Ich danke den folgenden Personen für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier und Mays Imad. Massenspektrometrie und Proteomik-Daten wurden von der Arizona Proteomics-Konsortium durch NIEHS Zuschuss ES06694 zum SWEHSC, NIH / NCI Zuschuss CA023074 zum AZCC unterstützt und von der BIO5 Institut der Universität von Arizona erworben. Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (Nationales Institut für Allgemeinmedizin) aus Zuschüssen 1F32GM83661-01 und 1R15GM097714-01 Jessica E. Garb vorgesehen.

1. Herstellung von Elektro-Stimulator Vorrichtung <ol><li> Verbinden elektro Stimulator Netzkabel an eine Steckdose und befestigen externen Fußschalter zum externen Signaleingang. Hinweis: Elektrische Leitungen müssen gut isoliert und freiliegenden Metall liefert Strom sollte nicht berührt werden. Wear Latex oder Nitril Handschuhe zum Schutz. Electro-Stimulator Netzschalter sollte in der Position OFF beim Anbringen Netzkabel und Befestigungsdrähte sein. </li><li> Verbinden Sie die positive Elektrode auf rot Ausgangsklemme auf elektro-Stimulator (wenn Polaritätsschalter ist im normalen Modus) und verbinden Sie den negativen Elektrode mit der schwarzen Ausgangsklemme. Hinweis: Jeder Elektrodendraht sollte in einer Krokodilklemme zu beenden. </li><li> Stellen Stimulator mit den folgenden empfohlenen Voreinstellungen: Spannung = 7 V, Frequenz = 1 Impulse pro Sekunde, Delay = 0 Millisekunden Dauer = 200 Millisekunden wechseln Zwillingsimpulse = regelmäßige und Modus-Schalter = off. </li><li> Testausgang von Elektroden durch Anbringen Krokodilklemmen an voltmeter positive und negative Messleitungen. Schalten Sie Stimulator Netzschalter und liefern Strom mit Fußpedal. </li></ol> 2. Vorbereitung der Immobilisierung Pinzetten und anderen Stoffen <ol><li> Tauchen Sie ein Zinken der Federzange in flüssige Kunststoffbeschichtung und warten vier Stunden Beschichtung trocknen lassen. Dicht wickeln 15 mm von der Spitze des gegnerischen Zinke mit einer einzigen Schicht aus Baumwolle Nähgarn, und befestigen Faden durch das Binden Sie das Ende in einem Knoten. Hinweis: Das Gewinde wird verwendet, um eine Salzlösung aufgebracht, die elektrische Leitfähigkeit fördert absorbieren, während die Kunststoffbeschichtung eine Isolierung zu verzögern Strom. </li><li> Cut Spitze stumpfen Injektionsnadel mit einer scharfen Schere und glätten die Öffnung mit Sandpapier. Befestigen Sie die Nadel mit einer Vakuum Siphon (zB Vakuumfilter Kolben) über Schläuche. Hinweis: Die Nadel wird der Sog entfernt Wasser und erbrechen, und dienen dazu, die Schaltung, die durch die Stimulators Elektroden abzuschließen. Die Nadelöffnung must klein genug, um die Spinne nicht schaden können, aber groß genug, um Vakuumlösung ohne zu verstopfen (zB 25 G x 1 ½ im Gauge finden Materialliste). </li><li> Position im Federzange horizontal in einem dicht geschlossenen Position mit einer Vinylummantelung zweigleisigen Klemme an einen Magnetfuß oder festen Standgerät unter Sichtfeld einem Binokular gesichert, mit Kunststoff beschichtet Zinke Pinzette auf und fädeln beschichtet Stift auf der Unterseite. Hinweis: Die Zwei-Säulen-Klemme in einer stationären Position zu der magnetischen Basis durch einen Klemmhalter gehalten (siehe Materialliste). Ein Gummiband kann eng um Zinken der Federzange befestigt werden, neben dem Klammerhalter, um zusätzlichen Druck