עבודה זו נתמכה על ידי R01 DC013339, R03 DC011373, ורות ל &#39;Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס T32 DC000014. חלק מהעבודה בוצע באמצעות Monell chemosensory קולטן איתות הליבה, אשר נתמכה בחלקו על ידי מימון מDC011735 P30-NIH NIDCD Core גרנט. המחברים מודים ג Sezille לעזרה באיסוף הנתונים.

1. תרבות של תאי Hana3A <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת M10 ידי להשלים בינוני מינימום הכרחי (MEM) עם 10% (v / v) FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים בתקשורת M10. הערה: וקטורי הביטוי לRTP1L, RTP2, REEP1, ו-G αolf להקנות עמידות puromycin לתאי Hana3A, אבל השמירה על התאים עם אנטיביוטיקה זה לא משפיע באופן משמעותי תוצאות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת ביחס של 1:08 ב10 מנות סנטימטר כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. תאי ציפוי עבור transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מ100% מחוברות 10 צלחת סנטימטר של תאי Hana3A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS, מתערבל הצלחת, וaspirating PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA ולחכות לתאים לנתק (כ 1 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר M10 ולשבור את גושי תא על ידי triturating בערך 10x &amp;# 160; עם טפטפת 10 מיליליטר. פיפטה בזהירות כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת 96 היטב, העברת 1 מיליליטר של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות, ולשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 6 מיליליטר M10 לכל 1 מיליליטר של תאים שהועברו בשלב 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של תאים היטב בכל צלחת 96 היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol> 3. Transfection של קולטני ריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פלסמיד דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA פלסמיד באמצעות פרוטוקול ללא רעלן פנימי. הערה: ערכות הכנה השתמש בפלסמיד דנ&quot;א מיועד &quot;, רעלן פנימי ללא תשלום,&quot; או להוסיף שלב חילוץ פנול, כלורופורם לפרוטוקול הכנת פלסמיד דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל DNA לריכוז של 100 ng / μl בTE חיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב לתאים מצופים (שלב 2.7) כדי להבטיח confluency נכון של approximately 30-50% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: בעוד confluency זה לא אופטימלי למגיב transfection השומנים בדם, confluency של 30-50% בשלב זה הוא אופטימלי למדידת פעילות לוציפראז 24 שעות לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Transfection Mix <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL פלסמידים לתוך מדיום MEM כל הכרכים מפורטים בטבלה המס &#39;1 כדי להפוך את תמהיל פלסמיד (כרכים שצוין הם לכל צלחת 96 היטב). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;;text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> תערובת פלסמיד </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> בכל טוב </td><td> לכל צלחת 96 היטב </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 μl </td></tr><trגובה = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> PCRE לוק </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רכיבי פלסמיד תערובת. היטב ולכל כרכי 96 גם צלחת של RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL, וממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת 96 היטב, לדלל 18 מגיב transfection שומנים μl ב450 בינוני MEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פלסמיד תערובת (משלב 3.3.1), קולטני ריח מתויג rhodopsin בפלסמיד PCI (Rho-OR-PCI), ותמהיל שומנים transfection (משלב 3.3.2) כדי להפוך מפורט מורכבים ב <sטרונג&gt; טבלה 2. מערבבים את הפתרון על ידי טחינה דקה ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת M10 לפי טבלה 2 הערה:. התגובה הזו היא זמן רגיש ולא צריך להיות מותר להמשיך ליותר מ 30 דקות. חישוב +10% גם הוא חשוב כדי להבטיח נפח מספיק לשלבים הבאים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> מורכב </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> בכל טוב </td><td> לכל טוב +10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> תערובת פלסמיד </td><td> 4.2 μl </td><td> 4.58 μl </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OR-PCI </td><td> 0.05 ng </td><td> 0.06 ng </td></tr><trגובה = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> תערובת transfection שומנים בדם </td><td> 4.2 μl </td><td> 4.58 μl </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7 μl </td><td> 45.83 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רכיבים מורכבים. היטב ולכל כרכים + 10% גם של תערובת פלסמיד (טבלת 1), פלסמיד חוש הריח קולט (Rho-OR-PCI), ותערובת transfection שומנים בדם. M10 מתווסף כדי להרוות את התגובה הבאה דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol></li></ol><ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את התקשורת על צלחות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של מורכב זה לזה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol> 4. ריח גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים transfected כדי להבטיח confluency נכון של 50-80% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: אם תאים הם פחות מ 50קריאות% ומחוברות, גחלילית לוציפראז ולוציפראז Renilla עלולות להיות נמוכות מדי למדידת הפעלת קולט. תשקול לבטל את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרונות מניות M של כל ריח בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות גירוי ריח במדיום CD293. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסויי הקרנה, לדלל פתרון מניות של ריח ל100 מיקרומטר. כמו כן להכין שליטה ללא ריח (CD293 בלבד) על מנת לשלוט לאו הפעלה ברקע. הערה: לניסויי הקרנה, כל זוג או / ריח הוא נבדק רק פעם אחת בכל ניסוי. בגלל כמה דיפוזיה ריח פני בארות אפשרית, מומלץ לעורר עם odorant אחד לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי תגובת מינון, להכין שבעה דילולים סדרתי של פי 10 של פתרון מניות ריח בשלושה עותקים החל משעת 1 מ&quot;מ לכל קולטן. כמו כן להכין את אותו ריח דילולים בשלושה עותקים לתאי transfected וקטור ריקים כדי לשלוט על הפעלת רקע ריח. הערה: לניסויי תגובת מינון, כל אחד oטיפול ריכוז dor צריך להתנהל בשלושה עותקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את התקשורת על צלחות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μl פיפטה של ​​פתרון גירוי ריח לכל היטב דגירה במשך 4 שעות. </li></ol> 5. מדידה או לפעילות באמצעות בלוציפראז Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מצע גחלילית לוציפראז להוראות היצרן וחנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 1 מיליליטר של מצע גחלילית בלוציפראז לכל צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תגובת גחלילית לוציפראז טרי מרווה ומגיב לוציפראז Renilla מצע (5 לוציפראז μl מרווה / מצע לוציפראז Renilla לכל 1 מיליליטר של חיץ). הערה: כ 1 מיליליטר של מגיב הוא זקוק לכל צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את קורא microplate זורח. פתח את תוכנת microplate קורא. בתוך סמל המערכת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;טרום החימום&quot; Tab, סמן את התיבה למצב &quot;ON&quot; ולהגדיר את הטמפרטורה של המכונה ל25 °; ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הלשונית &quot;Dispenser&quot;, ראש כל מתקן עם 1,000 μl של 70% אתנול ואחרי 1,000 μl של מים מזוקקים. הערה: השתמש aliquots נפרדים של אלכוהול ומים לכל מתקן. אתנול משמש לחיטוי מכשירי, ומים מסיר אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש כל מתקן עם 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: תחול עם אוויר מבטיחה כי מצעי לוציפראז אינם מדוללים במים שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקן ראש 1 עם 1,080 μl של מצע גחלילית לוציפראז (משלב 5.2). מתקן ראש 2 עם מצע Renilla לוציפראז (משלב 5.3). הערה: היזהר שלא לחצות לזהם-מצעי לוציפראז. תחול עם מצעי לוציפראז ממלא את השטח המת במכשירים מגיב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרוטוקול הבא לקרוא גחלילית שתי והארת לוציפראז Renilla. בתוך התוכנה הקשורים לקורא microplate, בלתידער תפריט &quot;קובץ&quot;, לחץ על &quot;משימה החדשה&quot;. סמן &quot;פרוטוקולים&quot; ולחץ על &quot;צור חדש&quot;. בחלון הבא, העיגול שליד &quot;תקן פרוטוקול&quot; צריך להיות נבחרים. לחץ על &quot;אישור&quot;. לחץ לחיצה כפולה על &quot;נוהל&quot; בצד שמאל של המסך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 10 μl של מצע גחלילית בלוציפראז לכל הבארות באמצעות מתקן 1. תחת תפריט &quot;פעולות&quot;, לחץ על &quot;לוותר&quot;. בחלון &quot;לוותר על שלב&quot;, קבע: &quot;Dispenser&quot; 1, &quot;לקרקע&quot; לאף אחד &quot;, כרך לוותר&quot; ל10 μl ו&quot; שיעור &quot;ל225 μl / sec. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצלחת ל30 שניות. תחת תפריט &quot;פעולות&quot;, לחץ על &quot;Shake&quot;. בחלון &quot;Shake שלב&quot;, להגדיר &quot;עוצמה&quot; לבינוני ו&quot; משך &quot;ל00:30 MM: SS. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. תחת תפריט &quot;פעולות&quot;, לחץ על &quot;קראו&quot;;. בחלון &quot;קראו שלב&quot;, קבע: &quot;איתור שיטה&quot; להארה &quot;, קראו סוג&quot; לנקודתי קצה &quot;, אינטגרציה בזמן&quot; ל00:00:50 MM: SS: ss, &quot;סטי מסנן&quot; 1, &quot;פליטה&quot; לחור, &quot;מיקום אופטיקה&quot; למעלה, &quot;רווח&quot; ל135, ו&quot; קראו גובה &quot;ל1.00 מ&quot;מ. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 10 μl של מצע לוציפראז Renilla לכל הבארות באמצעות מתקן 2. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.1, למעט קבוצה &quot;Dispenser&quot; 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צלחת ל30 שניות. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מצלחת 96 היטב ומניח את הצלחת בקורא microplate. הפעל את התכנית להקים בשלב 5.5 לקרוא הארה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המשאבות מנפק מגיב. מאייקון המערכת תחת לשונית &quot;Dispenser&quot;: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר 1,000 μl של fמצע לוציפראז irefly ממתקן גחלילית בלוציפראז לתוך צינור התאוששות. הערה: לוציפראז Firefly ניתן לאחסן ב -80 ° C ושימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש כל מתקן עם 1,000 μl של מים מזוקקים, ואחריו 1,000 μl של 70% אתנול, ולבסוף 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: מים מסיר מצעי לוציפראז מהמשאבות מגיב, מחטא אתנול, ואוויר מתייבש כל אתנול שיורית. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת microplate קורא, לחץ לחיצה כפולה על &quot;הבונים דווח / יצוא&quot; בצד השמאל של המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;חדש היצוא לאקסל&quot; ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן Export1 ולחץ על &quot;ערוך&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פי &quot;נוהל&quot; &quot;תוכן&quot; לבדוק &quot;תיאור מערכת&quot;, &quot;תיאור פלייט&quot;, וגם &quot;מטריקס הפריסה פלייט&quot;. כולל &quot;נתונים גולמיים&quot;nd &quot;מחושב נתונים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;עבודה&quot;, סמן &quot;Autoexecute על השלמת ההליך&quot;. תחת יצוא מצב, לבדוק &quot;כל הצלחות באותה חוברת העבודה&quot; ו &quot;כגיליון עבודה חדש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;קובץ&quot; בוחר את שם קובץ בפורמט ומיקום קובץ, ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את החלון &quot;דווח / יצוא הבונים&quot;. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג ערכי לוציפראז מנורמלים, לחלק את קריאת גחלילית לוציפראז הארה לכל טוב (שלב 5.6.3) על ידי קריאת Renilla הארה לכל טוב (שלב 5.6.6). </li></ol>

<ol>
	<li>Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+a+human+olfactory+receptor+functionally+expressed+in+human+embryonic+kidney+293+cells+and+Xenopus+Laevis+oocytes.">Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).</li><li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+testicular+odorant+receptor+mediating+human+sperm+chemotaxis.">Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis.</a> Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).</li><li>Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+odorant+specificity+of+two+human+olfactory+receptors+from+different+phylogenetic+classes+and+evidence+for+antagonism.">Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism.</a> Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).</li><li>Matarazzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+two+human+olfactory+receptors+expressed+in+the+baculovirus+Sf9+insect+cell+system.">Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system.</a> Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).</li><li>Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+extended+receptive+ligand+repertoire+of+the+human+olfactory+receptor+OR17-40+comprising+structurally+related+compounds.">Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds.</a> Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).</li><li>Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+heat+shock+protein+enhances+the+expression+of+mammalian+olfactory+receptor+proteins.">A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins.</a> Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).</li><li>Shirokova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+ligands+for+orphan+olfactory+receptors.+G+protein-dependent+agonism+and+antagonism+of+odorants.">Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants.</a> The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).</li><li>Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+a+human+odorant+receptor+alters+odour+perception.">Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception.</a> Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).</li><li>Menashe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elucidation+of+human+hyperosmia+to+isovaleric+acid.">Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid.</a> PLoS biology. 5 (11), (2007).</li><li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire.">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Science signaling. 2 (60), (2009).</li><li>Jaeger, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mendelian+Trait+for+Olfactory+Sensitivity+Affects+Odor+Experience+and+Food+Selection.">A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection.</a> Current Biology. 23, 1-5 (2013).</li><li>DeMaria, S., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+smell.">The cell biology of smell.</a> The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).</li><li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse.">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).</li><li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+human+olfactory+subgenome.">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).</li><li>Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+olfactory+receptor+(OR)+gene+superfamily.">Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily.</a> Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).</li><li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+receptor+codes+for+odors.">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li><li>Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+odorant+receptor.">The molecular receptive range of an odorant receptor.</a> Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).</li><li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li><li>Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+a+broad+but+selective+ligand+spectrum+of+a+mouse+olfactory+receptor:+mapping+the+odorant-binding+site.">Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).</li><li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Retention,+Degradation,+and+Aggregation+of+Olfactory+G-Protein+Coupled+Receptors.">Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li><li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors.">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Expression+of+a+Mammalian+Odorant+Receptor.">Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li><li>Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+bases+of+odor+discrimination:+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants.">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li><li>Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Ligands+for+Olfactory+Receptors.">Identification of Ligands for Olfactory Receptors.</a> Cell. 95, 917-926 (1998).</li><li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling.">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Science signaling. 4 (155), (2011).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells.">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li><li>Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metric+for+odorant+comparison.">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li><li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors:+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances.">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li><li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system.">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li><li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb:+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli.">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li><li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li><li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons.">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li><li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+&amp;#34;grassy&amp;#34;+smelling+odor,+cis-3-hexen-1-ol.">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &amp;#34;grassy&amp;#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li><li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors.">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li><li>Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates.">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li><li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor.">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li><li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants.">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li><li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+ROC+analysis.">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li><li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors.">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li><li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells.">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

זהות odorant מקודדת על ידי דפוסי הפעלה קולטני ריח, אבל דפוסי הפעלת קולטן, כולל שהקולטנים מופעלים ובאיזו מידה, ידועים פחות מ -6% מקולטניים ריח האנושי 1-11. מאמצים לאפיין קולטני ריח היו מוגבלים על ידי השיטות עתירות העבודה או תחולתם רק קבוצת משנה של 17,23,24,33,34 משפחה קו...

