Ringrazio le seguenti persone per la loro assistenza nello sviluppo di questo protocollo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier, e Mays Imad. Dati di spettrometria di massa e proteomica sono stati acquisiti dal Consorzio Arizona Proteomica supportato da NIEHS concessione ES06694 al SWEHSC, NIH / NCI concessione CA023074 al AZCC e dall&#39;Istituto BIO5 della University of Arizona. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal National Institutes of Health (Istituto Nazionale di Medicina Generale) da sovvenzioni 1F32GM83661-01 e 1R15GM097714-01 a Jessica E. Garb.

1. Preparazione di elettro-stimolatore Apparecchio <ol><li> Collegare il cavo di alimentazione elettro-stimolatore alla presa e collegare pedale esterno per l&#39;ingresso del segnale esterno. Nota: i cavi elettrici devono essere isolati ed erogare corrente metalliche esposte non devono essere toccati. Indossare guanti in lattice o nitrile per la protezione. Interruttore di alimentazione elettro-stimolatore deve essere in posizione OFF quando si collega il cavo di alimentazione e collegare i fili. </li><li> Collegare elettrodo positivo al terminale di uscita rosso su elettro-stimolatore (quando l&#39;interruttore di polarità è in modalità normale) e collegare l&#39;elettrodo negativo al terminale di uscita nera. Nota: Ogni filo elettrodo deve terminare con un coccodrillo. </li><li> Impostare stimolatore per le seguenti impostazioni iniziali consigliate: tensione = 7 V, Frequenza = 1 impulsi al secondo, ritardo = 0 millisecondi, duration = 200 millisecondi, gli impulsi gemelli interruttore = regolare, e l&#39;interruttore mode = off. </li><li> Uscita di test di elettrodi da collegare morsetti a coccodrillo per voltmeter puntali positivo e negativo. Accendere l&#39;interruttore di alimentazione stimolatore e fornire corrente con comando a pedale. </li></ol> 2. Preparazione di immobilizzare Pinze e altri materiali <ol><li> Immergere un polo di pinze in piuma rivestimento in plastica liquida e aspettare quattro ore per far asciugare il rivestimento. Strettamente avvolgere 15 mm di punta del polo opposto con un singolo strato di filati per cucire di cotone, e fissare filo legando l&#39;estremità in un nodo. Nota: Il filo viene utilizzato per assorbire una soluzione salina applicata che promuove la conducibilità elettrica, mentre il rivestimento in plastica fornisce isolamento per ritardare corrente. </li><li> Tagliare punta smussata dell&#39;ago ipodermico con forbici affilate e lisciare l&#39;apertura con carta vetrata. Applicare l&#39;ago di un sifone di vuoto (ad esempio, beuta per filtrazione a vuoto) tramite un tubo. Nota: L&#39;ago aspirare via l&#39;acqua e rigurgitare, e servirà a completare il circuito creato da elettrodi dello stimolatore. Il mu apertura dell&#39;agost essere abbastanza piccolo da non danneggiare il ragno, ma abbastanza grande per soluzione di vuoto senza intasarsi (ad esempio, 25 G x 1 ½ in finezza, vedere Elenco materiali). </li><li> Pinze Posizione piuma orizzontale in una posizione ben chiuso con un morsetto a due punte rivestito in vinile fissato ad una base magnetica o di apparecchi supporto fisso in campo di un microscopio da dissezione di vista, con la plastica rivestito polo di pinze sulla parte superiore e filo rivestito polo sul fondo. Nota: Il morsetto duplice viene mantenuta in una posizione stazionaria alla base magnetica da una porta pinze (vedi Elenco materiali). Un elastico può essere