أشكر الأشخاص التالية أسماؤهم لمساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول: تشاك كريستنسن، غريتا بينفورد، اليكس ك لانكستر، كونراد Zinsmaier، وميس عماد. تم الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي والبروتينات التي البروتيوميات اتحاد أريزونا بدعم من منحة ES06694 NIEHS إلى SWEHSC، منحة CA023074 المعاهد الوطنية للصحة / NCI إلى AZCC ومعهد BIO5 من جامعة أريزونا. وقدمت التمويل لهذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني للطب العام) من المنح 1F32GM83661-01 و1R15GM097714-01 لجيسيكا E. غارب.

1. إعداد أجهزة الكهربائية ومشجعا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الكهربائي مشجعا سلك الطاقة إلى منفذ وتعلق دواسة القدم خارجية لإدخال إشارة خارجية. ملاحظة: الأسلاك الكهربائية يجب أن تكون معزولة بشكل صحيح ويجب عدم لمس المعدن يتعرض إيصال التيار. ارتداء قفازات اللاتكس أو النتريل للحماية. وينبغي أن يكون مشجعا الكهربائية مفتاح الطاقة في موقف OFF عندما ربط سلك الكهرباء وربط الأسلاك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل القطب الموجب لالحمراء محطة الانتاج الكهربائية ومشجعا على (عند التبديل الاستقطاب هو في الوضع العادي) وتوصيل القطب السالب إلى محطة الانتاج السوداء. ملاحظة: كل سلك كهربائي يجب أن ينتهي في مقطع التمساح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مشجعا إلى الإعدادات الأولية الموصى بها التالية: الجهد = 7 V، تردد = 1 نبضات في الثانية الواحدة، تأخير = 0 مللي ثانية، والمدة = 200 ميلي ثانية، والبقول التوأم = التبديل العادية، ومفتاح الوضع = إيقاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار الانتاج من الأقطاب الكهربائية عن طريق ربط مقاطع التمساح إلى voltmeثالثا يؤدي اختبار الإيجابية والسلبية. بدوره على مفتاح الطاقة مشجعا وتقديم الحالي مع دواسة القدم. </li></ol> 2. إعداد الشل الملقط وغيرها من المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشق واحد من ملقط وزن الريشة في طلاء من البلاستيك السائل والانتظار اربع ساعات للسماح للطلاء الجاف. التفاف بإحكام 15 ملم من غيض من الشق الآخر مع طبقة واحدة من خيط القطن الخياطة، وتأمين طريق ربط موضوع في نهاية عقدة. ملاحظة: يتم استخدام الخيط لاستيعاب أي محلول ملحي التطبيقية التي تعزز التوصيل الكهربائي، في حين يوفر طلاء بلاستيكي عازل للتؤخر الحالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الإبرة تحت الجلد حادة مع مقص حاد وتسهيل فتح مع الرمل ورقة. إرفاق الإبرة إلى فخ النفايات فراغ (على سبيل المثال، قارورة فراغ فلتر) عبر أنابيب. ملاحظة: إن الإبرة بعيدا شفط المياه واجتر، وسيعمل على استكمال الدوائر التي أنشأتها الأقطاب مشجعا. ومو افتتاح إبرةالحادي تكون صغيرة بما يكفي لعدم الإضرار العنكبوت، ولكن كبيرة بما يكفي لإيجاد حل فراغ دون انسداد (على سبيل المثال، 25 G × 1 ½ في مقياس، انظر قائمة المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط موقف الريشة أفقيا في موقف مغلقة بإحكام باستخدام المشبك ذي شقين المغطاة الفينيل المضمون إلى قاعدة مغناطيسية أو جهاز موقف ثابت تحت حقل مجهر تشريح وجهة نظر، مع البلاستيك المغلفة الشق من ملقط على رأس والخيط المغلفة الشق على الجزء السفلي. ملاحظة: يتم الاحتفاظ المشبك ذي شقين في وضع ثابت إلى قاعدة مغناطيسية من قبل حامل المشبك (انظر قائمة المواد). قد حصلت على الشريط المطاطي بإحكام حول شوكات من ملقط وزن الريشة، إلى جانب حامل المشبك، إضافة إلى ضغوط إضافية للحفاظ على ملقط وزن الريشة في موقف مغلقة حول العنكبوت مرة واحدة قدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق إيجابي كليب القطب التمساح إلى الشق السفلي ملقط &quot;المنبع من موضوع ونعلق مقطع التمساح السلبي لفظة فراغ إبرة معدنية. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار الدوائر الحالية مع الفولتميتر من خلال وضع الرصاص إيجابي على ملقط الشق بين الخيط ومقطع التمساح ووضع الرصاص سلبي على إبرة حادة فراغ. الصحافة دواسة القدم لضمان الكشف عن التيار كافية وإزالة الخيوط إذا تم الكشف الحالية كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عدة أنابيب microcapillary لجمع السم. عقد أنبوب microcapillary واحد في نهاية واحدة مع يد القفاز وعلى الطرف الآخر مع ملقط معقم المعدنية، ووضع نهاية عقد ملقط أفقيا فوق لهب الموقد بنسن. سحب على microcapillary مع ملقط معدني بعيدا عن اللهب لخلق تلميح ممدود، بينما يمسك الطرف الآخر في وضع ثابت. ملاحظة: ارتداء النظارات الواقية كما microcapillaries يمكن كسر بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> راحة microcapillaries مستعدة على تصاعد الشريط المعجون في طبق بتري. دراسة microcapillary ينتهي تحت مجهر تشريح وخلق، مشطوف فتحة صغيرة في نهاية سحبت مع ملقط معقم المعادن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاعدد متغير من بيل العقيمة 0.5 مل أنابيب. إضافة عقيمة، منزوع الأيونات الماء إلى أنابيب معقمة (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات تعقيمها). أنابيب وثيقة وأنابيب مكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول ملحي في كوب وملء كوب بالماء الثاني تعقيمها. </li></ol> 3. الشلل العنكبوت في الملقط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على CO 2 خزان ونقل العنكبوت من البلاستيك جمع قارورة مغلقة (انظر قائمة المواد) إلى CO 2 غرفة باستخدام ملقط معدنية طويلة. ملاحظة: العناكب الأرملة السوداء لها السم الخطر. دائما ارتداء القفازات أثناء هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ العنكبوت في الغرفة لمدة 5-10 دقائق أو حتى تخدير والتي لم تعد تتحرك عندما حث بلطف مع ملقط طويلة. استخدام ماصة نقل الرطب موضوع على ملقط مع محلول ملحي. ملاحظة: للحصول على إرشادات حول CO 2 المعلمات التخدير للأرامل السوداء، والرجوع إلى سبنا ومور 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد العنكبوت تخدير من CO 2غرفة عن طريق التقاط ما يصل به الأرجل الأمامية لها باستخدام ملقط تشريح حادة