auf die Federzange in einer geschlossenen Position um die Spinne einmal eingeführt halten hinzuzufügen. </li><li> Bringen positive Elektrode Krokodilklemme an Pinzette &quot;Bottom Zinke vorgeGewinde und befestigen negativen Krokodilklemme an Metallvakuum Nadel stumpf. </li&gt; <li> Testschlussstrom mit Voltmeter, indem positive Leitung auf Pinzette Zinke zwischen Gewinde und Krokodilklemme und Platzierung Minusleitung auf stumpfe Vakuum Nadel. Drücken Sie Fußpedal, um eine ausreichende Strom erkannt wird, und entfernen Sie Leads, wenn genügend Strom erkannt wird. </li><li> Bereiten Sie mehrere Mikrokapillarröhrchen für Gift Kollektion. Halten Sie ein Einzel Mikrokapillarröhre an einem Ende mit einer behandschuhten Hand und am anderen Ende mit sterilem Metallzange, indem die Zange gehaltene Ende horizontal über einem Bunsenbrenner-Flamme. Ziehen Sie am mikrokapillaren mit den Metallzangen von der Flamme weg, um eine längliche Spitze zu schaffen, während das andere Ende in einer stationären Position halten. Hinweis: Schutzbrille tragen als Mikrokapillaren kann leicht brechen. </li><li> Ruhen bereit Mikrokapillaren auf einer Montage putty Streifens in einer Petrischale. Untersuchen mikrokapillaren endet unter einem Binokular und erstellen Sie eine kleine, abgeschrägte Öffnung am Ende zog mit sterilisierten Metallzangen. </li><li> Label variable Anzahl von sterilen 0,5-ml-Röhrchen. Hinzufügen sterile, entionisiertem Wasser auf Rohren steril (beispielsweise 5 &amp; mgr; l entionisiertem Wasser autoklaviert). Schließen Rohre und Ort Röhrchen auf Eis. </li><li> Bereiten Kochsalzlösung in einem Becherglas und füllen einen zweiten Becher mit autoklaviert Wasser. </li></ol> 3. Immobilisierung von Spider in Zange <ol><li> Schalten Sie CO 2 Tank und übertragen Spinne aus geschlossenen Kunststoffsammelfläschchen (siehe Materialliste) in CO 2 Kammer mit langen Metallzange. Hinweis: Schwarzen Witwen haben gefährliche Gift; immer Handschuhe tragen während dieser Protokoll. </li><li> Halten Spinne in Kammer für 5-10 min oder bis narkotisierten und bewegt sich nicht mehr, wenn sanft mit langen Zangen angestachelt. Verwenden Transferpipette Thread auf Pinzette mit Kochsalzlösung befeuchten. Hinweis: Richtlinien zur CO 2 Anästhesie Parameter für schwarze Witwen, siehe Spagna und Moore 19. </li><li> Abrufen betäubten Spinne von CO 2Kammer, indem man es durch seine Vorderbeine mit stumpfen Dissektionszangen und behandschuhten Händen. Bewegen Sie betäubt Spinne Pinzette Gerät Federgewicht. Separate Zinken geschlossenen Federzange und legen Sie das Spinnen cephalothorax in zwischen den Zinken und lassen die Zinken zu schließen gefahren, damit der Spinne zu gewährleisten ist fest an ihrem Platz gehalten, aber nicht erdrückt. Stellen Sie sicher, dass die Spinne gelegt Panzers Rücken Seite nach unten (siehe Foelix 20 für Führungsspinnenanatomie), am Gewinde beschichtet Stift ruht und Bauchseite des Panzers ist der Kunststoffbeschichtung gegenüber, während die positive Elektrode bleibt nach unten Zinke befestigt. Arbeiten Sie schnell beim Umgang mit Spinne. </li><li> Passen Binokular Vergrößerung, Fokus und Lichtquelle, bis das Spinnen Cheliceren und Reißzähne sind deutlich sichtbar. </li></ol> 4. Venom Sammlung <ol><li> Schalten Sie Vakuum und Spray Spinne Cheliceren mit Wasser-Lösung unter Verwendung eines zweiten stumpfer Spitze