collegato saldamente attorno rebbi della pinza piuma, accanto al supporto del morsetto, per aggiungere ulteriore pressione per mantenere la pinza piuma in posizione chiusa attorno al ragno volta introdotto. </li><li> Fissare positivo Clip elettrodo coccodrillo di polo inferiore forcipe &#39;a monte del filo e collegare il morsetto a coccodrillo negativo per smussare ago vuoto di metallo. </li&gt; <li> Circuito di prova corrente con voltmetro mettendo cavo positivo sulla pinza polo tra filo e morsetto a coccodrillo e l&#39;immissione cavo negativo sul ferro vuoto smussato. Premere il pedale per garantire viene rilevata una corrente sufficiente e rimuovere i cavi in ​​caso di rilevamento di corrente sufficiente. </li><li> Preparare diversi tubi microcapillari per la raccolta veleno. Tenere un singolo microcapillare ad una estremità con una mano guantata e all&#39;altra estremità con una pinza di metallo sterili, ponendo orizzontalmente fine pinza-detenuti su un becco Bunsen. Tirare la microcapillare con le pinze metalliche lontano dalla fiamma per creare una punta allungata, tenendo l&#39;altra estremità in una posizione stazionaria. Nota: indossare occhiali di protezione come microcapillari possono rompersi facilmente. </li><li> Resto microcapillari preparati su una striscia di stucco di montaggio in una capsula di Petri. Esamina microcapillare termina sotto un microscopio da dissezione e creare una piccola apertura smussata alla fine tirato con pinze metalliche sterilizzati. </li><li> Label numero variabile di sterili da 0,5 ml provette. Aggiungi sterili, acqua deionizzata sterile per tubi (per esempio, 5 ml di acqua deionizzata in autoclave). Chiudere le provette e tubi posto su ghiaccio. </li><li> Preparare la soluzione salina in un bicchiere e riempire un secondo bicchiere d&#39;acqua in autoclave. </li></ol> 3. L&#39;immobilizzazione di Spider in Pinze <ol><li> Accendere CO 2 serbatoio e trasferire ragno dal chiuso fiala di plastica raccolta (vedi elenco dei materiali) in CO 2 camera con pinze di metallo lunghi. Nota: ragni vedova nera hanno veleno pericolosi; indossare sempre i guanti durante questo protocollo. </li><li> Tenere ragno in camera per 5-10 minuti o fino a quando anestetizzato e non muoversi quando dolcemente pungolati con lunghe pinze. Utilizzare trasferimento pipetta per bagnare il filo pinza con una soluzione salina. Nota: Per le linee guida sulla CO 2 parametri di anestesia per le vedove nere, fare riferimento a Spagna e Moore 19. </li><li> Recupera ragno anestetizzato da CO 2da camera di raccoglierlo per le zampe anteriori con dissettore smussato e le mani guantate. Spostare ragno anestetizzato a piuma apparecchiature pinze. Poli separati di pinze piuma chiuse e pongono cefalotorace del ragno tra i denti e permettono i rebbi di chiudere chiusa per garantire ragno è tenuta saldamente in posizione, ma non viene schiacciato. Assicurarsi che il ragno è posto lato carapace dorso verso il basso (vedi Foelix 20 per la guida di ragno anatomia), che poggia su filo rivestito polo, e sul lato ventrale del carapace di fronte al rivestimento in plastica, mentre l&#39;elettrodo positivo rimane attaccato al polo inferiore. Lavorare velocemente durante la manipolazione di ragno. </li><li> Regolare dissezione microscopio ingrandimento, messa a fuoco, e la sorgente luminosa fino cheliceri del ragno e zanne sono chiaramente visibili. </li></ol> 4. Venom Collection <ol><li> Accendere vuoto e spruzzare ragno cheliceri