وقفاز. الانتقال العنكبوت تخدير لوزن الريشة جهاز الملقط. شوكات منفصلة من ملقط الريشة المغلقة وتضع مقدمة الرأس العنكبوت في بين شوكات وتسمح شوكات لإغلاق اغلاق لضمان العنكبوت يقام بإحكام في مكان ولكن لا يتم سحقهم. ضمان أن يتم وضع العنكبوت الجانب درع ظهر أسفل (انظر Foelix 20 لدليل لتشريح العنكبوت)، ويستريح على موضوع المغلفة الشق، والجانب البطني درع ليواجه طلاء البلاستيك، في حين لا تزال القطب الموجب تعلق على الشق السفلي. العمل بسرعة عند التعامل مع العنكبوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تشريح التكبير المجهر، والتركيز، ومصدر للضوء حتى chelicerae العنكبوت والأنياب هي واضحة للعيان. </li></ol> 4. جمع السم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على فراغ والرش العنكبوت chelicerae بمحلول الماء باستخدام حقنة حادة الرؤوس الثاني نeedle. شفط المياه بعيدا مع فراغ إبرة لإزالة الشوائب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمس إبرة فراغ المرفقة مع القطب السالب إلى العنكبوت المنبر وتقديم النبض مع دواسة قدم واحدة أو أكثر من مرة. فراغ بعيدا اجتر إذا لزم الأمر. ملاحظة: العنكبوت المنبر هي داخل الفم الخلفي لchelicerae على السطح الظهري بين chelicerae وendites (انظر Foelix 20 لتشريح مفصل العنكبوت). ملاحظة: مع كل نبضة، وعقد الساقين العنكبوت، والسم تكون مرئية مثل قطرات اضحة الخارجة من الأنياب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قطرات السم مع تلميح microcapillary الشعرية ونقل معلومات سرية إلى أنبوب 0.5 مل بمحلول الماء أو عازلة (سيتم امتص الحل في الشعرية). ملاحظة: تجنب ثقب العنكبوت مع الشعرية التي قد تؤدي إلى تلوث الدملمف والموت. تجنب أيضا تلوث الشعرية مع الحرير والغراء من المغازل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إرفاق المحاقن مع محول أنبوب لmicrocapillary (في الطرف المقابل لجمع معلومات سرية) و دالحل السم ispense مرة أخرى إلى الأنبوب. وضع أنبوب على الجليد. ملاحظة: يجب التخلص من الشعيرات الدموية النفايات في حاوية الأدوات الحادة القريبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان مفتوح جمع قارورة بلاستيكية، جنبا إلى جنب مع غطاء لها، على مقربة من العنكبوت. فهم دقيق لأرجل العنكبوت مع ملقط تشريح حادة عقدت في يد واحدة والريشة المفتوحة بعناية مع ملقط شوكات ناحية أخرى، انزلاق العنكبوت في جمع قارورة مع ملقط كليلة وغطاء وثيق بسرعة. تواصل مع العنكبوت وتخزين المقبل الأنابيب التي تحتوي على السم في الفريزر -80 درجة مئوية عند الانتهاء. ملاحظة: الاستمرار في توخي الحذر عند نقل العنكبوت من ملقط العودة إلى القارورة. تأكد من القارورة جمع والحد الأقصى هو قريب إلى العنكبوت للنقل السريع وارتداء القفازات. </li></ol> 5. السم الغدة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يومين إلى ثلاثة أيام جمع السم، تخدير العنكبوت في CO 2 غرفة (انظر الخطوة 3.1). ملء الناقل النيتروجين السائل ومكان المقبل لتشريح المجهر. ملاحظة: WHأون العمل مع النيتروجين السائل، وحماية العين واستعمال قفازات المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منطقة تشريح نظيفة وملقط تشريح مع الحل الذي يقضي على ريبونوكلياز الحمض النووي والتلوث. ملء طبق بتري صغيرة وضعت تحت مجهر تشريح مع تشريح عازلة (على سبيل المثال، 1X سيترات الصوديوم المالحة (SSC) عازلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العنكبوت من CO 2 غرفة إلى طبق بتري واستخدام ملقط لفصل بسرعة مقدمة الرأس من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد مقدمة الرأس تحت مجهر تشريح مع ملقط ووضع chelicerae في مجال الرؤية. استخدام نهايات حادة من الزوج الثاني من ملقط لخفض بشرة الانضمام للدرع إلى الجوانب الجانبية للchelicerae. أفقيا فهم chelicerae باستخدام الزوج الثاني من الملقط، والساحبة بلطف ذهابا وإيابا حتى يتم سحب غدد السم خارجا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غدد منفصلة عن chelicerae (أو ترك تعلق على chelicerae إذا رغبت في ذلك) ونقل إلى cyrosafe أنبوب 0.5 مل. مكان كلوسإد أنبوب في النيتروجين السائل. ملاحظة: كل تشريح ينبغي أن لا يزيد عن 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار تشريح مع العناكب إضافية حتى الانتهاء. أنابيب نقل من النيتروجين السائل في الفريزر -80 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Fry, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxicogenomic+multiverse:+convergent+recruitment+of+proteins+into+animal+venoms.">The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms.</a> Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).</li><li>Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venomics:+unravelling+the+complexity+of+animal+venoms+with+mass+spectrometry.">Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).</li><li>Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+and+cardioprotective+conopeptides:+An+emerging+class+of+drug+leads.">Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads.</a> Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).</li><li>Casewell, N. R., W&#252;ster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+cocktails:+the+evolutionary+novelty+of+venoms.">Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms.</a> Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).</li><li>Vetter, R. S., Isbister, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+aspects+of+spider+bites.">Medical aspects of spider bites.</a> Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).</li><li>Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxityping+rat+brain+calcium+channels+with+omega-toxins+from+spider+and+cone+snail+venoms.">Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms.</a> Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).