Spritze needle. Absaugen entfernt Wasser mit Vakuum Nadel um Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Berühren Sie die Nadel mit Vakuum angebracht negativen Elektrode zur Spinne Rostrum und liefern Puls mit Fußpedal ein- oder mehrmals. Vakuum entfernt erbrechen, wenn nötig. Hinweis: Spinne Rostrum ist im Mund hinter auf dorsalen Fläche zwischen Cheliceren und endites (siehe Foelix 20 für detaillierte Spinne Anatomie) Chelicerae. Hinweis: Bei jedem Impuls wird Beinen Vertrag der Spinne und Gift sichtbar klaren Tröpfchen, die aus Fängen sein. </li><li> Sammeln Gift Tropfen mit mikrokapillaren Spitze und Transfer Kapillarspitze in 0,5-ml-Röhrchen mit Wasser oder Pufferlösung (Lösung wird in die Kapillare gesaugt werden). Hinweis: Vermeiden Sie Stechen Spinne mit Kapillare, die Hämolymphe Kontamination und Tod führen kann. Vermeiden Sie auch Kontamination Kapillare mit Seide und Leim aus Spinndüsen. </li><li> Bringen Transferspritze mit Schlauchadapter an mikrokapillaren (am Ende gegenüber Sammelspitze) und dispense Giftlösung wieder in Rohr. Setzen Röhrchen auf Eis. Hinweis: Entsorgung Kapillaren in einem nahe gelegenen Behälter für scharfe Gegenstände. </li><li> Zeigen offenen Kunststoffsammelfläschchen, zusammen mit seiner Mütze, in der Nähe der Spinne. Fassen Sie vorsichtig die Spinnenbeine mit stumpfen Dissektionszangen in einer Hand gehalten und vorsichtig öffnen Federzange Zinken mit der anderen Hand, Schiebe Spinne in das Sammeln Fläschchen mit stumpfen Pinzette und schnell nahe Kappe. Fahren Sie mit nächsten Spinne und speichern Gift enthaltenden Röhrchen in -80 ° C Gefrierschrank, wenn Sie fertig. Hinweis: weiterhin Vorsicht walten lassen beim Bewegen der Spinne von der Pinzette wieder in das Fläschchen. Sicherstellen, dass die Sammelfläschchen mit Verschluss ist in der Nähe, um die Spinne für seine raschen Transfer und Handschuhe tragen. </li></ol> 5. Giftdrüse Dissections <ol><li> Zwei bis drei Tage nach der Giftsammlung, betäuben Spinne in CO 2 Kammer (siehe Schritt 3.1). Füllen flüssigem Stickstoff Träger und Platz neben Binokular. Hinweis: when Arbeiten mit flüssigem Stickstoff, Verwendung Augenschutz und Tieftemperatur Handschuhe. </li><li> Saubere Dissektion Bereich und Pinzette mit Lösung, RNase und DNA-Kontamination beseitigt. Füllen einer kleinen Petrischale unter Präpariermikroskop mit Sezieren Puffer (zB 1x mit Kochsalzlösung (SSC) Puffer) gegeben. </li><li> Transfer Spinne von CO 2 Kammer auf Petrischale und benutzen Pinzette schnell trennen die cephalothorax aus dem Bauch. </li><li> Halten Sie die cephalothorax unter dem Binokular mit einer Pinzette und positionieren Sie den Cheliceren in das Sichtfeld. Mit den scharfen Enden einer zweiten Pinzette zur Nagelhaut schneiden Beitritt des Panzers zu den seitlichen Aspekte der Cheliceren. Seitlich fassen die Cheliceren Verwendung der zweiten Pinzette, und sanft zerren und zurück, bis Giftdrüsen herausgezogen. </li><li> Separate Drüsen aus der Cheliceren (oder lassen befestigt Chelicerae falls gewünscht) zu einem cyrosafe 0,5-ml-Röhrchen und Transfer. Platz closed Röhre in flüssigem Stickstoff. Hinweis: Jeder Dissektion sollte nicht mehr als 15 Minuten dauern. </li><li> Wiederholen Dissektion mit zusätzlichen Spinnen bis beendet. Übertragungsrohre aus flüssigem Stickstoff in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol>

