나는이 프로토콜의 개발에 그들의 도움을 다음 분들께 감사 : 척 크리스텐슨, 그레타 Binford, 알렉스 K. 랭커스터, 콘라드 Zinsmaier 및 메이스 이마 드를. 질량 분석 및 단백질 체학 데이터는 AZCC에 SWEHSC, NIH / NCI 부여 CA023074에 NIEHS 부여 ES06694 지원 애리조나 단백질 체학 (Proteomics) 컨소시엄과 아리조나 대학의 BIO5 연구소에 의해 인수되었다. 이 작품에 대한 자금 제시카 E. 의복 보조금 1F32GM83661-01과 1R15GM097714-01에서 국립 보건원 (일반 의학의 국립 연구소)에서 제공되었다.

전기 자극 장치의 1. 준비 <ol><li> 콘센트와 외부 신호 입력에 외부 풋 페달을 연결하는 전기 자극기의 전원 코드를 연결합니다. 참고 : 전기 배선이 제대로 절연되어야하며, 노출 된 금속 제공하는 전류가 감동 할 수 없습니다. 보호를 위해 라텍스 또는 니트릴 장갑을 착용 할 것. 전원 코드를 부착하고 와이어를 부착 할 때 전기 자극기의 전원 스위치를 OFF 위치에 있어야합니다. </li><li> 전기 자극기에 붉은 출력 단자에 양극을 연결 (극성 스위치는 정상 모드 인 경우) 및 블랙 출력 단자에 음극을 연결한다. 참고 : 각 전극 와이어 악어 클립에 종료한다. </li><li> 다음 권장 초기 설정으로 설정 자극기 : 전압 = 7 V, 초당 주파수 = 1 펄스, 지연 = 0 밀리 초, 지속 시간 = 200 밀리 초, 트윈 펄스는 오프 = 일반 스위치와 모드 스위치. </li><li> voltme하기 위해 악어 클립을 부착하여 전극의 시험 출력터 긍정적이고 부정적인 테스트 리드. 자극기의 전원 스위치를 켜고 페달과 현재 제공합니다. </li></ol> 움직이지 집게 및 기타 자료 2. 준비 <ol><li> 액체 플라스틱 코팅에 페더급 집게의 한 갈래를 찍어 및 코팅 건조 수 있도록 네 시간 기다립니다. 단단히면 재봉사의 단일 층으로 반대 가닥의 끝의 15mm를 포장하고, 매듭의 끝을 매서 스레드를 고정합니다. 주 : 플라스틱 코팅 전류를 지연하도록 절연을 제공하는 반면 스레드는, 전기 전도성을 촉진인가 식염수를 흡수하기 위해 사용된다. </li><li> 날카로운 가위 무딘 피하 주사 바늘의 끝 부분을 잘라 모래 종이에 구멍을 부드럽게. 튜브를 통해 진공 폐기물 트랩 (예를 들면, 진공 필터 플라스크)에 바늘을 연결합니다. 주 : 바늘 물을 얻어 흡입 역류 및 자극 전극에 의해 생성 된 회로를 완성하는 역할을 할 것이다. 니들 개구부 뮤세인트 막힘없이 진공 솔루션에 아직 충분히 큰 거미를 끼치 지 충분히 작은 수 (예를 들어, 25 G 게이지 X 1 ½, 재료 목록 참조). </li><li> 위치 페더급 집게 수평 상단에 집게의 플라스틱 코팅 단자와보기의 해부 현미경의 현장에서 자기베이스 또는 고정 스탠드 장치에 고정 된 비닐 덮인 두 갈래의 클램프를 사용하여 밀폐 된 위치와 스레드 하단에있는 단자를 코팅. 참고 : 두 갈래 클램프 클램프 홀더에 의한 자기베이스에 고정 된 위치에 유지 (자료 목록 참조). 