</li><li>Silva, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latrophilin+1+and+its+endogenous+ligand+Lasso/Teneurin-2+form+a+high-affinity+transsynaptic+receptor+pair+with+signaling+capabilities.">Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities.</a> PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).</li><li>Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+an+update+and+review.">Ziconotide: an update and review.</a> Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).</li><li>Veiseh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+paint:+a+chlorotoxin:Cy5.5+bioconjugate+for+intraoperative+visualization+of+cancer+foci.">Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci.</a> Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).</li><li>Binford, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution,+functional+variation,+and+proposed+nomenclature+of+the+gene+family+that+includes+sphingomyelinase+D+in+sicariid+spider+venoms.">Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms.</a> Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).</li><li>Garb, J. E., Hayashi, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+evolution+of+&#945;-latrotoxin,+the+exceptionally+potent+vertebrate+neurotoxin+in+black+widow+spider+venom.">Molecular evolution of &#945;-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom.</a> Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).</li><li>Platnick, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , (2013).</li><li>Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Were+arachnids+the+first+to+use+combinatorial+peptide+libraries.">Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries.</a> Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).</li><li>King, G. F., Hardy, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider-venom+peptides:+Structure,+pharmacology,+and+potential+for+control+of+insect+pests.">Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests.</a> Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).</li><li>Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venom+landscapes:+Mining+the+complexity+of+spider+venoms+via+a+combined+cDNA+and+mass+spectrometric+approach.">Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach.</a> Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).</li><li>Kristensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comments+on+the+natural+expression+and+artificial+extraction+of+venom+gland+components+from+spiders.">Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders.</a> Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).</li><li>Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+actions+of+black+widow+spider+toxins+and+their+selective+use+in+neurosecretion+studies.">The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies.</a> Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).</li><li>Graudins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+activity+of+a+novel+&#945;-latrotoxin+from+red-back+spider+venom.">Cloning and activity of a novel &#945;-latrotoxin from red-back spider venom.</a> Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).</li><li>Spagna, J. C., Moore, A. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+immobilization+by+CO2+of+Latrodectus+hesperus+(Arachnida:+Theridiidae).">Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae).</a> Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).</li><li>Foelix, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Spiders. , (2010).</li><li>Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+expansion+of+the+black+widow+toxin+arsenal+uncovered+by+multi-tissue+transcriptomics+and+venom+proteomics.">Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics.</a> BMC Genomics. 15, 366 (2014).</li><li>Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloning+of+a+cDNA+encoding+a+protein+(latrodectin)+which+co-purifies+with+the+&#945;-latrotoxin+from+the+black+widow+spider+Latrodectus+tredecimguttatus+(Theridiidae).">The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the &#945;-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae).</a> Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).</li><li>Grasso, A., Pescatori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+latrodectin+from+the+venom+of+black+widow+spider+(Latrodectus+tredecimguttatus).">Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).</li><li>Szeto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+funnel-web+spider+polypeptide+with+homology+to+mamba+intestinal+toxin+1+and+the+embryonic+head+inducer+Dickkopf-1.">Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1.</a> Toxicon. 38, 429-442 (2000).</li><li>Binford, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+geographic+and+intersexual+chemical+variation+in+venoms+of+the+spider+Tegenaria+agrestis+(Agelenidae).">An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae).</a> Toxicon. 39, 955-968 (2001).</li><li>Alape-Gir&#243;n, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venomics+of+the+lancehead+pitviper+Bothrops+asper:+geographic,+individual,+and+ontogenetic+variations.">Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations.</a> J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).</li></ol>