מערכת חוש הריח של היונקים יש את היכולת להגיב למספר עצום של גירויים ריחניים, המאפשרים זיהוי ואפליה של אלפי ניחוחי. קולטני ריח (אס) הם החיישנים המולקולריים שהביעו עצב סנסורי חוש הריח באפיתל ההרחה 12. הכרת ריח יונקים מתרחשת באמצעות הפעלת ההפרש של חדרי ניתוח על ידי ניחוחי, ו-OR משפחת הגן היא נרחבת, עם בערך 1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים 12-16. הניתוחים תפקודיים קודמים של חדרי ניתוח בתאי עצב של חוש ריח ובתאי Heterologous הראו כי ניחוחי שונה מוכרים על ידי ייחודי, אבל חופף הרכבים של חדרי ניתוח 10,17-20. התאמת ligands לחדרי ניתוח היא קריטית להבנת הקוד וחיוני לבניית מודלים מעשי של חוש ריח חוש הריח. בשל קשיים להביע חדרי ניתוח במערכות Heterologous, כמו גם מספר רב של שניהם ניחוחי וחדרי ניתוח, הנתונים אלה נעדרו במידה רבה מfield; אכן, פחות מ -6% מחדרי ניתוח באדם יש ליגנד פורסם 1-11. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay לוציפראז לאפיין odorant / או אינטראקציות. assay זה מאפשר אפיון התפוקה גבוהה של או.אר. אס, משימה שהיא חיוני להבנת odorant / או אינטראקציות כמו גם בפיתוח מודל של קידוד ריח. מחקרי תפוקה גבוהה של חדרי ניתוח בפני שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, או.אר. האס באו לידי ביטוי בתאי Heterologous נשמרו בחדר המיון ומושפל לאחר מכן בהפרוטאזום 21,22, מניעת חדרי הניתוח מאינטראקציה עם ניחוחי במערכת assay 23-25. בעיה זו טופלה על ידי הגילוי של חלבוני אבזר המאפשרים ביטוי על פני קרום התא יציב של מגוון רחב של חדרי הניתוח 19,26,27. קולטן חלבוני טרנספורטר-1 ו -2 (RTP1 ו2) לקדם או ביטוי על פני קרום תא והפעלה בתגובה לגירוי odorant 19. המבוסס על עבודה זו, תאי HEK293T היושונה כדי להביע את היציבות RTP1 ארוך (RTP1L) וRTP2, חלבון שיפור ביטוי הקולטן 1, וαolf G, וכתוצאה משורת תאי Hana3A 19,27. בנוסף, קולטן מסוג 3 מוסקריניים אצטילכולין (M3-R) אינטראקציה עם חדרי ניתוח על פני התא ומשפר הפעלה בתגובה לניחוחי 26. Co-transfection של OR עם RTP1S וM3-R לתוצאות תאי Hana3A בביטוי חזק, עקבי ופונקציונלי של מגוון רחב של חדרי ניתוח על פני תא 27. שנית, יונקים או רפרטוארים הם גדולים למדי. בבני אדם, למשל, רפרטואר OR הוא סדר גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט התעורר אצלם, ו -2 סדרי גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט החזותי. למרות שיבוט בודד או הוא פרוטוקול פשוט יחסית, נדרש מאמץ מעלה מול משמעותי כדי ליצור ספרייה מקיפה. שלישית, למרות שאנו יודעים כי בראייה, אורך גל מתורגם לצבע ובתדירות אודישן מיתרגם המגרש, והארגון של ריחות הוא הבין היטב, מה שהקשה על חוקרים ללשרבב ממדגם מייצג של ניחוחי. למרות שחלק מהתקדמות שנעשתה ב10,28 חזית זו, המפה של נוף חוש הריח נשארת שלמה. הקרנת עשרות אלפי מולקולות נגד מאות חדרים הניתוח היא משימה מרתיעה; מסכי תפוקה גבוהה בתחום זה דורשים קמפיינים שהוגדרו בזהירות. האתגרים הנותרים העיקריים הם אלה של לוגיסטיקה ועלות ולא בעיות הטמונות לטכניקה. למרות הקרנת Heterologous לא הייתה בשימוש נרחב כדי לזהות ligands ידי קבוצות אקדמיות, חברה פרטית שהשתמשה באותה הטכניקה כדי לזהות ligands ל100 חדרי ניתוח אנושיים 29. למרבה הצער, הנתונים האלה יישארו קניינית. יש assay לוציפראז התפוקה גבוהה המתוארים כאן מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות המשמשות להערכה או הפעלה. למרות responses של עצב סנסורי חוש הריח האם נמדד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה סידן, יש טכניקות אלה מתקשים מתגרים מזה בו או גורם לתגובה של נוירון בשל החפיפה במאפייני תגובה לנוירונים חוש הריח. למרות דפיקות-בסוג הקולטן-GFP שכותרת 30,31, אספקת קולטנים ספציפיים באמצעות adenovirus לMurine נוירונים חוש הריח 32,33, או ביצוע RT-PCR אחרי הקלטות 17,24,33 יכולים לקשר הקלטות לסוגים בודדים קולט, שיטות אלו נמוכה תפוקה ואינה מתאים למסכים בקנה מידה גדולה. מערכות הקרנת Heterologous הן מדרגי יותר, ושתי צורות עיקריות נמצאות בספרות: כתבי מסלול cAMP ואדנוזין אינוזיטול כתבי מסלול (IP3). על גירוי ריח, או.