고무 밴드는 단단히 한 번 소개 된 거미 주변 폐쇄 위치에 페더급 집게를 유지하기 위해 추가 압력을 추가하려면 다음 클램프 홀더, 페더급 집게의 접지 단자 주위에 고정 될 수있다. </li><li> 스레드의 상류 집게 &#39;바닥 단자에 양극 악어 클립을 부착하고 금속 진공 바늘을 둔 부정적인 악어 클립을 연결합니다. </li&gt; <li> 스레드와 악어 클립과 무딘 진공 바늘에 부정적 영향을 배치 사이의 집게 가닥에 긍정적 인 리드를 배치하여 전압계와 전류 시험 회로. 보도 풋 페달은 충분한 전류가 감지 보장하고 충분한 전류가 감지되면 리드를 제거합니다. </li><li> 독 수집에 대한 몇 가지 마이크로 모세관 튜브를 준비합니다. 분젠 버너 불꽃을 통해 수평 집게 개최 끝을 배치, 장갑을 낀 손으로 한쪽 끝에서 멸균 금속 집게로 다른 쪽 끝에서 하나의 마이크로 모세관 튜브를 잡습니다. 고정 된 위치에서 다른 쪽 끝을 잡고, 멀리 연장 팁을 만들 수있는 불꽃에서 금속 집게와 마이크로 캐 필러에 당깁니다. 주 : 마이크로 캐 쉽게 파괴 수있는 보호 안경을 착용하십시오. </li><li> 페트리 접시에 장착 퍼티 스트립에 준비된 마이크로 캐 필러를 휴식. 마이크로 캐 필러는 해부 현미경 종료 검사 및 소독 금속 집게로 뽑아 끝 부분에 작은, 경 사진 구멍을 만드십시오. </li><li> 라멸균 0.5 ml의 튜브 벨 변수 수. 튜브를 멸균 멸균, 탈 이온수를 추가 (예를 들어, 멸균 탈 이온수 5 μL). 닫기 튜브와 얼음에 장소 튜브. </li><li> 비커에 식염수를 준비하고 멸균 물을 두 번째 비커를 입력합니다. </li></ol> 집게에 거미의 3 고정화 <ol><li> CO 2 탱크의 전원을 켜고 폐 플라스틱 수집 병에서 거미를 전송 긴 금속 집게를 사용하여 CO에 2 챔버 (자료 목록 참조). 참고 : 검은 과부 거미 위험한 독을 가지고, 항상이 프로​​토콜 중 장갑을 착용하십시오. </li><li> 5 ~ 10 분 동안이나 때까지 실에서 거미를 유지 마취 부드럽게 긴 집게로 prodded 때 더 이상 이동. 식염수와 집게에 실을 적시 전송 피펫을 사용합니다. 참고 : 검은 과부 CO 2 마취 매개 변수에 대한 지침은 스파 냐 무어 (19)을 참조하십시오. </li><li> CO 2에서 마취 된 거미 검색무딘 해부 집게와 장갑을 낀 손을 사용하여 전방 다리에 의해 그것을 따기에 의해 실. 집게 장치를 페더급하기 위해 마취 거미를 이동합니다. 폐쇄 페더급 집게의 별도의 접지 단자와 접지 단자 사이에 거미의 두흉부를 놓고 단자가 자리에 단단히 유지되고 있지만, 분쇄되지 않는 거미를 보장하기 종료 종료 할 수 있습니다. 양극이 바닥 단자에 연결된 상태를 유지하면서, 거미가 실 코팅 구에 쉬고, (거미 해부학에 대한 안내는 Foelix 20 참조) 아래 갑각의 등쪽면을 배치하고, 등딱지의 복부 측면은 플라스틱 코팅에 직면하고 있는지 확인합니다. 거미를 처리 할 때 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 거미의 chelicerae 때까지 현미경 배율, 초점, 광원을 해부 조정 송곳니 명확하게 볼 수 있습니다. </li></ol> 4. 독 컬렉션 <ol><li> 진공을 켜고 두 번째 끝이 무딘 주사기 N을 사용하여 수용액과 거미 chelicerae 스프레이eedle. 불순물을 제거하기 위해 진공 바늘로 물을 멀리 흡입. </li><li> 거미 연단에 부착 된 음극과 진공 바늘을 터치 풋 페달을 한 번 이상으로 펄스를 제공합니다. 