الكاتب ليس لديه ما تكشف ولا المصالح المالية المتنافسة.

السموم تمثل مصدرا هاما للبروتينات رد الفعل من الناحية الفسيولوجية، والببتيدات والجزيئات الأخرى مع تطبيقات لاكتشاف المخدرات، فضلا عن الجوانب الأساسية للخليوي والبحوث البيئية 1-3. ومع ذلك، فإن مجموعة من السم، وخاصة من الحيوانات الخطرة أو صغيرة، هو مهمة صعبة. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن جمع السم والغدد السم من العناكب الأرملة السوداء، ويؤكد نجاح هذا النهج عن طريق الجمع بين التحليل MuDPIT من السم وقاعدة بيانات البروتين المشتق من cDNAs المستنسخة من السم الغدد 21. في حين أن هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد للأرامل السوداء والعناكب متوسطة الحجم، وقد استخدمت تقنيات أخرى لجمع السم mygalomorph أكبر العناكب (مثل الرتيلاء)، مثل التطلع المباشر من السم من الأنياب في الزجاج الماصات على سبيل المثال، 24. وهذا النهج الأخير، ومع ذلك ، لن تعمل بشكل جيد لالعناكب الصغيرة الحجم التي لا aggressiهاء. أحد الجوانب البالغة الأهمية وخاصة البروتوكول جمع السم الموصوفة هنا هي المراحل الأولية للإعداد وتعظيم الاستفادة من عملية جمع بحيث يصبح أكثر روتينية، بما يتفق وأسرع. بروتوكول يمثل تحديا في البداية لسيده، ولكن مع التجارب المتكررة، فإنه يصبح أسهل وأسرع. وحثت الحذر أيضا في كل المراحل الحرجة التي تنطوي على التعامل مع العناكب الخطرة، واستخدام التيار الكهربائي، والزجاج غرامة نقطة الشعيرات الدموية الدقيقة، وإبر حقنة. من المهم أن ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة مثل القفازات النتريل، معطف المختبر، والسراويل الطويلة والأحذية المغلقة، وكذلك النظارات عند تشكيل الشعيرات الدموية الدقيقة. جانب آخر تحديا لجمع السم هو كمية صغيرة من السم التي تنتجها أي العنكبوت واحد، وخاصة الأنواع الزوع، والتي من المبالغ التي تم جمعها قد تكون لىmited إلى 1-2 ميكرولتر لكل فرد في أحسن الأحوال. الحصول على ما يكفي من السم لتطبيقات المصب، مثل البروتين والمواد الهلامية أو المقايسات الفنية قد تتطلب مزيج من السم من أفراد متعددين في أنبوب واحد. في مثل هذه الحالات، يجب فقط أن الجمع بين السم من الأفراد من نفس الجنس، مرحلة التخلق، وإعطاء السكان الاعتراف تقلب خنوثي، التنموي والجغرافي في بعض السموم 25 و 26. قد العناكب أيضا يحمل تباين كبير في كمية السم أنتجت بين الأفراد، حيث قد يعكس كميات أقل استنزاف مؤخرا للغدة. وبالتالي قد يكون من المستحسن لجمع السم بعد عدة أيام التغذية الآخيرة. إذا تم الإفراج السم قليلا، لا ينبغي أن يطبق التيار المفرط للعنكبوت، مما قد يتسبب في تمزق بشرة، مما يؤدي إلى تلوث السم مع الدملمف أو الموت. تلوث عينات من سم العنكبوت مع سيوينبغي أيضا تجنب LK الإنسان أو مصادر من خلال استخدام معدات معقمة أو نظيفة. على الرغم من هذه التحديات، وجمع من السم النقي، وترك العنكبوت على قيد الحياة، هو أفضل من الأساليب التي تحصل السم من الخليط الغدة (التي لا فصل مكونات السم من البروتينات الخلوية الأخرى) وقتل العنكبوت. ومن الأهمية بمكان أيضا لضمان أن يتم تجميد العينات بسرعة لمنع تدهور البروتين. استخراج السم يعزز إنتاج السم لاحقا، وبالتالي تحفيز السم التعبير الجيني في غدة السم. في وقت لاحق وهكذا، لأن هذا البروتوكول يسمح للالعناكب من أجل البقاء استنزاف السم، يمكن تشريح الغدد على عدة أيام (قتل العنكبوت) عند نقطة حيث من المتوقع أن تكون كافية للدراسات الجينية، مثل نسخة الاستنساخ 10،11 سم التعبير الجيني. يجب أيضا أن تؤخذ عدة احتياطات مهمة في تشريح غدة السم. وينبغي التركيز على استخدام المختبر equipmوالأنف والحنجرة والكواشف بحيث تكون خالية من RNases التي تحط من الحمض النووي الريبي. وبالتالي فمن المستحسن أن يمسح ملقط وغيرها من المعدات غير القابل للتصرف والسطوح مع الحلول التي تقضي على ريبونوكلياز الحمض النووي والتلوث. ينبغي إجراء التشريح في أسرع وقت ممكن والمجمدة مباشرة لزيادة ضمان سلامة الحمض النووي الريبي من الأنسجة. أخيرا، يجب فقط أن يؤديها على تشريح العناكب تخدير، بعد أن يتم فصل مقدمة الرأس والبطن بسرعة. في الختام، تنص هذه المادة على بروتوكول التحقق من الحصول على العنكبوت السم السم والغدد. السم السم والغدد تسمح لعزل وتوصيف مكونات البروتين والببتيد وذلك باستخدام نهج البروتين وtranscriptomic. بالإضافة إلى ذلك، قد عينات السم تمثل نقطة الانطلاق من المقايسات الفنية، التي تحدد إمكانية الحيوية الطبية والدوائية من الجزيئات المكونة لها. ما يقرب من جميع العناكب تنتج السم، والغواص واسعةSITY مكونات السم توليفها من الأنواع الفردية يوحي وبعد أن اكتشف التنوع الهائل للجزيئات السم 13. وفقا لذلك، وهذا البروتوكول يوفر أدوات للتحقيق في مصدر غني من الجزيئات النشطة بيولوجيا الموجودة في سموم العنكبوت.