אר. אס להפעיל מפל איתות התמרה αolf G כי תוצאות בייצור של AMP המחזורי (cAMP) 12. על ידי שיתוף transfecting גן כתב גחלילית בלוציפראז תחת שליטתו של acאלמנט התגובה AMP (CRE), ייצור לוציפראז ניתן למדוד כפונקציה של תגובת ריח, המאפשר כימות של או הפעלה. או הפעלה יכולה גם להיות קשורה למסלול IP3 על ידי שיתוף להביע G-חלבונים כגון G α15/16 או 24,25,34 הכימרה α15-OLF G. אנו בחרנו בassay המוצג כאן מבוסס על שלושה גורמים: (1) שיתוף הביטוי של RTP1 עם קולטני ריח מתויג-Rho משפר את הביטוי של קולטני ריח בתא השטח 19,27; (2) שימוש בגן ​​כתב cAMP מגיב מאפשר למדידה או ההפעלה דרך מסלול השליח השני הקנונית; ו (3) assay הוא מתאים היטב למסכי תפוקה גבוהה. assay לוציפראז תפוקה גבוהה זה חל על מגוון רחב של מחקרים חשובים בתחום לחוש ריח. ראשית, מספר גדול של חדרי ניתוח יכול להיות מוקרן נגד odorant בודד על מנת לקבוע את דפוס הפעלת קולטן עבור spodorant ecific. סוג זה של מחקר זיהה OR7D4 כאו אחראי למתן מענה לandrostenone odorant סטרואידי 8. לעומת זאת, אחד או יכול להיות מוקרן נגד פנל של ניחוחי על מנת לקבוע את פרופיל תגובת קולט 10. כאשר odorant מועמד חוש הריח / או זוגות מזוהים באמצעות מסכי אלה, אינטראקציה יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע ניסוי תגובת מינון בוחן את התגובה של או לריכוזים הולך וגדל של odorant. עקומות מינון תגובה יכולות גם להעריך כיצד שונות גנטיות באו משפיעה בתגובה odorant מבחנה 8,9,11,35, וניתן להרחיב את הלימודים האלה לinterspecific או וריאציה, המאפשרים הבדיקה של אבולוציה קולטן על פני מינים ומוטציות סיבתי באבולוציה 36,37, לבסוף, assay זה יכול לשמש מסך ליריבי ריח כי הם מסוגלים להרגיז או תגובה לodorant במיוחד עבור זוג odorant / קולט ידוע 38,39. לסיכום, זה גבוהassay לוציפראז התפוקה הוא ישים למגוון רחב של מחקרים שיעזרו לאפיין או דפוסי הפעלה ולספק הבנה טובה יותר של קידוד ריח במערכת חוש הריח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="685">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Hana3A cells</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">RTP1S-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">M3-R-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pCRE-luc</td>
			<td style="width:135px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">219076</td>
			<td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pSV40-RL</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2231</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Media, Eagle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4655</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp;region=US">MEM</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td><a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">Trypsin</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">CD293</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11913-019</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">96 well PDL white/clear plate</td>
			<td style="width:135px;">BD BioCoat</td>
			<td style="width:119px;">356693</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2980</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&amp;__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&amp;__utmx=-&amp;__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy S2&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SLAD</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Gen5</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIOSTACK</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">BIOSTACK2WR</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Multiflo</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">MFP</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4414</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips ViaFlo96</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips 384 XYZ</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6403</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384ViaFlo</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td>6030</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740797.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp;region=US">DMSO</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-CN100-0010</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity

ניחוחות ליצור דפוסים ייחודיים וחופפים של הפעלה קולטני ריח, המאפשרים למשפחה של כ -1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים להכיר אלפי ניחוחי. ligands odorant פורסמו על פחות מ -6% של קולטנים אנושיים 1-11. זה חוסר הנתונים נובע בחלקו לקשיים תפקודי המבטאים קולטנים אלה במערכות Heterologous. כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי המכריע של משפחת חוש הריח קולטן בתאי Hana3A, ואחריו הערכת תפוקה גבוהה של הפעלה קולטני ריח באמצעות assay כתב בלוציפראז. assay זה יכול לשמש כדי (1) פנלי מסך של ניחוחי נגד פנלים של קולטני ריח; (2) לאשר אינטראקציה odorant / קולט באמצעות עקומות מינון תגובה; ו (3) להשוות את רמות הפעלת קולטן בין גרסאות הקולטן. בנתוני הדוגמא שלנו, 328 קולטני ריח הוקרנו נגד 26 הניחוח. זוגות odorant / קולטן עם ציוני תגובה שונים היו אין תמיכה בבחירהטד ונבדק בתגובה מינון. נתונים אלה מצביעים על כך שמסך הוא שיטה יעילה להעשרה לזוגות odorant / קולט שיעברו ניסוי תגובת מינון, כלומר הקולטנים שיש לי תגובה בתום לב לodorant. לכן, assay לוציפראז תפוקה גבוהה זו הוא שיטה יעילה לאפיון קולטנים צעד חיוני חוש הריח לכיוון מודל של קידוד ריח במערכת ההרחה של היונקים.

מסך ראשי נבדק 328 חדרי ניתוח נגד 26 ריחות בריכוז של 100 מיקרומטר. ריכוז ריח זה הוכח כדי להפעיל חלק גדול מחדרי ניתוח עם ligands הידוע 10 ביעילות. ראשית, פעילות לוציפראז המנורמלת הייתה מחושבת על ידי חלוקת קריאת גחלילית בלוציפראז ידי קריאת לוציפראז Renilla. בשלב בא, ערכי bas...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity at JoVE.com

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט.

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

high-throughput-analysis-mammalian-olfactory-receptors-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K Views.  Monell Chemical Senses Center.  דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט. 

Video: High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to perform receptor autoradiographic mapping.
Tissue specimens are harvested and stored at -80 &#176;C. A cryostat is used to coronally section the tissue (brain) and thaw-mount the sections onto charged slides. The slide-mounted tissue sections are incubated in 125I-SI-Ang II to radiolabel Ang II receptors. Adjacent slides are separated into two sets: &#39;non-specific binding&#39; (NSP) in the presence of a receptor saturating concentration of non-radiolabeled Ang II, or an AT1 Ang II receptor subtype (AT1R) selective Ang II receptor antagonist, and &#39;total binding&#39; with no AT1R antagonist. A saturating concentration of AT2 Ang II receptor subtype (AT2R) antagonist (PD123319, 10 &#181;M) is also present in the incubation buffer to limit 125I-SI-Ang II binding to the AT1R subtype. During a 30 min pre-incubation at ~22 &#176;C, NSP slides are exposed to 10 &#181;M PD123319 and losartan, while &#39;total binding&#39; slides are exposed to 10 &#181;M PD123319. Slides are then incubated with 125I-SI-Ang II in the presence of PD123319 for &#39;total binding&#39;, and PD123319 and losartan for NSP in assay buffer, followed by several &#39;washes&#39; in buffer, and water to remove salt and non-specifically bound radioligand. The slides are dried using blow-dryers, then exposed to autoradiography film using a specialized film and cassette. The film is developed and the images are scanned into a computer for visual and quantitative densitometry using a proprietary imaging system and a spreadsheet. An additional set of slides are thionin-stained for histological comparisons.
The advantage of using receptor autoradiography is the ability to visualize Ang II receptors in situ, within a section of a tissue specimen, and anatomically identify the region of the tissue by comparing it to an adjacent histological reference section.

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.