필요한 경우 진공 떨어져 역류. 참고 : 거미 연단은 chelicerae과 endites (자세한 거미 해부학에 대한 Foelix 20 참조) 사이의 등의 표면에 chelicerae 입 후방 내부입니다. 참고 : 각 펄스, 거미의 다리를 계약하고, 독이 송곳니에서 신흥 투명 방울로 볼 수 있습니다. </li><li> 수집 독 (솔루션은 모세 혈관으로 흡수되어 버립니다) 물 또는 완충 용액을 0.5 ml의 튜브에 마이크로 모세관 팁과 전송 모세관 팁 방울. 주 : 체액 오염 및 사망으로 이어질 수 모세관과 거미를 천공하지 마십시오. 또한 방적 돌기에서 실크와 접착제 모세관의 오염을 방지. </li><li> 와 D (최종 수집 팁 반대에) 마이크로 캐 필러에 튜브 어댑터와 함께 전송 주사기를 부착다시 튜브에 ispense 독 솔루션입니다. 얼음에 튜브를 넣어. 참고 : 근처의 날카로운 물건 용기에 폐 모세 혈관 폐기하십시오. </li><li> 거미에 가까운 그것의 모자와 함께 열려 플라스틱 수집 병을 놓습니다. 무딘 해부 집게가 한 손에 개최 조심스럽게 열린 페더급 무딘 집게 신속하게 가까운 캡 유리 병을 수집에 거미를 슬라이딩, 다른 손으로 접지 단자를 집게로 조심스럽게 거미의 다리를 잡고. 완료되면 -80 ° C 냉동고에서 다음 거미 저장 독을 함유 튜브를 계속합니다. 참고 : 다시 유리 병에 집게에서 거미를 이동할 때주의를 기울여야하는 것을 계속한다. 반드시 수집 유리 병 및 캡의 빠른 전송을 위해 거미에 근처에 확인하고 장갑을 착용하십시오. </li></ol> 5. 독 글 랜드 해부 <ol><li> 2 ~ 삼일 독을 수집 한 후, CO 2 챔버 (단계 3.1 참조) 거미를 마취. 해부 현미경 옆에 액체 질소 캐리어와 장소를 입력합니다. 참고 : WHEN은 액체 질소를 사용 눈 보호 및 극저온 장갑을 작동합니다. </li><li> 청소 해부 영역과의 RNase과 DNA 오염을 제거 솔루션을 해부 포셉. 버퍼 (예를 들면, 1X 식염수 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼)를 해부하여 해부 현미경 아래에 배치 작은 페트리 접시를 채 웁니다. </li><li> CO 2 챔버에서 전송 거미 petri 접시 빠르게 복부에서 두흉부를 분리하는 집게를 사용합니다. </li><li> 집게로 해부 현미경으로 두흉부를 잡고보기의 필드에 chelicerae를 놓습니다. chelicerae의 측면 측면 등딱지에 합류 표피를 잘라 집게의 두 번째 쌍의 날카로운 끝을 사용합니다. 옆으로 집게의 두 번째 쌍을 사용하여 chelicerae를 잡고 독을 분비 빼낼 때까지 앞뒤로 가볍게 잡아. </li><li> chelicerae에서 별도의 분비 cyrosafe 0.5 ML 튜브 및 전송 (또는 남길 원하는 경우 chelicerae에 첨부). 장소 클액체 질소에 ED 관. 참고 : 각각의 해부는 더 이상 15 분 이상 소요됩니다. </li><li> 완료 될 때까지 추가 거미 해부를 반복합니다. -80 ° C의 냉동고에 액체 질소에서 전열관. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도없이 경쟁 금융 이익을 가지고 있지.