السموم هي إفرازات الحيوانات المحقونة في الغالب إلى حيوان آخر لأغراض الدفاع أو الافتراس، ولها أيضا تطبيقات البيولوجية الهامة ذات الأهمية الطبية الحيوية 1-3. فقط بعض الحيوانات تركب السم، ولكن إنتاجها على نطاق واسع في جميع أنحاء تصنيفيا اللافقاريات (مثل الكائنات المجوفة والقواقع المخروطية والعقارب، والعناكب) والفقاريات (مثل الثعابين، وبعض الأسماك والثدييات)، لأنها تطورت بشكل مستقل عدة مرات 1،4 . توصيف الكيمياء الحيوية من السموم عادة ما تظهر أنها تتألف من مجموعة واسعة من البروتينات والببتيدات، والتي تعمل بشكل كبير على الدورة الدموية والجهاز العصبي للحيوانات المحقونة لتسليم بسرعة السموم المكونة 1. وهناك نسبة ضئيلة من الحيوانات السامة قد تشكل خطرا على البشر، وخاصة الأنواع ذات التوزيعات synanthropic 5. وقد لعبت دراسة تكوين السم والأنشطة الوظيفية دورا هاما فيتوصيف وظيفي لمكونات الخلية الفقارية (خاصة القنوات الأيونية العصبية) 6 و في توضيح العمليات الخلوية الأساسية (مثل إفراز عصبي) 7. وعلاوة على ذلك، حدد الببتيدات السم لها خصائص مفيدة في سياقات الطبية الحيوية، بما في ذلك استخداماتها انها علاج لمرض السرطان وآلام 8،9، والملغومة ليؤدي المخدرات مرشح والتنمية للسم. السموم أيضا أن تلعب أدوارا بارزة في مجال البحوث البيئية والتطورية 1،4،10،11، وبالتالي جمع هذه الإفرازات الخطرة والعديد من المرافق العامة. هناك&gt; 40،000 الأنواع وصف العنكبوت (أمر الرتيلاوات)، ولكن كل واحدة من الأسر العنكبوت أكثر من 100 يقترن تمتلك غدد السم التي تنتهي في 12 الأنياب. تنوع الأنواع عالية من العناكب يوحي بأنها تمثل أكبر كليد من الكائنات السامة. ومع ذلك، وتوصيف الكيمياء الحيوية للسموم العنكبوت لديه لتتركز argely على عدد قليل من الأنواع في أغلب الأحيان المرتبطة التأثر بزعاف الحشرات البشري. دراسات البروتين وtranscriptomic الأخيرة من سموم العنكبوت تشير إلى أنها تحتوي عادة على العديد من البروتينات والببتيدات 2،13،14 فريدة من نوعها. التقدم في الإنتاجية العالية التسلسل [كدنا] وقياس الطيف الكتلي الببتيد البصمات قد سهلت كثيرا من اكتشاف هذه البروتينات 15 سم. ومع ذلك، يبدأ هذا العمل في جمع ما يكفي من السم و / أو غدد السم من العناكب، وثائق مفصلة عن هذه التقنيات هي قليلة (16). تعرض هذه الورقة على بروتوكول لجمع السم والغدد السم من العناكب الأرملة السوداء، التي يمكن تطبيقها على العناكب ذات الحجم المماثل. جمع السم بشكل منفصل من الغدد يمكن تحديد البروتينات التي تفرز في السم بدلا من البروتينات أداء الوظائف الخلوية الأخرى. الأرامل السود وغيرهم Lيتم التعرف على الأنواع atrodectus على نطاق واسع على أنها من بين أخطر العناكب بسبب السم أعصاب عالية، والذي يسبب آلاما شديدة في البشر، والذي يترافق أحيانا التعرق الغزير، تقلصات العضلات، ارتفاع ضغط الدم، وصعوبة في التنفس وشلل غير مكتمل 5. بروتوكول جمع السم المقدمة هنا يستخدم التحفيز الكهربائي لتوصيل التيار الكهربائي إلى العناكب تخدير للحصول تقلصات العضلات والافراج عن السم. وتجمع قطرات السم بسرعة مع الشعيرات الدموية الصغيرة والاستغناء في أنابيب لتخزين الفريزر. لأن البروتوكول يتضمن إجراءات الخطرة، يجب فقط أن يتم تنفيذ ذلك من قبل الأفراد المدربين تدريبا جيدا وحثت الحذر في الخطوات الرئيسية. السم جمعت له العديد من الاستخدامات، مثل توصيف وعزل الجزيئات المكونة 2، لإجراء التجارب الفسيولوجية أو المقايسات الفنية 18، وإلى تحفيز التعبير الجيني 11 سم. ويخلص بروتوكول مع description من تشريح غدة السم والحفاظ مفيد لاستنساخ الجينات السم محددة، والتعبير عن التي ثبت حدوثها 2-3 أيام بعد نضوب سم العناكب في مختلف 10،11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Grass Technologies</td>
			<td style="width:107px;">SD9</td>
			<td style="width:435px;">http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Voltmeter</td>
			<td style="width:153px;">RadioShack</td>
			<td>22-223</td>
			<td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pointed Featherweight Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td>4748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasti Dip</td>
			<td style="width:153px;">Performix</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">21 G X 1 1/2in Precision Glide hypodermic syringe needle</td>
			<td style="width:153px;">BD Medical&#160;</td>
			<td>305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vacuum filter flask 1L</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td>DS4101-1000</td>
			<td>smaller flask sizes may also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td>
			<td style="width:153px;">Nalgene</td>
			<td style="width:107px;">4280-0900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 microlitter Capillary Bores (Micro capillaries)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53508-375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting putty strip&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Loctite</td>
			<td></td>
			<td>Available at Ace Hardware</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand* General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td>
			<td style="width:153px;">Fisher</td>
			<td>10-316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC Buffer, 20X (pH 7.0), Molecular Grade</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf safe-lock tubes 0.5 mL tubes (cryogenic safe)</td>
			<td style="width:153px;">Eppendorf</td>
			<td>22363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalgene Dewar, 1L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Scientific</td>
			<td>4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase Away</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td>53225-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78310-0</td>
			<td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Foot switch/pedal</td>
			<td style="width:153px;">Linemaster Switch Corp.</td>
			<td style="width:107px;">491-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">21570-007</td>
			<td>similar models could be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Clamp Holder</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">89084-746</td>
			<td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td>
			<td style="width:153px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">300042-270</td>
			<td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td>
			<td style="width:153px;">Bioquip</td>
			<td style="width:107px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Cotton sewing thread</td>
			<td style="width:153px;">Threadart.com</td>
			<td style="width:107px;">&#160;THRCOT9</td>
			<td>similar product could be substituted</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