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	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

Der Autor hat nichts zu offenbaren und keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Gifte sind eine wesentliche Quelle von physiologisch reaktiven Proteinen, Peptiden und anderen Molekülen mit Anwendungen für die Wirkstoffentwicklung, als auch für grundlegende Aspekte der zellulären und ökologische Forschung 3.1. Allerdings ist die Sammlung von Gift, vor allem aus gefährlichen oder kleine Tiere, ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Dieses Protokoll zeigt, wie Gift und Giftdrüsen kann von Schwarzen Witwen gesammelt werden, und bestätigt den Erfolg dieses Ansatzes über eine Kombination aus mudPIT Analyse des Giftes und einem Protein-Datenbank von cDNAs abgeleitet vom Gift geklont Verschraubungen 21. Während dieses Protokoll funktioniert gut für schwarze Witwen und mittelgroße Spinnen, andere Gift Sammlung Techniken für größere mygalomorph (Tarantel-like) Spinnen, wie direkten Absaugen von Gift aus Fänge in Glaspipetten zB 24. Dieser letztere Ansatz verwendet worden, jedoch , wird nicht gut für kleinere Spinnen, die nicht aggressi werden arbeitenve. Ein besonders wichtiger Aspekt der hier beschriebenen Gift Sammelprotokoll ist die Anfangsphase der Herstellung und Optimierung des Sammelprozesses, so dass es mehr Routine, konsistente und schneller. Das Protokoll ist zunächst schwer zu meistern, jedoch mit wiederholten Versuchen, wird es einfacher und schneller. Vorsicht ist auch bei allen kritischen Phasen, die den Umgang mit gefährlichen Spinnen, die Verwendung von elektrischem Strom, feine Punktglasmikro Kapillaren und Spritzennadeln gedrängt. Es ist wichtig, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen wie Nitril-Handschuhe, einen Laborkittel, lange Hosen und geschlossene Schuhe sowie Brillen bei der Gestaltung Mikro Kapillaren. Eine weitere Herausforderung bei den Gift-Kollektion ist die geringe Menge des Giftes von einem Spinnen, insbesondere Latrodectus-Arten, von denen die Mengen gesammelt werden, können li sein produziertbestenfalls 1-2 Mikroliter pro Einzel grenzten. Erhalten ausreichender Gift für Downstream-Anwendungen, wie zB Protein-Gele oder funktionelle Assays kann die Kombination von Gift aus mehreren Individuen in einem Rohr erforderlich. In solchen Fällen sollte Gift nur von Personen gleichen Geschlechts, ontogenetische Stufe kombiniert werden, und die Bevölkerung angesichts der Anerkennung von intersexuellen, Entwicklungs- und geographische Variabilität in manchen Giften 25, 26. Spinnen kann auch aufweisen, eine beträchtliche Variation in der Menge an Gift unter Individuen, wobei geringere Mengen der letzten Entleerung der Drüse reflektieren hergestellt. So kann es ratsam sein Gift mehrere Tage nach ihrem letzten Fütterung sammeln. Wenn kleine Gift freigesetzt wird, sollte ein übermäßiger Strom nicht an die Spinne, die bewirken können, die Kutikula zu Bruch angelegt, was zur Verunreinigung des Giftes mit Hämolymphe oder Tod. Die Kontamination von Proben mit Spinnengift silk oder menschlichen Quellen auch durch die Verwendung von sterilen oder sauberen Ausrüstung vermieden werden. Trotz dieser Herausforderungen Sammlung von reinen Gift, so dass die Spinne lebt, ist vorzuziehen, Methoden, die Gift aus Drüsen Homogenate (die nicht trennen Giftkomponenten von anderen zellulären Proteinen) und töten die Spinne zu erhalten. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die Proben schnell eingefroren, um Proteinabbau zu verhindern. Die Extraktion von Gift fördert spätere Giftproduktion, wodurch Gift Genexpression stimulierende im Giftdrüse. So, da dieses Protokoll ermöglicht Spinnen Gift Verarmungs überleben kann ihre Drüsen seziert werden einige Tage später (die Tötung der Spinne) an einem Punkt, wo Gift Genexpression wird erwartet, ausreichend für genetische Studien, wie Transkript Klonen 10,11 zu sein. Einige wichtige Vorsichtsmaßnahmen müssen auch Giftdrüse Dissektionen genommen werden. Der Schwerpunkt sollte auf mit Labor equipm platziert werdenent und Reagenzien, die frei von RNasen, die RNA abbauen. So wird empfohlen, Zangen und anderen nicht-Einweg-Geräte und Oberflächen mit Lösungen, die RNase und DNA-Kontamination zu beseitigen wischen. Die Sektionen sollte so schnell wie möglich direkt gefrorenen geführt werden, um weiter sicherzustellen, RNA Integrität des Gewebes. Schließlich sollte Dissektionen nur betäubt Spinnen durchgeführt werden, nachdem ihre cephalothorax und Bauch sind schnell getrennt. Abschließend dieser Artikel bietet eine überprüfte Protokoll zu Spinnengift und Giftdrüsen erhalten. Venom und Giftdrüsen ermöglichen die Isolierung und Charakterisierung ihrer Protein- und Peptid-Komponenten mit proteomischen und transkriptomischen Ansätze. Zusätzlich kann Gift Proben der Ausgangspunkt der funktionellen Assays, die die biomedizinische und pharmakologische Potenzial ihrer konstituierenden Moleküle bestimmen zu vertreten. Fast alle Spinnen produzieren Gift, und die breite Taucherversität Giftkomponenten von einzelnen Spezies synthetisiert schlägt eine große Vielfalt der Giftmoleküle noch nicht entdeckt zu 13 werden. Entsprechend stellt dieses Protokoll Werkzeuge, um die reiche Quelle von im Spinnengifte vorhanden biologisch aktive Moleküle zu untersuchen.