독은 생리 학적 반응 단백질, 펩타이드 및 신약 개발을위한 응용 프로그램과 다른 분자의 중요한 원천뿐만 아니라 셀룰러 및 생태 학적 연구 1-3의 근본적인 측면을 나타냅니다. 그러나, 특히 위험하거나 작은 동물 독의 수집은 어려운 작업이다. 이 프로토콜은 독과 독 분비가 검은 과부 거미에서 수집 할 수있는 방법을 보여줍니다, 그리고 독에서 복제 독의 MuDPIT 분석 및 cDNA를 유래의 단백질 데이터베이스의 조합을 통해이 방식의 성공 (21)을 땀샘을 확인합니다. 이 프로토콜은 검은 과부와 중간 크기 거미, 잘 작동하는 동안 다른 독 수집 기술은 그러나, 피펫 예를 들어, 24.이 후자의 방법 유리에 이빨에서 독을 직접 흡입으로 큰 mygalomorph (거미 같은) 거미를 위해 사용되어왔다 , aggressi되지 않는 작은 크기의 거미를 위해 잘 작동하지 않습니다했습니다. 좀 더 일상적인, 일관성 있고, 빨리이되도록 여기에 설명 된 독 수집 프로토콜 중 하나 특히 중요한 측면은 수집 과정의 준비 및 최적화의 초기 단계입니다. 이 프로토콜은 마스터에 처음 도전이지만, 반복 시험으로, 그것은 쉽고 빠르게된다. 주의 또한 유해 거미 취급, 전류, 미세 점 유리 마이크로 모세관, 및 주사기 바늘의 사용을 포함하는 모든 주요 단계에서 압박된다. 그것은 마이크로 모세 혈관을 형성 할 때 안경뿐만 아니라, 니트릴 장갑, 실험실 코트, 긴 바지 및 폐쇄 신발로 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다. 독 컬렉션 또 다른 도전 형태는 양 리 수집 될 수있는 어느 하나의 거미, 특히 Latrodectus 종에 의해 생산 독 소량기껏해야 각 당 1-2 마이크로 리터에 mited. 단백질 젤 또는 기능 분석과 같은 다운 스트림 애플리케이션에 충분한 독을 얻는 것은 하나의 튜브에 여러 사람들로부터 독의 조합을 필요로 할 수있다. 이러한 경우, 독은 동일한 성별, 개체 발생 단계의 개체로부터 결합되어야하고, 인구 일부 독액 25, 26, intersexual 발달 지리적 변동의 인식을 부여. 거미는 또한 적은 양의 글 랜드의 최근의 고갈을 반영 할 수있다 개인들 사이에서 생산 된 독의 양에 상당한 차이가 발생할 수 있습니다. 따라서 그들의 마지막 수유 후 독 며칠를 수집하는 것이 바람직 할 수있다. 작은 독가 해제되면, 과도한 전류는 체액 또는 사망과 독의 오염으로 이어지는, 표피가 파열 될 수있는 거미에 적용해서는 안된다. 거미의시와 독 샘플의 오염LK 또는 인간의 소스는 멸균 또는 청소 장비의 사용을 피해야한다. 이러한 문제에도 불구하고, 순수한 독의 수집, 살아있는 거미를 떠나, (다른 세포 단백질에서 독 성분을 분리하지 않음)과 거미를 죽이고 선 균질에서 독을 얻는 방법에 바람직하다. 이것은 샘플이 빠르게 단백질 분해를 방지하기 위해 냉동되도록하는 것도 매우 중요하다. 독 추출하여 독 분비선에서 독 유전자 발현을 자극 후속 독 생산을 촉진한다. 거미 독 고갈 살아 남기 위해이 프로토콜을 허용하기 때문에 따라서, 자신의 글 랜드 해부 할 수있는 몇 가지 일 후에 독 유전자 발현이 같은 성적은 10, 11를 복제 등의 유전 연구를위한 충분한 것으로 예상되는 시점에서 (거미를 죽이는). 몇 가지 중요한주의 사항은 독 글 랜드 해부에주의해야합니다. 중점 실험실 equipm의 사용에 배치해야ENT와 RNA를 분해 RNases의 무료 시약. 따라서이 된 RNase과 DNA 오염을 제거 솔루션과 집게 및 기타 비 일회용 장비와 표면을 닦아하는 것이 좋습니다. 해부는 또한 조직의 RNA의 무결성을 보장하기 위해 가능한 빨리 그리고 직접적 냉동로서 수행되어야한다. 그들의 두흉부 복부 빠르게 분리 한 후 마지막으로 해부 만, 마취 거미 수행하여야한다. 결론적으로,이 문서는 거미의 독과 독 분비를 얻을 수있는 검증 프로토콜을 제공합니다. 독과 독을 분비는 단백질 체학 및 transcriptomic 접근 방식을 사용하여 단백질과 펩타이드 성분의 분리 및 특성에 대한 수 있습니다. 또한, 독 샘플은 그 구성 분자의 생물 의학 및 약학 적 잠재력을 결정하는 기능 분석의 시작 포인트를 나타낼 수있다. 거의 모든 거미가 독을 생산하고 넓은 다이버개별 종에 의해 합성 된 독 성분의 SITY는 독 분자의 광대 한 다양성이 아직 13 발견 할 수 있습니다 제안합니다. 따라서,이 프로토콜은 거미 독에 존재하는 생물학적 활성 분자의 풍부한 원천을 조사하는 도구를 제공합니다.