السموم هي كيميائيا إفرازات معقدة تتألف عادة العديد من البروتينات والببتيدات مع الأنشطة الفسيولوجية المختلفة. التوصيف الوظيفي للبروتينات السم له التطبيقات الطبية الحيوية الهامة، بما في ذلك تحديد من الخيوط المخدرات أو تحقيقات لمستقبلات الخلوية. العناكب هي معظم الأنواع كليد غنية من الكائنات الحية السامة، ولكن من السموم فقط عدد قليل من الأنواع وفهمها جيدا، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة المرتبطة بجمع كميات ضئيلة من السم من الحيوانات الصغيرة. تعرض هذه الورقة على بروتوكول لجمع السم من العناكب استخدام التحفيز الكهربائي، مما يدل على الإجراء على الأرملة السوداء الغربية (كوكب الزهرة الزوع). السم جمعت مفيد للتحليلات المصب متنوعة بما في ذلك التعرف المباشر البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي، المقايسات الفنية، وتحفيز التعبير الجيني السم للدراسات transcriptomic. هذا الأسلوب له ميزة على البروتوكولات التي ISOأواخر السم من الخليط الغدة بأكملها، والتي لا تفصل مكونات السم حقيقية من البروتينات الخلوية التي لا تفرز كجزء من السم. وتظهر نتائج ممثلة الكشف عن الببتيدات السم المعروف من العينة التي تم جمعها باستخدام مطياف الكتلة. ويعقب عملية جمع السم بأي بروتوكول لتشريح الغدد سم العنكبوت، وكانت النتائج تدل على أن هذا يؤدي إلى توصيف البروتينات والببتيدات وأعرب السم على مستوى التسلسل.

