzato anche in saggi fisiologici per determinare le loro attività funzionali 18. La raccolta di veleno stimolerà veleno espressione genica della ghiandola, facilitando in tal modo la clonazione di specifici trascritti tossina tramite RT-PCR 10,11. Identificazione di proteine ​​del veleno può essere eseguita in modo high-throughput, integrando tecniche di spettrometria di massa standard con le banche dati di sequenza generati dalle biblioteche ghiandola del veleno di cDNA 15,21. Un esempio di tale lavoro, partendo dal veleno e ghiandole raccolti utilizzando il protocollo descritto sopra, dimostrando la sua efficacia, è illustrato in Figura 1. Venom raccolti da L. Hesperus femmine adulte è stato digerito con tripsina e sottoposti ad un in soluzioneAnalisi MudPIT, che collega HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) per spettrometria di massa tandem (MS / MS). Qui l&#39;analisi MudPIT è stata effettuata dalla University of Arizona Proteomica Consortium. Le masse dei peptidi rilevati e loro frammenti dissociati (ioni figlia, desunti dagli spettri) sono stati confrontati con sequenze peptidiche teoricamente previsti da traduzioni di sequenze di cDNA ottenuti da una libreria di espressione genica costruito da L. Hesperus ghiandole velenifere (ghiandole sono stati acquisiti dal protocollo di dissezione descritto sopra) 21. In questo esperimento, 36 proteine ​​sono state rilevate da tutti gli spettri raccolti, sulla soglia di probabilità del 99,9%, e contenevano almeno un peptide rilevato. Una delle proteine ​​rilevate è supportato da 43 spettri totale (spettri esemplare mostrato in Figura 1A), corrispondenti a tre peptidi esclusive, che copre il 35% della sequenza della proteina (Figura 1B). La proteina rilevata (tradotto da un collecte<html> d cDNA) è un successo BLASTP superiore per latrodectin dalla L. tredecimguttatus (GenBank adesione P49125.1), con un e-punteggio 2e-46, e condivide 80% di identità a livello di sequenza aminoacidica della proteina rilevata in questo esperimento. Latrodectin, che è anche conosciuto come proteina a basso peso molecolare alfa-latrotoxin, è un componente veleno riconosciuta di vedova nera ragni 22, 23, verifica dell&#39;efficacia del protocollo presentato. Alcune proteine ​​identificate dal veleno corrispondono a sequenze per le quali si trova nessun colpo BLAST. Non è chiaro se tale risultato è dovuto alle limitate risorse genomiche disponibili per ragni, nonché le informazioni funzionali limitata per le proteine, o perché la proteina sconosciuta rappresenta un contaminante veleno. Tuttavia, gene o l&#39;espressione della proteina analisi esaminando l&#39;abbondanza di una proteina simile romanzo in ghiandole velenifere rispetto ad altri tessuti dovrebbero rivelare se si tratta di un componente del veleno vero e proprio. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: peptide Latrodectin identificato dal nero vedova veleno mediante spettrometria di massa (A) spettri Rappresentante (uno dei 43) rilevata tramite porzione MS / MS di analisi MudPIT di L.. hesperus veleno che è stato assegnato a una versione prevista una sequenza di cDNA raccolto mostrato nella parte B. Spectra mostra massa per caricare il rapporto (m / z) degli ioni figlia rilevati sull&#39;asse orizzontale prodotta dalla frammentazione peptide controllante (CGEEDFGEEIVK), con lettere in alto che indica la sequenza di peptidi sulla base di masse di ioni figlia. (B) sequenza della proteina a cui spettri nella parte A è stato assegnato, mostrando in rosso, grassetto e testo sottolineato la corrispondente sequenza dal spettri di cui alla parte A, ulteriore testo rosso (non in grassetto) rappresenta un altro peptide in questa proteina rilevato con altre sp raccolteECTRA. La sequenza della proteina è tradotto da una sequenza di cDNA ottenuto da ghiandole velenifere sezionati.

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Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Questo articolo fornisce un protocollo per l&#39;estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica.

Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

33.3K Views.  University of Massachusetts Lowell.  Questo articolo fornisce un protocollo per l'estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica. 

Video: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separazione elettroforetica delle proteine

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Ricerca

Biologia

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Ambiente

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Tossina induzione ed estrazione di proteine ​​da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Biochimica

Parassita artificiale dell'ospite mediante Trichogramma dendrolimi ed estrazione del veleno

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

Autore in primo piano: Metodo efficiente di estrazione del veleno dalle vespe parassitoidi Trichogramma 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of developing offspring 1,2. Spiders accomplish these tasks by spinning several distinct fiber types that have diverse mechanical properties. Such specialization of fiber types has occurred through the evolution of different silk-producing glands, which function as small biofactories. These biofactories manufacture and store large quantities of silk proteins for fiber production. Through a complex series of biochemical events, these silk proteins are converted from a liquid into a solid material upon extrusion.
Mechanical studies have demonstrated that spider silks are stronger than high-tensile steel 3. Analyses to understand the relationship between the structure and function of spider silk threads have revealed that spider silk consists largely of proteins, or fibroins, that have block repeats within their protein sequences 4. Common molecular signatures that contribute to the incredible tensile strength and extensibility of spider silks are being unraveled through the analyses of translated silk cDNAs. Given the extraordinary material properties of spider silks, research labs across the globe are racing to understand and mimic the spinning process to produce synthetic silk fibers for commercial, military and industrial applications. One of the main challenges to spinning artificial spider silk in the research lab involves a complete understanding of the biochemical processes that occur during extrusion of the fibers from the silk-producing glands.
Here we present a method for the isolation of the seven different silk-producing glands from the cobweaving black widow spider, which includes the major and minor ampullate glands [manufactures dragline and scaffolding silk] 5,6, tubuliform [synthesizes egg case silk] 7,8, flagelliform [unknown function in cob-weavers], aggregate [makes glue silk], aciniform [synthesizes prey wrapping and egg case threads] 9 and pyriform [produces attachment disc silk] 10. This approach is based upon anesthetizing the spider with carbon dioxide gas, subsequent separation of the cephalothorax from the abdomen, and microdissection of the abdomen to obtain the silk-producing glands. Following the separation of the different silk-producing glands, these tissues can be used to retrieve different macromolecules for distinct biochemical analyses, including quantitative real-time PCR, northern- and western blotting, mass spectrometry (MS or MS/MS) analyses to identify new silk protein sequences, search for proteins that participate in the silk assembly pathway, or use the intact tissue for cell culture or histological experiments.

Here we describe an efficient strategy to remove the silk-producing glands from the abdomen of female black widow spiders. This procedure allows the rapid isolation of the seven distinct silk-producing glands in a highly purified fashion, an important process for investigators studying spider silk production and fiber assembly.

Microdissezione di Black Widow Spider Silk ghiandole che producono

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

Riepilogo

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Separazione elettroforetica delle proteine

Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Tossina induzione ed estrazione di proteine da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

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