독은 주로 포식 또는 방어의 목적으로 다른 동물에 주입 동물의 분비물이며, 또한 생물 의학 관련 1-3으로 중요한 생물학적 응용 프로그램을. 특정 동물의 독을 합성하지만 진화 독립적 때문에 생산은 무척추 동물 (예를 들면, 자포 동물, 콘 달팽이, 전갈, 거미)과 척추 동물 (예를 들면, 뱀, 일부 물고기와 포유 동물)에서 분류 학적으로 널리 퍼져 여러 번 1,4 . 독의 생화학 적 특성은 전형적으로 크게 급속 구성 독소 일을 제공하는 주입 동물의 순환계 신경계에 작용하는 단백질 및 펩티드의 매우 다양한 구성된다 보여준다. 악의에 찬 동물의 작은 부분은 인간, synanthropic 분포 5 특히 종을 위협 할 수 있습니다. 독의 구성과 기능 활동의 연구는 중요한 역할을했다척추 동물의 세포 성분 (특히 신경 세포의 이온 채널) 6과 기본적인 세포 프로세스 (예 : neurosecretion)를 7 해명의 기능 특성. 또한, 선택 독 펩타이드는 암과 통증 8,9에 대한 치료로서 그 용도를 포함하여 생물 의학 상황에서 유용한 특성을 가지고 있고, 후보 물질 리드와 해독제 개발을위한 채굴된다. 독은 따라서 이러한 위험 분비물의 컬렉션이 많은 유틸리티가 있습니다, 생태 및 진화 연구 1,4,10,11에서 눈에 띄는 역할을한다. 40,000 설명 거미 (주문 Araneae)의 종과 송곳니 (12)에 종료 독 분비를 쌍으로 가지고 있어요 100 개 이상의 거미 가족 중 하나를 제외하고 모두&gt;가 있습니다. 거미의 높은 종 다양성은 악의에 찬 생물의 가장 큰 분기 군을 대표하는 것이 좋습니다. 그러나, 거미 독의 생화학 적 특성은 L가argely 대부분 인간 envenomation와 연관된 종의 소수 농축시켰다. 거미 독의 최근 프로테오믹스 및 transcriptomic 연구들은 일반적으로 많은 독특한 단백질과 펩타이드 2,13,14를 포함 나타냅니다. 높은 처리량의 cDNA 서열 분석 및 질량 분석 펩티드 핑거 발전 하였을 독 단백질 (15)의 발견을 촉진했다. 그럼에도 불구하고, 이러한 작업은 기술에 대한 충분한 독 및 / 또는 거미의 독을 분비하고, 자세한 설명서의 컬렉션으로 시작 16 몇 가지 있습니다. 이 논문은 비슷한 크기의 거미에 적용 할 수있는 검은 과부 거미의 독과 독을 분비의 수집을위한 프로토콜을 제시한다. 별도로 땀샘에서 독의​​ 컬렉션은 다른 세포 기능을 수행하는 단백질과 반대로 독으로 분비되는 단백질의 식별을 가능하게한다. 검은 부와 다른 Latrodectus 종은 널리 때문에 가끔 넘치도록 땀, 근육의 수축, 고혈압, 호흡 곤란 및 누덕 누덕 기운 마비 5 동반 인간에 심한 통증이 발생 그들의 높은 신경 독성 독,에 가장 위험한 거미들로 인식된다. 여기에 제시된 독 수집 프로토콜은 근육의 수축과 독의 방출을 유도하는 마취 거미에 전류를 전달하기 위해 전기 자극을 사용합니다. 독 방울 신속 마이크로 모세 혈관과 수집 및 냉동 저장을위한 튜브에 분배된다. 프로토콜이 위험한 절차를 관련이 있기 때문에, 그것은 단지 잘 훈련 된 개인에 의해 수행되어야하며주의 주요 단계에 촉구한다. 수집 된 독은 특성화 및 생리 학적 실험 또는 기능 분석 (18)의 구성 분자 (2)의 분리 등의 다양한 용도를 갖고, 독 11 유전자 발현을 자극. 프로토콜 대하여 descr로 결론독 동맥 박리와 독 특정 유전자의 복제에 유용 보존 iption은, 표현하는 다른 거미 10, 11에 독을 고갈 다음 2~3일 발생하는 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&amp;nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td></tr><tr><td>Voltmeter</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td></tr><tr><td>Pointed Featherweight Forceps</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&amp;#189; in Precision Glide hypodermic syringe needle</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter flask 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>smaller flask sizes may also work</td></tr><tr><td>Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;#956;l Capillary Bores (Micro capillaries)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Mounting putty strip&amp;nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td></tr><tr><td>Foot switch/pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>similar models could be substituted</td></tr><tr><td>Clamp Holder</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td></tr><tr><td>Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td></tr><tr><td>Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Cotton sewing thread</td><td>Joann fabric and craft store</td><td>7245855</td><td>similar product could be substituted</td></tr></tbody></table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