Gifte sind tierische Sekrete vorwiegend in ein anderes Tier für die Zwecke der Plünderung oder verteidigungs injiziert, und haben auch wichtige biologische Anwendungen mit biomedizinischer Relevanz 1-3. Nur bestimmte Tiere synthetisieren Gift, aber seine Produktion ist taxonomisch auf wirbellose Tiere (zB Nesseltiere, Kegelschnecken, Skorpione und Spinnen) und Wirbeltieren (zB Schlangen, einige Fische und Säugetiere) weit verbreitet, weil sie unabhängig voneinander entwickelt hat mehrfach 1,4 . Biochemische Charakterisierung Gifte Regel zeigen sie aus einer Vielzahl von Proteinen und Peptiden, die im Wesentlichen auf den Kreislauf und das Nervensystem von injizierten Tieren handeln schnell liefern Bestand Toxine 1 zusammengesetzt. Ein kleiner Bruchteil der giftigen Tieren eine Gefahr für den Menschen, vor allem Arten mit synanthrop Verteilungen 5 darstellen. Die Studie von Gift Zusammensetzung und funktionelle Aktivitäten eine wichtige Rolle spielenDie funktionelle Charakterisierung von Wirbel zellulären Komponenten (insbesondere neuronalen Ionenkanäle) 6 und bei der Aufklärung grundlegender zellulärer Prozesse (zB Neurosekretion) 7. Darüber hinaus wählen Sie Gift Peptide haben nützliche Eigenschaften in der biomedizinischen Kontexten, einschließlich ihrer Verwendung als Behandlungen für Krebs und Schmerzen 8,9 und sind für Arzneimittelkandidat Leads und Gegengift Entwicklung abgebaut. Venoms spielen eine herausragende Rolle in ökologischen und evolutionären Forschung 1,4,10,11, damit die Sammlung dieser gefährlichen Sekret hat viele Versorgungsunternehmen. Es gibt&gt; 40.000 beschriebenen Spinnenarten (Order Araneae), und alle, aber einer der mehr als 100 Spinnenfamilien besitzen gepaart Giftdrüsen, die Reißzähnen in der 12 zu beenden. Die hohe Artenvielfalt von Spinnen legt nahe, dass sie die größte Clade von giftigen Organismen darstellen. , Biochemische Charakterisierung von Spinnengifte hat jedoch largely auf einer kleinen Anzahl von Arten, die am häufigsten mit menschlichen envenomation zugeordnet engt. Aktuelle Proteom und Transkriptom-Studien von Spinnengiften zeigen sie enthalten typischerweise viele einzigartige Proteine ​​und Peptide 2,13,14. Fortschritte in der Hochdurchsatz-Sequenzierung und cDNA-Massenspektrometrie Peptidfingerprinting hat stark die Entdeckung dieser Giftproteine ​​15 erleichtert. Dennoch beginnt diese Arbeit mit der Sammlung von ausreichender Gift und / oder Giftdrüsen aus den Spinnen und detaillierte Dokumentation für solche Techniken sind einige 16. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Sammlung von Gift und Giftdrüsen von Schwarzen Witwen, die zu ähnlich großen Spinnen angewendet werden können. Die Sammlung von Gift getrennt von den Drüsen ermöglicht die Identifizierung von Proteinen, die in dem Gift abgesondert werden, im Gegensatz zu Proteinen, die Ausführung anderer zellulärer Funktionen. Schwarz Witwen und andere Latrodectus Arten werden weitgehend als einer der gefährlichsten Spinnen aufgrund ihrer hoch neurotoxische Gift, die starke Schmerzen beim Menschen verursacht, die manchmal durch starkes Schwitzen, Muskelkontraktionen, Bluthochdruck, Atembeschwerden und lücken Lähmung 5 begleitet wird anerkannt. Die hier vorgestellte Gift Sammlung Protokoll verwendet Elektrostimulation, um elektrischen Strom zu anästhesie Spinnen liefern an Muskelkontraktionen und die Freisetzung von Gift entlocken. Venom Tröpfchen schnell mit Mikro-Kapillaren gesammelt und in Rohre für Tiefkühllagerung verzichtet. Da das Protokoll beinhaltet gefährliche Verfahren, sollte es nur von gut ausgebildeten Personen durchgeführt werden und Vorsicht ist bei wichtigen Schritten gedrängt. Die gesammelten Gift hat zahlreiche Anwendungen, wie die Charakterisierung und Isolierung von konstituierenden Moleküle 2, für physiologische Experimente oder funktionellen Assays 18, und Gift Genexpression 11 stimulieren. Das Protokoll schließt mit einem description der Giftdrüse Präparation und Konservierung, die für die Klonierung von Gift-spezifischen Genen, deren Expression wurde gezeigt, dass 2-3 Tage nach venom Verarmungs in verschiedenen Spinnen 10,11 erfolgen.