وكثيرا ما يتم تنفيذ مجموعة من السم والغدد السم تشريح لتحديد خصائص البروتينات والببتيدات السم على مستوى تسلسل 10،11،15. ويمكن أيضا أن تستخدم السم جمعها في المقايسات الفسيولوجية لتحديد الأنشطة الوظيفية 18. وجمع السم السم يحفز الغدة التعبير الجيني، مما يسهل استنساخ النصوص سموم معينة عن طريق RT-PCR 10،11. ويمكن أيضا تحديد بروتينات السم أن يتحقق بطريقة عالية الإنتاجية من خلال دمج تقنيات مطياف الكتلة القياسية مع قواعد البيانات تسلسل المتولدة من مكتبات غدة السم [كدنا 15،21. مثال على مثل هذا العمل، بدءا من السم والغدد التي تم جمعها باستخدام بروتوكول المفصلة أعلاه، مما يدل على فعاليته، ويتضح في الشكل رقم 1. السم التي تم جمعها من L. تم هضمها الإناث البالغات كوكب الزهرة مع التربسين واخضاعه لعملية في حلتحليل MuDPIT الذي يربط HPLC (عالية الأداء اللوني السائل) إلى جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS). هنا تم إجراء تحليل MuDPIT من جامعة أريزونا البروتيوميات الكونسورتيوم. وتمت مقارنة جماهير الببتيدات والكشف عن شظاياها فصل (أيونات ابنة، المستنتجة من أطياف) لمتواليات الببتيد تنبأ نظريا من الترجمات من متواليات [كدنا] تم الحصول عليها من مكتبة التعبير الجيني شيدت من L. غدد السم كوكب الزهرة (تم الحصول على الغدد بواسطة بروتوكول تشريح المذكورة أعلاه) 21. في هذه التجربة، تم الكشف عن 36 البروتينات من جميع الأطياف التي تم جمعها، على عتبة الاحتمال 99.9٪، ويتضمن واحدة على الأقل الكشف عن الببتيد. واحد من الكشف عن بروتينات تدعمه 43 مجموع الأطياف (أطياف قدوة هو مبين في الشكل 1A)، أي ما يعادل ثلاثة الببتيدات الحصرية، والتي تغطي 35٪ من تسلسل البروتين (الشكل 1B). الكشف عن البروتين (مترجمة من collecte<html> د [كدنا]) لديه كبير ضرب BLASTp لlatrodectin من L. tredecimguttatus (بنك الجينات الانضمام P49125.1)، مع درجة الإلكتروني لل2E-46، و 80٪ أسهم الهوية على مستوى تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين في الكشف عن هذه التجربة. Latrodectin، والذي يعرف أيضا باسم ألفا latrotoxin منخفض البروتين الوزن الجزيئي، هو عنصر السم المعترف بها الأرملة السوداء العناكب 22، 23، والتحقق من فعالية البروتوكول المقدمة. بعض البروتينات التي تم تحديدها من السم تتوافق مع تسلسل التي يتم العثور على أي ضرب الانفجار. ومن غير الواضح ما إذا كانت هذه النتيجة هي بسبب الموارد المحدودة المتاحة لالجينومية العناكب وكذلك معلومات وظيفية محدودة للبروتينات، أو لأن البروتين معروف يمثل الملوث السم. ومع ذلك، الجين أو البروتين التعبير يحلل دراسة وفرة هذا البروتين الرواية في الغدد السم نسبة إلى الأنسجة الأخرى يجب أن تكشف ما إذا كان عنصر السم حقيقي. والأنف والحنجرة &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1: الببتيد Latrodectin تحديدها من السم الأسود أرملة باستخدام مطياف الكتلة (A) أطياف ممثل (واحد من 43) الكشف عن طريق MS / MS جزء من التحليل MuDPIT من L.. كوكب الزهرة السم الذي تم تعيينه لتوقع الترجمة من سلسلة [كدنا جمعها هو مبين في الجزء باء أطياف الكتلة يظهر لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) من أيونات ابنة الكشف على المحور الأفقي التي تنتجها تفتيت الببتيد الأم (CGEEDFGEEIVK)، مع رسائل في أعلى تم تعيين تشير إلى تسلسل الببتيد على أساس ابنة الجماهير أيون. (ب) تسلسل البروتين الذي الأطياف في جزء A، تظهر باللون الأحمر، جريئة وشدد النص على تسلسل المقابلة من الأطياف هو مبين في الجزء ألف، نص أحمر إضافية (غير جريئة) يمثل الببتيد آخر في الكشف عن هذا البروتين مع الآخرين س التي تم جمعهاectra. ويترجم تسلسل البروتين من سلسلة [كدنا] تم الحصول عليها من غدد السم تشريح.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses at JoVE.com