con una soluzione di acqua con una seconda punta smussata siringa nEedle. Aspirare via l&#39;acqua con l&#39;ago a vuoto per rimuovere le impurità. </li><li> Toccare l&#39;ago vuoto con elettrodo negativo collegato a ragno tribuna e fornire impulsi con pedale una o più volte. Vacuum via rigurgitare se necessario. Nota: ragno podio è dentro la bocca posteriore al cheliceri sulla superficie dorsale tra cheliceri e endites (vedi Foelix 20 per informazioni dettagliate ragno anatomia). Nota: Con ogni impulso, gambe contratto del ragno, e il veleno sarà visibile come gocce chiare emergono dalle zanne. </li><li> Raccogliere il veleno goccioline con punta microcapillare e mancia capillare trasferimento in 0,5 ml di tubo con acqua o soluzione tampone (soluzione sarà risucchiato nel capillare). Nota: evitare la puntura di ragno con capillare che può portare alla contaminazione emolinfa e la morte. Anche evitare la contaminazione del capillare con seta e colla da filiere. </li><li> Attaccare la siringa di trasferimento con adattatore tubo microcapillare (a parte opposta alla punta di raccolta) edsoluzione veleno ispense di nuovo nel tubo. Mettere la provetta in ghiaccio. Nota: Smaltire capillari rifiuti in un apposito contenitore nelle vicinanze. </li><li> Luogo aperto fiala di plastica raccolta, insieme con il suo tappo, vicino al ragno. Cogliere attentamente le zampe di ragno con dissettore smussato tenute in una mano e con cura piuma aperta una pinza punte con l&#39;altra mano, ragno scorrevole in raccolta flaconcino con una pinza smussato e chiudere rapidamente cap. Continuare con tubi-veleno contenente prossimo ragno e conservare in freezer -80 ° C una volta terminato. Nota: continuare ad esercitare attenzione quando si sposta il ragno dalle pinze di nuovo nel flaconcino. Assicurarsi che la fiala di raccolta e il tappo è vicina al ragno per la sua rapidità di trasferimento e indossare i guanti. </li></ol> 5. Venom Gland Dissezioni <ol><li> Due-tre giorni dopo la raccolta veleno, anestetizzare ragno in CO 2 camera (vedere il punto 3.1). Riempire carrier azoto liquido e posto accanto al microscopio da dissezione. Nota: whit lavora con l&#39;azoto liquido, l&#39;uso di protezione degli occhi e guanti criogenici. </li><li> Zona di dissezione pulito e dissettore con una soluzione che elimina la contaminazione RNasi e DNA. Riempire una piccola capsula di Petri posto sotto microscopio da dissezione con dissezione tampone (ad esempio, 1x citrato di soluzione fisiologica di sodio (SSC) buffer). </li><li> Trasferimento ragno dal CO 2 da camera di scatola di Petri e utilizzare pinze per separare rapidamente il cefalotorace con l&#39;addome. </li><li> Tenere il cefalotorace sotto il microscopio da dissezione con una pinza e posizionare il cheliceri nel campo visivo. Utilizza i taglienti estremità di una seconda coppia di pinze per tagliare cuticola unendo carapace agli aspetti laterali del cheliceri. Lateralmente cogliere il cheliceri con il secondo paio di pinze e tirare delicatamente avanti e indietro fino a ghiandole velenifere sono tirati fuori. </li><li> Ghiandole separate dal cheliceri (o lasciare collegati al cheliceri se lo si desidera) e trasferirli in un cyrosafe tubo di 0,5 ml. Luogo clostubo ed in azoto liquido. Nota: ogni dissezione non dovrebbe richiedere più di 15 minuti. </li><li> Ripetere dissezione con i ragni supplementari fino al termine. Tubi di trasferimento di azoto liquido in freezer -80 ° C. </li></ol>