<table><tbody><tr><td>Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&amp;nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td></tr><tr><td>Voltmeter</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td></tr><tr><td>Pointed Featherweight Forceps</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&amp;#189; in Precision Glide hypodermic syringe needle</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter flask 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>smaller flask sizes may also work</td></tr><tr><td>Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;#956;l Capillary Bores (Micro capillaries)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Mounting putty strip&amp;nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td></tr><tr><td>Foot switch/pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>similar models could be substituted</td></tr><tr><td>Clamp Holder</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td></tr><tr><td>Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td></tr><tr><td>Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Cotton sewing thread</td><td>Joann fabric and craft store</td><td>7245855</td><td>similar product could be substituted</td></tr></tbody></table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Gifte sind chemisch komplexe Sekrete typischerweise aus zahlreichen Proteinen und Peptiden mit unterschiedlichen physiologischen Aktivitäten. Funktionelle Charakterisierung Gift Proteine ​​hat wichtige biomedizinische Anwendungen, einschließlich der Identifizierung von Leitstrukturen oder Sonden für zelluläre Rezeptoren. Spinnen sind die meisten Arten reichen Clade von giftigen Organismen, aber die Gifte von nur wenigen Arten gut verstanden, teilweise aufgrund der Schwierigkeit, mit dem Sammeln von winzigen Mengen Gift von kleinen Tieren verbunden. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Sammlung von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, was die Prozedur auf dem westlichen Schwarzen Witwe (Latrodectus hesperus). Die gesammelte Gift ist nützlich für abwechslungsreiche Downstream-Analysen einschließlich direkter Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie, funktionelle Assays und Stimulation von Gift Genexpression für transkriptomischen Studien. Diese Technik hat den Vorteil gegenüber Protokolle, isoSpätgift aus ganzen Drüse Homogenate, die nicht trennen echten Giftkomponenten von zellulären Proteinen, die nicht als Teil des Giftes sezerniert werden. Repräsentative Ergebnisse zeigen die Detektion von bekannten Gift-Peptiden aus der gesammelten Probe mittels Massenspektrometrie. Das Gift Sammelprozedur wird durch ein Protokoll zum Präparieren Spinnengiftdrüsen, wobei die Ergebnisse zeigen, dass dies zur Charakterisierung Gift-exprimierte Proteine ​​und Peptide auf Sequenzebene folgt.

