אנו מודים למדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC) והחברה הקנדית למלחמה בסרטן לתמיכה כספית. SCCS הודות NSERC ו VNL מודה בוגרת מלגת אונטריו (OGS) תוכנית מלגות לתארים מתקדמים. ARW מודה CRC עבור הקתדרה למחקר בקנדה.

חלק 1: ייצור המכשיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית מצעים נקיים בפתרון Piranha (03:01 קונצרט כלשהו חומצה גופרתית:. חמצן 30%). השאירו את מצעים בפתרון Piranha דקות 10 בהתרגשות תכופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה במים (DI) deionized וייבוש מצעים עם גז 2 N, המקום מצעים בתוך החדר אלומת אלקטרונים בתצהיר כרום (עובי של 250 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליבש את המצע מצופה כרום, לשטוף ב isopropanol ואז לאפות על פלטה חשמלית במשך 5 דקות ב 115 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש מצעים וראש עם hexamethyldisilazane (HMDS) על ידי ציפוי ספין (30 s, 3,000 סל&quot;ד). ספין מעיל שוב (באמצעות פרמטרים זהים) עם photoresist S1811 שיפלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאפות את המצע בצלחת חם (100 ° C, 2 דקות), ואז התבנית photoresist על ידי חשיפה לקרינה אולטרה סגולה (UV) על דרך של 5 photomask. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח UV-חשופה מצעים ב מפתח שיפלי 321 MF 3 דקות ולשטוף במים DI. פוסט לאפות על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרום Etch שנחשפו על ידי טבילה כרום etchant עבור 30 s. לשטוף במים DI, לטבול אז חשפנית AZ300T עבור 10 דקות להסיר את photoresist הנותרים. לשטוף במים DI ויבש עם גז 2 N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה 2-5 Parylene-C (פולימר בידוד) על ידי אדים כימיים מיקרומטר בתצהיר על נושא המצע בדוגמת כרום. הפקדה של 50 ננומטר טפלון AF (על מנת להפוך את פני השטח הידרופובי) על ידי פתרון ספין ציפוי (1% wt / wt ב Fluorinert FC-40) ב 2000 סל&quot;ד במשך 60 s. פוסט לאפות בצלחת חם (160 ° C, 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את הצלחת העליונה, מעיל בלתי בדוגמת תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) זכוכית מצעים 50 ננומטר טפלון AF, כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לאפות גם מצעים בצלחת חם (160 ° C, 10 דקות). </li></ol> חלק 2: Device Set-up and Automation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת מכשירים microfluidic דיגיטלי פעלו בתצורת &quot;שתי צלחת&quot;, טיפות 1 ממוקמים בין המצע לתחתית (עם אלקטרודות בדוגמת) ואת המצע העליונה (עם אלקטרודה, רציף שקוף, נוצר בדרך כלל מ איטו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את המכשיר למעלה, להסיר ציפוי פולימר מן רפידות קשר של מצע התחתונה על ידי גירוד עדין עם אזמל. זוג רפידות החשוף של המצע לתחתית עם 40 פינים (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Power-במחשב שבו פועל LabVIEW (National Instruments, אוסטין, טקסס), בית בנוי קופסת הבקרה (שמציעות מערך של מתח גבוה ומשדר כי נשלטים על ידי אותות מכשירים הלאומי DaqPad), גנרטור פונקציה, מגבר . תיבת מחשב / שליטה מאפשר למשתמש שליטה על היישום של 100 V RMS / 18 kHz אותות אל המכשיר דרך 40 פינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את המכשיר על ידי הצבת שתי חתיכות של נייר דו צדדית (140 מיקרומטר עובי סה&quot;כ) בשולי המצע התחתונה להשלים עם מגלשות unpatterned איטו (ציור למעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתחל את מערכת הבקרה, להפעיל את התוכנית כיול LabVIEW (שנכתב in-house) כדי לכייל את בקרת משוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם ריאגנטים לתוך מאגרי מתאים (ראה סעיף 3, להלן) לצרף אותם תחת המצע העליונה (מצופה טפלון צד פונה כלפי מטה). חבר את מחבר הקרקע המצע העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הקוד actuation ב LabVIEW (שנכתב in-house) ולבצע את התוכנית ליזום actuation רביב. </li></ol> חלק 3: הכנת המדגם ו מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר עובדים (WB): 100 מ&quot;מ TrisHCl (pH 7.8) ו Pluronic 0.08% F127 w / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים חלבון (ים) להיות מנותח במדגם WB ו פיפטה לתוך מאגר 1 (R-1) על המכשיר, כפי שמוצג באיור 1b. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חומצה נמהר, Trichloroacetic 20% (TCA) במים DI, ו פיפטה לתוך R-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לשטוף חיץ, 70/30 כלורופורם / אצטוניטריל (ACN) ו פיפטה לתוך R-4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ resolubilizing, 100 mM אמוניום ביקרבונט (pH 8.0) ו 0.08% Pluronic F127 w / v ו פיפטה לתוך R-5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים reductant, טריס (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), ב 10 מ&quot;מ ב WB ו פיפטה לתוך R-6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים סוכן אלקילציה, iodoacetamide (IAM), ב 12 מ&quot;מ ב WB ו פיפטה לתוך R-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים טריפסין ב WB בריכוז שווה to1 / 5 ריכוז של המדגם הכולל חלבון (ראה 3.1, לעיל) פיפטה לתוך R-8. </li></ol> חלק 4: דוגמה עיבוד דיגיטלי Microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההליך הבא מיושם באופן אוטומטי באמצעות קוד LabVIEW בכתב בתוך הבית. היקף טיפות לוותר ממאגרים מוגדר על ידי הממדים של אלקטרודות (במקרה זה, טיפות חילק הם ~ 600nL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על טיפה של מדגם המכיל חלבון מן R-1 ו - טיפה של נמהר מ R-2 (איור 2, פריים 1). מיזוג שתי טיפות ולאפשר אגל בשילוב כדי לדגור במשך 5 דקות, וכתוצאה מכך כמות המשקעים של יחסי ציבורoteins על פני השטח (איור 2, מסגרות 2-3). להניע supernatant הרחק החלבון זירז למאגר הפסולת, R-3 (איור 2, מסגרת 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר three טיפות של חיץ לשטוף מ R-4 ו להסיע אותם על פני החלבון זירז למאגר הפסולת, R-3 (איור 2, מסגרת 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לזרז עד יבש, לוותר על טיפה של חיץ resolubilizing של R-5 לחלבון. אפשר למאגר כדי לדגור במשך 20 דקות עד המשקע נמס (איור 2, מסגרת 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על טיפה של reductant מ R-6 ולמזג אותה עם טיפה את המדגם. מערבבים את אגל בשילוב ידי actuating אותו על פני 6 אלקטרודות בתבנית מעגלית. אפשר אגל כדי לדגור על h 1 בטמפרטורת החדר בתא humidified (איור 3, מסגרות 1-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על טיפה של אלקילציה סוכן מ-R-7 ולמזג אותה עם טיפה המדגם, ואחריו ערבוב (כמו 4.5). אפשר אגל כדי לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתא humidified, מוגן מפני אור (איור 3, מסגרות 2-3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על טיפה של טריפסין מ R-8, ולמזג אותו עם טיפה המדגם, ואחריו ערבוב (כמו 4.5). אפשר אגל כדי לדגור במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified על פלטה חשמלית (איור 3, מסגרות 3-4). </li></ol> חלק 5: שלאחר עיבוד הכנת המדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר המצע העליון העיכול התגובה להרוות ידי הוספת 0.6 מ&quot;ל של חומצה trifluoroacetic 2.5% במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר המוצר התגובה הרווה באמצעות ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל במים מטוהרים מדגם DI לנפח סופי של 100 מ&quot;ל. </li></ol> חלק 6: המוניים ספקטרומטריית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת מדגם מעובד על ננו HPLC הזדווגו כדי ספקטרומטר מסה טנדם. מערכת HPLC משמש כאן הוא מתוך טכנולוגיות Eksigent והוא מצויד עם טור מלכודת (3 מ&quot;מ קוטר. חרוזים C18, 150 מיקרומטר מזהה x 2.5 ס&quot;מ) טור הפוך שלב ההפרדה (3 מיקרומטר קוטר. חרוזים C18, 75 מיקרומטר מזהה x 15 ס&quot;מ). ספקטרומטר מסה משמש כאן הוא LTQ מ-Thermo Fisher Scientific. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם 2 μL על הטור מלכודת בבית 5μL/min בשלב ניידים הכוללים אצטוניטריל 5% מים. הפרד את הדוגמה על העמודה שלב התהפכה על 0.5μL/min באמצעות שיפוע ליניארית מ אצטוניטריל 20% עד 80% אצטוניטריל מעל 25 דקות. המשך לפעול בשעה אצטוניטריל 80% עבור 10 דקות אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח להקות משחררי את הטור על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם. בעבודה דיווחו כאן, eluent היא שנדגמו לתוך ספקטרומטר מסה באמצעות פולט nanoelectrospray (20 מיקרומטר מזהה התחדד מזהה 10 מיקרומטר) מתוך NewObjective. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את החלבונים במדגם באמצעות חיפוש באתר התוכנית כגון SEQUEST. בעבודה זו, היינו את גירסת SEQUEST שולבו Bioworks v3.01 (Thermo-פישר סיינטיפיק), וחלבונים זיהו היו ציונים הסתברות של פחות מ 1.0e-03 (שווה ערך ל מרווח ביטחון 99.9%), ואת הכיסויים רצף ב לפחות 30% (איור 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> באיור 1. (א) תמונה מכשיר DMF הזדווגו עד 40 פינים עבור actuation אגל אוטומטיות. (ב) סכימטי של מכשיר המתאר את המיקום של המדגם ריאגנטים הנדרש הבדיקות proteomic. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> איור 2. מסגרות מסרט המתאר את מיצוי אוטומטיות טיהור BSA ב TCA 20% (נמהר) ו אצטוניטריל% 70/30 כלורופורם / (לשטוף פתרון). במסגרת 6, החלבון הוא זירז redissolved ב אגל של אמוניום ביקרבונט 100 מ&quot;מ. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> איור 3. מסגרות מסרט הממחישות הפחתה אלקילציה רציפים, ועיכול אגל של חלבון resolubilized. בנתון זה, ריאגנטים נצבעים בצבעי לבהירות; בפועל, ריאגנטים אינם צבעוניים. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> 4. איור MS chromatogram מדגם של אלבומין בסרום שור מעובד על ידי מיקרופלואידיקה דיגיטלית. 25 פפטידים שונים זוהו (99.9% מרווח ביטחון) המקביל כיסוי רצף של 44%.