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	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

L&#39;autore non ha nulla da rivelare e senza interessi finanziari concorrenti.

Venoms rappresentano una fonte importante di proteine ​​fisiologicamente reattivi, peptidi e altre molecole con applicazioni per la scoperta di farmaci, così come per gli aspetti fondamentali della ricerca cellulare e ecologica 1-3. Tuttavia, la raccolta di veleno, in particolare da animali pericolosi o di piccole dimensioni, è un compito impegnativo. Questo protocollo dimostra come veleno e veleno ghiandole possono essere raccolti da ragni vedova nera, e conferma il successo di questo approccio tramite una combinazione di analisi MudPIT del veleno e un database di proteine ​​derivate da cDNA clonato da veleno di ghiandole 21. Anche se questo protocollo funziona bene per le vedove nere e ragni di medie dimensioni, altre tecniche di raccolta del veleno sono state impiegate per la più grande mygalomorph ragni (tarantola-simili), come ad esempio l&#39;aspirazione diretta di veleno da denti in vetro pipette ad esempio, 24. Quest&#39;ultimo approccio, tuttavia , non funziona bene per i ragni più piccoli di dimensioni che non sono aggressive. Un aspetto particolarmente critico del protocollo di raccolta veleno qui descritto è la fase iniziale di preparazione e ottimizzazione del processo di raccolta in modo che diventi più di routine, coerente e veloce. Il protocollo è inizialmente difficile da padroneggiare, ma con prove ripetute, diventa più facile e più veloce. Cautela è inoltre invitata a tutte le fasi critiche che comportano la manipolazione di ragni pericolosi, l&#39;uso di corrente elettrica, messa a punto in vetro micro capillari, e aghi da siringa. E &#39;importante indossare adeguati dispositivi di protezione individuale, come guanti di nitrile, un camice, pantaloni lunghi e scarpe chiuse, così come occhiali di protezione durante modellare micro capillari. Un altro aspetto difficile da collezione veleno è la piccola quantità di veleno prodotto da qualsivoglia ragno, in particolare le specie Latrodectus, da cui gli importi raccolti possono essere litata a 1-2 microlitri per ogni individuo al meglio. Ottenere il veleno sufficiente per applicazioni a valle, come ad esempio gel di proteine ​​o test funzionali può richiedere la combinazione di veleno da più individui in un tubo. In questi casi, il veleno dovrebbe essere combinato solo dagli individui dello stesso sesso, lo stadio ontogenetico, e la popolazione dato il riconoscimento di intersessuale, dello sviluppo e la variabilità geografica in alcuni veleni 25, 26. I ragni si possono presentare anche variare notevolmente la quantità di veleno prodotta tra gli individui, in cui importi inferiori può riflettere il recente esaurimento della ghiandola. Così può essere opportuno raccogliere veleno di alcuni giorni dopo la loro ultima poppata. Se poco veleno viene rilasciato, eccessiva corrente non deve applicare al ragno, che può causare la rottura della cuticola, portando alla contaminazione del veleno con emolinfa o la morte. La contaminazione dei campioni di veleno con ragno SIfonti lk o umani dovrebbero essere evitati attraverso l&#39;uso di materiale sterile o pulito. Nonostante queste sfide, la raccolta di veleno puro, lasciando vivo il ragno, è preferibile ai metodi che ottengono il veleno da omogenati delle ghiandole (che non separano i componenti del veleno da altre proteine ​​cellulari) e uccidono il ragno. E &#39;anche fondamentale per garantire che i campioni siano rapidamente congelati per evitare la degradazione delle proteine. L&#39;estrazione di veleno promuove la successiva produzione di veleno, stimolando in tal modo l&#39;espressione genica veleno nella ghiandola del veleno. Quindi, perché questo protocollo permette di ragni di sopravvivere veleno esaurimento, le loro ghiandole possono essere sezionati alcuni giorni dopo (uccidendo il ragno) in un punto in cui l&#39;espressione del gene veleno dovrebbe essere sufficiente per gli studi genetici, come trascrizione clonazione 10,11. Diversi importanti precauzioni devono essere prese in dissezioni ghiandola del veleno. Occorre porre l&#39;accento sull&#39;utilizzo di laboratorio equipment e reagenti che sono privi di RNasi che degradano l&#39;RNA. Pertanto si raccomanda di pulire pinze e altri materiali riutilizzabili e superfici con soluzioni che eliminano la contaminazione RNasi e DNA. Le dissezioni devono essere eseguite più rapidamente possibile e direttamente congelato per garantire ulteriormente l&#39;integrità dell&#39;RNA del tessuto. Infine, dissezioni devono essere eseguiti solo su ragni anestetizzati, dopo la loro cefalotorace e l&#39;addome sono rapidamente separati. In conclusione, questo articolo fornisce un protocollo di verifica per ottenere ragno veleno e veleno ghiandole. Venom e veleno ghiandole consentono l&#39;isolamento e la caratterizzazione dei componenti proteici e peptidici mediante approcci di proteomica e trascrittomica. Inoltre, campioni veleno possono rappresentare il punto di partenza di saggi funzionali, che determinano il potenziale biomedico e farmacologico delle loro molecole costituenti. Quasi tutti i ragni producono il veleno, e l&#39;ampia subacqueosità di componenti veleno sintetizzati da singole specie suggerisce una grande diversità di molecole di veleno sono ancora da scoprire 13. Di conseguenza, questo protocollo fornisce gli strumenti per studiare la ricca fonte di molecole biologicamente attive presenti in ragno veleni.