Die Sammlung von Gift und Giftdrüse Dissektionen werden häufig durchgeführt, um Gift Proteine ​​und Peptide auf Sequenzebene 10,11,15 charakterisieren. Erhaltene Gift kann auch in physiologischen Assays verwendet, um die funktionellen Aktivitäten 18 zu bestimmen. Die Sammlung von Gift wird Giftdrüse Genexpression stimulieren, wodurch die Klonierung von spezifischen Toxin Transkripte über RT-PCR 10,11 Erleichterung. Identifizierung von Giftproteine ​​können auch in einem Hochdurchsatz-Art und Weise durch Integration von Standard Massenspektrometrie mit Sequenzdatenbanken von Giftdrüse cDNA-Bibliotheken erzeugt 15,21 erreicht werden. Ein Beispiel für eine solche Arbeit, ausgehend von Gift und Drüsen gesammelt unter Verwendung des Protokolls oben beschrieben, zeigt seine Wirksamkeit, wird in Abbildung 1 veranschaulicht. Gift von L. gesammelten hesperus erwachsenen Weibchen wurde mit Trypsin verdaut und an ein in Lösung unterzogenMudPIT Analyse, die HPLC (High Performance Liquid Chromatography), um Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) verbindet. Hier wurde die mudPIT Analyse durch die Universität von Arizona Proteomics-Konsortium durchgeführt. Massen erkannt Peptide und ihre distanzierte Fragmente (Tochterionen, abgeleitete von Spektren) wurden Peptidsequenzen theoretisch aus Übersetzungen von cDNA-Sequenzen aus einem Gen-Expressionsbibliothek aus L. konstruiert erhalten prognostiziert im Vergleich hesperus Giftdrüsen (Drüsen wurden von der Dissektion Protokoll erworben oben beschrieben) 21. In diesem Experiment wurden 36 Proteine ​​aus allen gesammelten Spektren detektiert, an der Wahrscheinlichkeitsschwelle von 99,9% und enthielt wenigstens einen detektierten Peptids. Eine der nachgewiesenen Proteine ​​von 43 insgesamt Spektren (in 1A gezeigten beispielhafte Spektren) unterstützt wird, die den drei exklusive Peptiden, dabei 35% der Proteinsequenz (Abbildung 1B). Die nachgewiesene Protein (übersetzt aus einer collecte<html> d cDNA) eine obere BLASTp Hit von L. latrodectin tredecimguttatus (GenBank Accession P49125.1), mit einem E-Score von 2e-46, und teilt 80% Identität auf Aminosäureebene mit der Sequenz, die in diesem Experiment nachgewiesen Protein. Latrodectin, die auch als alpha-Latrotoxin niedermolekularen Proteins bekannt, ist ein anerkannter Gift Bestandteil Schwarzen Witwen 22, 23, die Überprüfung der Wirksamkeit der vorgestellten Protokoll. Einige Proteine, die aus dem Gift identifizierten Sequenzen entsprechen, für die keine BLAST Treffer gefunden wird. Es ist unklar, ob ein solches Ergebnis ist aufgrund der begrenzten Ressourcen für die genomische Spinnen zur Verfügung sowie die begrenzte Funktionsinformationen für die Proteine, oder weil das unbekannte Protein stellt einen Giftverunreinigung. Dennoch Gens oder der Proteinexpression analysiert Untersuchung der Abundanz eines solchen neuartigen Proteins in Giftdrüsen relativ zu anderen Geweben sollten zeigen, ob es eine echte Gift-Komponente ist. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1: Latrodectin Peptid aus der schwarzen Witwe Gift mittels Massenspektrometrie identifiziert (A) Repräsentative Spektren (einer von 43) über MS / MS Teil mudPIT Analyse der L. erkannt. hesperus venom die vorhergesagte Translation eines teil B. Spectra gezeigt gesammelten cDNA-Sequenz zugeordnet wurde zeigt Massenverhältnis (m / z) der detektierten Sekundärionen auf das durch Fragmentieren Stammpeptid (CGEEDFGEEIVK) erzeugten Horizontalachse berechnen, mit Buchstaben oben Angabe der Peptidsequenz basierend auf Tochterionen Massen. (B) Proteinsequenz, auf die Spektren in Teil A zugewiesen wurde, zeigt in rot, fett und unterstrichen Text der entsprechenden Sequenz aus dem in Teil A gezeigten Spektren, zusätzliche rote Text (nicht fett) stellt mit anderen gesammelten sp anderes Peptid in diesem Protein nachgewiesenectra. Die Proteinsequenz wird aus einer cDNA-Sequenz aus sezierten Giftdrüsen erhalten rechnet.