독의 화학적 일반적으로 다양한 생리 활성을 가진 수많은 단백질과 펩타이드를 포함하는 복잡한 분비물이다. 독 단백질의 기능적 특성은 세포의 수용체에 대한 약물 리드 나 프로브의 식별을 포함하여 중요한 생물 의학 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 거미 독이 생물 종 중 가장 풍부한 분기 군이지만, 단지 몇 종의 독액 인해 작은 동물로부터 독 분 수량을 수집과 관련된 어려움에 부분적으로 잘 이해된다. 이 논문은 서양의 검은 과부 (Latrodectus의 개밥 바라기)의 절차를 시연, 전기 자극을 이용하여 거미의 독의 수집을위한 프로토콜을 제시한다. 수집 된 독은 질량 분석을 통해 직접 단백질 식별, 기능 분석 및 transcriptomic 연구 독 유전자 발현의 자극을 포함하여 다양한 다운 스트림 분석에 유용합니다. 이러한 기술은 이소 프로토콜을 통해 장점을 갖는다독의 일환으로 분비되지 않는 세포 단백질에서 정품 독의 구성 요소를 분리하지 않는 전체 글 랜드 균질에서 후반 독. 대표적인 결과는 질량 분석기를 사용하여 수집 된 샘플로부터 공지 독 펩티드의 검출을 보여준다. 독 수집 절차의 결과는이 시퀀스 레벨에서 독 발현 된 단백질 및 펩티드의 특성에 이르게한다는 증명으로, 거미 독 땀샘 해부 용 프로토콜에 따른다.