<ol>
	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

חוסר טיפול מדגם עיבוד סטנדרטי ב proteomics היא מגבלה עיקרית עבור השדה. בנוסף, מדגם טיפול קונבנציונלי macroscale כרוך containers רבים והעברות פתרון, אשר יכול להוביל לאובדן מדגם וזיהום. פתרון אפשרי לבעיות אלו היא ליצור מערכות משולבות לעיבוד דיגיטלי מדגם להסתמך על מיקרופלואידיקה 1<...

digital microfluidics for automated proteomic processing

Proteomics קלינית התפתחה כדיסציפלינה חדשה חשוב, המבטיח גילוי סמנים כי יהיה שימושי עבור אבחון מוקדם הפרוגנוזה של המחלה. בעוד שיטות proteomic קליניים להשתנות במידה רבה, מאפיין משותף הוא הצורך (i) מיצוי של חלבונים מן נוזלים הטרוגנית מאוד (כלומר, בסרום, דם מלא, וכו &#39;) וכן (ii) עיבוד ביוכימיים מקיף לפני הניתוח. כאן, אנו דו&quot;ח חדש דיגיטלי מיקרופלואידיקה (DMF) שיטה המבוססת שילוב מדרגות עיבוד מספר proteomics בשימוש קליני. זה כולל מיצוי חלבון, resolubilization, הפחתה, אלקילציה עיכול אנזימטי. Digital מיקרופלואידיקה היא טכניקה microscale נוזל הטיפול בהם טיפות nanoliter-microliter בגודל הם מניפולציה על משטח פתוח. טיפות ממוקמים על גבי מערך של אלקטרודות כי הם מצופים בשכבת דיאלקטרי - כאשר הפוטנציאל החשמלי מוחל על אגל, חיובים מצטברים משני צדי דיאלקטרי. האישומים לשמש מטפל אלקטרוסטטי שניתן להשתמש בהם כדי לשלוט בעמדה רביב, ועל ידי הטיית רצף של אלקטרודות בסדרה, טיפות ניתן לוותר, להזיז, למזג, לערבב, ולפצל על פני השטח. לכן, DMF הוא בכושר טבעי לביצוע מהיר, רציף רב שלבי, מיניאטורי מבחני ביוכימיים אוטומטיות. זה מייצג התקדמות משמעותית לעומת שיטות קונבנציונליות (בהסתמך על pipetting רובוטים או ידנית), ויש לו פוטנציאל להיות כלי חדש שימושי proteomics קליניים. מאיס ג&#39;Jebrail, ויויאן נ &#39;לוק, וסטיב CC שי תרמו באופן שווה על עבודה זו. הכתובת הנוכחית סרג&#39;יו LS של פריירה הוא באוניברסיטת למדעי בפילדלפיה הממוקם 600 דרום רחוב 43, פילדלפיה, פנסילבניה 19104.

Watch this Scientific Journal Video about Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing at JoVE.com

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Digital מיקרופלואידיקה היא טכניקה מאופיין מניפולציה של טיפות בדידים (~ NL - מ&quot;ל) על מערך של אלקטרודות על ידי יישום של שדות חשמליים. הוא מתאים היטב בביצוע מהיר, רציף, מבחני מיניאטורי ביוכימיים אוטומטיות. כאן אנו מדווחים פלטפורמה מסוגל מיכון כמה מדרגות עיבוד proteomic.

מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  University of Toronto. Digital מיקרופלואידיקה היא טכניקה מאופיין מניפולציה של טיפות בדידים (~ NL - מ"ל) על מערך של אלקטרודות על ידי יישום של שדות חשמליים. הוא מתאים היטב בביצוע מהיר, רציף, מבחני מיניאטורי ביוכימיים אוטומטיות. כאן אנו מדווחים פלטפורמה מסוגל מיכון כמה מדרגות עיבוד proteomic.

Video: Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

תגובת Chemotactic של מיקרו אורגניזמים ימיים כדי Micro-Scale שכבות מזין

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

מחקרים Chemotaxis חיידקית שימוש מיקרופלואידיקה - ראיון

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

יישום מיקרופלואידיקה Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

הפיתוח של יישומים טיפולית חדשה באמצעות מיקרופלואידיקה

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblot ניתוח

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

רעלן אינדוקציה ואת מיצוי חלבון מן Fusarium Spp. תרבויות ללימודי proteomic

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...