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

وتنص هذه المادة على بروتوكول لاستخراج السم من العناكب استخدام التحفيز الكهربائي ل1) إجراء توصيف بروتيوميك، 2) تنشيط غدة السم التعبير الجيني، و3) إجراء دراسات وظيفية من السموم. ويلي ذلك وصف لmicrodissections غدة السم للدراسات التعبير الجيني.

استخراج السم والسم الغدة Microdissections من العناكب عن البروتين وتحليلات Transcriptomic

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Research

JoVE Journal

Biology

33.2K Views.  University of Massachusetts Lowell.  وتنص هذه المادة على بروتوكول لاستخراج السم من العناكب استخدام التحفيز الكهربائي ل1) إجراء توصيف بروتيوميك، 2) تنشيط غدة السم التعبير الجيني، و3) إجراء دراسات وظيفية من السموم. ويلي ذلك وصف لmicrodissections غدة السم للدراسات التعبير الجيني. 

Video: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

التعريفي واستخراج السم من البروتين فيوزاريوم النيابة. الثقافات للدراسات البروتين

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

نزع الأحشاء من الشبكية والسائل الزجاجي ماوس للتحليلات البروتين

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

استخراج وتحليل الكورتيزول من الإنسان والقرد الشعر

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء<em&gt; بيميسيا تاباسي</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...