독과 독 선 해부의 컬렉션은 자주 시퀀스 레벨 10,11,15에 독 단백질과 펩티드의 특성을 수행한다. 수집 된 독은 또한 기능적 활동 (18)를 결정하기 위해 생체 분석에서 사용될 수있다. 독의 수집하여 RT-PCR (10, 11)를 통해 특정 독소 성적 증명서의 복제를 촉진, 독 그랜드 유전자 발현을 자극 할 것이다. 독 단백질의 식별도 독 마개의 cDNA 라이브러리로부터 생성 15,21 서열 데이터베이스와 표준 질량 분석 기술을 통합하여 높은 처리량의 방식으로 달성 될 수있다. 예컨대 직장, 독 및 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 수집 땀샘에서 시작 유효성을 입증 일례가도 1에 도시되어있다. 독 L.에서 수집 개밥 바라기 성인 여성이 용액을 트립신 소화시켰다탠덤 질량 분광법 (MS / MS)을 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피)를 연결 MuDPIT 분석. 여기 MuDPIT 분석 애리조나 프로테오믹스 컨소시엄 대학에 의해 수행 하였다. (스펙트럼으로부터 유추 딸 이온) 검출 된 펩티드의 질량과 그 분해 단편 이론적 L.로부터 구축 유전자 발현 라이브러리로부터 수득 된 cDNA 서열의 번역으로부터 예측 펩타이드 서열과 비교 하였다 개밥 바라기 독 샘 (21) (글 랜드 해부 프로토콜에 의해 취득한 전술). 이 실험에서, 36 단백질은 99.9 %의 확률 임계치에서, 모든 수집 된 스펙트럼으로부터 검출하고, 적어도 하나의 펩티드를 검출 함유 하였다. 검출 된 단백질의 하나는 단백질 서열 (도 1B)의 35 %를 덮고, 세 배타적 펩티드에 대응하는, 43 총 스펙트럼 (도 1a에 도시 된 일례의 스펙트럼)에 의해지지된다. collecte 수 번역 감지 단백질 (<html> D cDNA를) L.에서 latrodectin하는 최고 BLASTP 히트가 이 실험에서 검출 된 단백질의 아미노산 서열 수준에서 2E-46의 전자 점수 tredecimguttatus (GenBank 등록 P49125.1), 및 주 80 % 동일성. 또한 알파 - latrotoxin 저 분자량 단백질로 알려져 Latrodectin는 블랙 위도우의 인식 독 성분 제시된 프로토콜의 효과를 검증, 22, 23 스파이더이다. 독에서 확인 된 일부 단백질은 BLAST 히트가 발견되는 시퀀스에 해당합니다. 미지의 단백질 독 오염물을 나타내고, 또는 때문에 기인 거미 가능한 제한된 게놈 자원뿐만 아니라 단백질 제한된 기능 정보 등의 결과인지 불분명하다. 그럼에도 불구하고, 유전자 또는 단백질 발현은 진짜 독 구성 요소인지 여부를 공개해야 다른 조직에 비해 독을 분비 이러한 새로운 단백질의 풍요 로움을 조사 분석한다. 항상 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지를 = FO &quot;천만에 <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1 : 질량 분석기를 사용하여 블랙 위도우의 독에서 확인 Latrodectin 펩타이드 (A) 대표 스펙트럼 (43 일) L.의 MuDPIT 분석의 MS / MS 부분을 통해 발견했습니다. 개밥 바라기 부분 B. 스펙트럼에 도시 된 수집 된 cDNA 서열의 예측 된 변환에 할당 독이 질량 상단 문자로, (CGEEDFGEEIVK) 부모 펩타이드를 단편화 제조 횡축 검출 딸 이온의 비 (m / z)를 충전하기 위해 도시 일부의 스펙트럼에 딸 이온 질량에 기초하여 상기 펩타이드 서열을 나타낸다. (B) 단백질 서열은, 적색 굵게 도시 할당 및 텍스트를 파트에 도시 된 스펙트럼 추가 빨간색 텍스트 (굵게하지 않음)로부터 대응하는 서열을 강조했다 이 단백질의 다른 펩타이드는 다른 수집 SP 검출 나타냅니다ectra. 단백질 서열은 해부 독 땀샘에서 얻은 cDNA 서열 변환됩니다.