Veleni sono secrezioni animali prevalentemente iniettate in un altro animale a fini di predazione o di difesa, e hanno anche importanti applicazioni biologiche di rilevanza biomedica 1-3. Solo alcuni animali sintetizzano il veleno, ma la sua produzione è tassonomicamente diffusa in tutta invertebrati (ad esempio, cnidari, lumache cono, scorpioni e ragni) e vertebrati (ad esempio, i serpenti, alcuni pesci e mammiferi), perché si è evoluto in modo indipendente più volte 1,4 . Caratterizzazione biochimica di veleni mostrano tipicamente sono composti da un&#39;ampia varietà di proteine ​​e peptidi, che agiscono principalmente sul sistema circolatorio e nervoso di animali iniettati per fornire rapidamente tossine costituenti 1. Una piccola frazione di animali velenosi può costituire una minaccia per gli esseri umani, in particolare specie con distribuzioni sinantropici 5. Lo studio della composizione del veleno e le attività funzionali ha svolto un ruolo importante nellala caratterizzazione funzionale di componenti cellulari vertebrati (in particolare i canali ionici neuronali) 6 e nel chiarire processi cellulari fondamentali (ad esempio neurosecrezione) 7. Inoltre, selezionare i peptidi del veleno hanno proprietà utili in contesti biomediche, compresi i loro usi come trattamenti per il cancro e il dolore 8,9, e sono estratti per candidati cavi di droga e lo sviluppo antiveleno. Veleni anche svolgere un ruolo di primo piano nella ricerca ecologica ed evolutiva 1,4,10,11, quindi la raccolta di queste secrezioni pericolose ha molte utility. Ci sono&gt; 40.000 specie descritte di ragno (Ordine Araneae), e tutti, ma uno dei più di 100 famiglie in possesso di ragno coppie ghiandole velenifere che terminano in zanne 12. La diversità delle specie di ragni alto suggerisce che essi rappresentano la più grande clade degli organismi velenosi. Tuttavia, caratterizzazione biochimica di ragno veleni ha largely concentrata su un numero limitato di specie più spesso associati avvelenamento umano. Recenti studi di proteomica e trascrittomica di ragno veleni indicano che in genere contengono molte proteine ​​e peptidi unici 2,13,14. I progressi nella high-throughput sequencing cDNA e spettrometria di massa peptide fingerprinting ha notevolmente facilitato la scoperta di queste proteine ​​veleno 15. Tuttavia, tale lavoro ha inizio con la raccolta di veleno sufficiente e / o ghiandole velenifere dei ragni, e la documentazione dettagliata per tali tecniche sono pochi 16. Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno e veleno ghiandole di ragni vedova nera, che può essere applicato ai ragni di dimensioni simili. La collezione di veleno separatamente dalle ghiandole permette l&#39;identificazione di proteine ​​che sono secrete nel veleno al contrario di altre proteine ​​che svolgono funzioni cellulari. Vedove nere ed altrospecie atrodectus sono ampiamente riconosciuti tra i ragni più pericolosi a causa della loro veleno altamente neurotossico, che causa un forte dolore negli esseri umani, che a volte è accompagnata da abbondante sudorazione, contrazioni muscolari, ipertensione, difficoltà respiratorie e paralisi chiazze 5. Il protocollo di raccolta veleno qui presentata utilizza elettro-stimolazione per fornire corrente elettrica ai ragni anestetizzati di suscitare contrazioni muscolari e il rilascio di veleno. Goccioline Venom sono rapidamente raccolti con micro-capillari e dispensati in provette per la conservazione congelatore. Dato che il protocollo prevede procedure pericolose, deve essere eseguito esclusivamente da personale ben addestrato e cautela è invitato a passaggi chiave. Il veleno raccolto ha numerosi usi, quali la caratterizzazione e l&#39;isolamento di molecole costituenti 2, per gli esperimenti fisiologici o test funzionali 18, e per stimolare il veleno espressione genica 11. Il protocollo si conclude con una description della ghiandola del veleno dissezione e la conservazione utili per il clonaggio di geni specifici veleno, la cui espressione è stato verificato 2-3 giorni successivi veleno deplezione in diversi ragni 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Veleni sono chimicamente secrezioni complesse in genere composto da numerose proteine ​​e peptidi con varie attività fisiologiche. Caratterizzazione funzionale di proteine ​​del veleno ha importanti applicazioni biomediche, tra cui l&#39;identificazione di cavi di droga o sonde per i recettori cellulari. I ragni sono la maggior parte delle specie ricca clade degli organismi velenosi, ma i veleni di solo poche specie sono ben compresi, in parte a causa della difficoltà associata a raccogliere quantità di veleno minute da piccoli animali. Questo articolo presenta un protocollo per la raccolta di veleno di ragni con stimolazione elettrica, deve dimostrare la procedura sulla vedova nera occidentale (Vedova nera). Il veleno raccolta è utile per varie analisi a valle, compresa l&#39;identificazione diretta delle proteine ​​tramite spettrometria di massa, saggi funzionali, e la stimolazione dell&#39;espressione genica veleno per gli studi di trascrittomica. Questa tecnica ha il vantaggio rispetto protocolli che isotardi il veleno da intere omogenati delle ghiandole, che non separano i componenti originali veleno dalle proteine ​​cellulari che non vengono secreti come parte del veleno. Rappresentante risultati dimostrano l&#39;individuazione di noti peptidi del veleno del campione raccolto con la spettrometria di massa. La procedura di raccolta veleno è seguito da un protocollo per dissezione ghiandole velenifere ragno, con risultati dimostrano che questo porta alla caratterizzazione di proteine ​​e peptidi-veleno espresso a livello di sequenza.