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Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Extraktion von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, um 1) durchzuführen Proteom Charakterisierung, 2) stimulieren Giftdrüse Genexpression, und 3) durchführen funktionelle Studien von Giften. Dies wird durch eine Beschreibung der Giftdrüse Mikrodissektionen für Genexpressionsstudien gefolgt.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

JoVE Journal

Biology

33.3K Aufrufe.  University of Massachusetts Lowell.  Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Extraktion von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, um 1) durchzuführen Proteom Charakterisierung, 2) stimulieren Giftdrüse Genexpression, und 3) durchführen funktionelle Studien von Giften. Dies wird durch eine Beschreibung der Giftdrüse Mikrodissektionen für Genexpressionsstudien gefolgt. 

Serie: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Forschung

Biologie

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Umwelt

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Biochemie

Parasitierung des künstlichen Wirts durch Trichogramma dendrolimi und Giftextraktion

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Methode zur Extraktion von Gift aus Trichogramma parasitoiden Wespen 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of developing offspring 1,2. Spiders accomplish these tasks by spinning several distinct fiber types that have diverse mechanical properties. Such specialization of fiber types has occurred through the evolution of different silk-producing glands, which function as small biofactories. These biofactories manufacture and store large quantities of silk proteins for fiber production. Through a complex series of biochemical events, these silk proteins are converted from a liquid into a solid material upon extrusion.
Mechanical studies have demonstrated that spider silks are stronger than high-tensile steel 3. Analyses to understand the relationship between the structure and function of spider silk threads have revealed that spider silk consists largely of proteins, or fibroins, that have block repeats within their protein sequences 4. Common molecular signatures that contribute to the incredible tensile strength and extensibility of spider silks are being unraveled through the analyses of translated silk cDNAs. Given the extraordinary material properties of spider silks, research labs across the globe are racing to understand and mimic the spinning process to produce synthetic silk fibers for commercial, military and industrial applications. One of the main challenges to spinning artificial spider silk in the research lab involves a complete understanding of the biochemical processes that occur during extrusion of the fibers from the silk-producing glands.
Here we present a method for the isolation of the seven different silk-producing glands from the cobweaving black widow spider, which includes the major and minor ampullate glands [manufactures dragline and scaffolding silk] 5,6, tubuliform [synthesizes egg case silk] 7,8, flagelliform [unknown function in cob-weavers], aggregate [makes glue silk], aciniform [synthesizes prey wrapping and egg case threads] 9 and pyriform [produces attachment disc silk] 10. This approach is based upon anesthetizing the spider with carbon dioxide gas, subsequent separation of the cephalothorax from the abdomen, and microdissection of the abdomen to obtain the silk-producing glands. Following the separation of the different silk-producing glands, these tissues can be used to retrieve different macromolecules for distinct biochemical analyses, including quantitative real-time PCR, northern- and western blotting, mass spectrometry (MS or MS/MS) analyses to identify new silk protein sequences, search for proteins that participate in the silk assembly pathway, or use the intact tissue for cell culture or histological experiments.

Here we describe an efficient strategy to remove the silk-producing glands from the abdomen of female black widow spiders. This procedure allows the rapid isolation of the seven distinct silk-producing glands in a highly purified fashion, an important process for investigators studying spider silk production and fiber assembly.

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Zusammenfassung

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Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Mikrodissektion von Black Widow Spider Silk-produzierenden Drüsen

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine Venom Produziert in Applied

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Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

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Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied

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