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Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

이 기사는 1 위해 전기 자극을 이용하여 거미의 독을 추출하기위한 프로토콜), 프로 테오 믹 특성을 수행 2) 독 선 유전자 발현을 자극, 3) 독의 기능 연구를 수행을 제공합니다. 이는 유전자 발현 연구를위한 독 그랜드 microdissections의 설명이 이어진다.

프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

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Research

JoVE Journal

Biology

33.3K 조회수.  University of Massachusetts Lowell.  이 기사는 1 위해 전기 자극을 이용하여 거미의 독을 추출하기위한 프로토콜), 프로 테오 믹 특성을 수행 2) 독 선 유전자 발현을 자극, 3) 독의 기능 연구를 수행을 제공합니다. 이는 유전자 발현 연구를위한 독 그랜드 microdissections의 설명이 이어진다. 

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Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

단백질의 전기 영동 분리

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

연구

생물학

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

독 독 소 암살자 버그와 다른 Heteropteran 곤충에서 수확

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

환경과학

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

에서 독소 유도와 단백질 추출 Fusarium 종.</emProteomic 연구> 문화

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

생화학

Trichogramma dendrolimi 및 Venom Extraction에 의한 인공 숙주 기생

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

저자 스포트라이트: Trichogramma Parasitoid Wasps의 효율적인 독 추출 방법 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

인공 숙주를 사용하여 기생 말벌 Trichogramma dendrolimi 에서 독 추출

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of developing offspring 1,2. Spiders accomplish these tasks by spinning several distinct fiber types that have diverse mechanical properties. Such specialization of fiber types has occurred through the evolution of different silk-producing glands, which function as small biofactories. These biofactories manufacture and store large quantities of silk proteins for fiber production. Through a complex series of biochemical events, these silk proteins are converted from a liquid into a solid material upon extrusion.
Mechanical studies have demonstrated that spider silks are stronger than high-tensile steel 3. Analyses to understand the relationship between the structure and function of spider silk threads have revealed that spider silk consists largely of proteins, or fibroins, that have block repeats within their protein sequences 4. Common molecular signatures that contribute to the incredible tensile strength and extensibility of spider silks are being unraveled through the analyses of translated silk cDNAs. Given the extraordinary material properties of spider silks, research labs across the globe are racing to understand and mimic the spinning process to produce synthetic silk fibers for commercial, military and industrial applications. One of the main challenges to spinning artificial spider silk in the research lab involves a complete understanding of the biochemical processes that occur during extrusion of the fibers from the silk-producing glands.
Here we present a method for the isolation of the seven different silk-producing glands from the cobweaving black widow spider, which includes the major and minor ampullate glands [manufactures dragline and scaffolding silk] 5,6, tubuliform [synthesizes egg case silk] 7,8, flagelliform [unknown function in cob-weavers], aggregate [makes glue silk], aciniform [synthesizes prey wrapping and egg case threads] 9 and pyriform [produces attachment disc silk] 10. This approach is based upon anesthetizing the spider with carbon dioxide gas, subsequent separation of the cephalothorax from the abdomen, and microdissection of the abdomen to obtain the silk-producing glands. Following the separation of the different silk-producing glands, these tissues can be used to retrieve different macromolecules for distinct biochemical analyses, including quantitative real-time PCR, northern- and western blotting, mass spectrometry (MS or MS/MS) analyses to identify new silk protein sequences, search for proteins that participate in the silk assembly pathway, or use the intact tissue for cell culture or histological experiments.

Here we describe an efficient strategy to remove the silk-producing glands from the abdomen of female black widow spiders. This procedure allows the rapid isolation of the seven distinct silk-producing glands in a highly purified fashion, an important process for investigators studying spider silk production and fiber assembly.

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

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프로테옴 Transcriptomic 분석에 대한 거미의 독을 추출하고 독 그랜드 Microdissections

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인공 숙주를 사용하여 기생 말벌 Trichogramma dendrolimi 에서 독 추출

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