La raccolta di veleno e di ghiandole del veleno dissezioni sono spesso eseguite per caratterizzare le proteine ​​del veleno e peptidi a livello di sequenza 10,11,15. Raccolta veleno può essere utilizzato anche in saggi fisiologici per determinare le loro attività funzionali 18. La raccolta di veleno stimolerà veleno espressione genica della ghiandola, facilitando in tal modo la clonazione di specifici trascritti tossina tramite RT-PCR 10,11. Identificazione di proteine ​​del veleno può essere eseguita in modo high-throughput, integrando tecniche di spettrometria di massa standard con le banche dati di sequenza generati dalle biblioteche ghiandola del veleno di cDNA 15,21. Un esempio di tale lavoro, partendo dal veleno e ghiandole raccolti utilizzando il protocollo descritto sopra, dimostrando la sua efficacia, è illustrato in Figura 1. Venom raccolti da L. Hesperus femmine adulte è stato digerito con tripsina e sottoposti ad un in soluzioneAnalisi MudPIT, che collega HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) per spettrometria di massa tandem (MS / MS). Qui l&#39;analisi MudPIT è stata effettuata dalla University of Arizona Proteomica Consortium. Le masse dei peptidi rilevati e loro frammenti dissociati (ioni figlia, desunti dagli spettri) sono stati confrontati con sequenze peptidiche teoricamente previsti da traduzioni di sequenze di cDNA ottenuti da una libreria di espressione genica costruito da L. Hesperus ghiandole velenifere (ghiandole sono stati acquisiti dal protocollo di dissezione descritto sopra) 21. In questo esperimento, 36 proteine ​​sono state rilevate da tutti gli spettri raccolti, sulla soglia di probabilità del 99,9%, e contenevano almeno un peptide rilevato. Una delle proteine ​​rilevate è supportato da 43 spettri totale (spettri esemplare mostrato in Figura 1A), corrispondenti a tre peptidi esclusive, che copre il 35% della sequenza della proteina (Figura 1B). La proteina rilevata (tradotto da un collecte<html> d cDNA) è un successo BLASTP superiore per latrodectin dalla L. tredecimguttatus (GenBank adesione P49125.1), con un e-punteggio 2e-46, e condivide 80% di identità a livello di sequenza aminoacidica della proteina rilevata in questo esperimento. Latrodectin, che è anche conosciuto come proteina a basso peso molecolare alfa-latrotoxin, è un componente veleno riconosciuta di vedova nera ragni 22, 23, verifica dell&#39;efficacia del protocollo presentato. Alcune proteine ​​identificate dal veleno corrispondono a sequenze per le quali si trova nessun colpo BLAST. Non è chiaro se tale risultato è dovuto alle limitate risorse genomiche disponibili per ragni, nonché le informazioni funzionali limitata per le proteine, o perché la proteina sconosciuta rappresenta un contaminante veleno. Tuttavia, gene o l&#39;espressione della proteina analisi esaminando l&#39;abbondanza di una proteina simile romanzo in ghiandole velenifere rispetto ad altri tessuti dovrebbero rivelare se si tratta di un componente del veleno vero e proprio. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: peptide Latrodectin identificato dal nero vedova veleno mediante spettrometria di massa (A) spettri Rappresentante (uno dei 43) rilevata tramite porzione MS / MS di analisi MudPIT di L.. hesperus veleno che è stato assegnato a una versione prevista una sequenza di cDNA raccolto mostrato nella parte B. Spectra mostra massa per caricare il rapporto (m / z) degli ioni figlia rilevati sull&#39;asse orizzontale prodotta dalla frammentazione peptide controllante (CGEEDFGEEIVK), con lettere in alto che indica la sequenza di peptidi sulla base di masse di ioni figlia. (B) sequenza della proteina a cui spettri nella parte A è stato assegnato, mostrando in rosso, grassetto e testo sottolineato la corrispondente sequenza dal spettri di cui alla parte A, ulteriore testo rosso (non in grassetto) rappresenta un altro peptide in questa proteina rilevato con altre sp raccolteECTRA. La sequenza della proteina è tradotto da una sequenza di cDNA ottenuto da ghiandole velenifere sezionati.

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Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Questo articolo fornisce un protocollo per l&#39;estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica.

Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

JoVE Journal

Biology

33.2K Views.  University of Massachusetts Lowell.  Questo articolo fornisce un protocollo per l'estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica. 

Video: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separazione elettroforetica delle proteine

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Tossina induzione ed estrazione di proteine ​​da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Isolamento di microRNA da colture di ghiandole salivari Tick Ex Vivo e vescicole extracellulari

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...