Questo lavoro è stato sostenuto da DC013339 R01, R03 DC011373, e Ruth L. Kirschstein Servizio National Research Award T32 DC000014. Una parte del lavoro è stato eseguito utilizzando il Monell chemosensory Receptor segnalazione core, che è supportato, in parte, da un finanziamento della P30 DC011735 NIH-NIDCD core Grant. Gli autori ringraziano C. Sezille aiuto con la raccolta dei dati.

1. Coltura di cellule Hana3A <ol><li> Preparare supporti M10 completandolo mezzo minimo essenziale (MEM) con il 10% (v / v) di FBS. </li><li> Cultura di manutenzione <ol><li> Mantenere le cellule in mezzi M10. NOTA: I vettori di espressione per RTP1L, RTP2, REEP1, e G αolf conferiscono resistenza puromicina alle cellule Hana3A, ma mantenendo le cellule con questo antibiotico non influenzano significativamente i risultati del test. </li><li> Subculture con un rapporto di 01:08 a 10 centimetri piatti ogni 2-3 giorni. </li><li> Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Cellule placcatura per Transfezione <ol><li> Aspirare il terreno da un confluente 10 centimetri piatto 100% delle cellule Hana3A. </li><li> Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 10 ml di PBS, roteando il piatto, e aspirare il PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina / EDTA e attendere cellule di dissociarsi (circa 1 min). </li><li> Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml di M10 e rompere grumi di cellule triturando circa 10x &amp;# 160, con una pipetta 10 ml. Dispensare con cautela per evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria nella media. </li><li> Per ciascuna piastra da 96 pozzetti, trasferire 1 ml di cellule in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 200 xg per 5 min, e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in 6 ml M10 per 1 ml di cellule trasferito nel passaggio 2.5. </li><li> Pipettare 50 ml di cellule a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 3. Trasfezione di recettori olfattivi <ol><li> Preparazione di DNA plasmidico <ol><li> Preparare plasmide DNA tramite un protocollo privo di endotossine. NOTA: kit di preparazione uso del DNA plasmide designati &quot;privo di endotossine&quot;, o aggiungere un passo di estrazione fenolo-cloroformio al DNA protocollo di preparazione plasmide. </li><li> Diluire DNA ad una concentrazione di 100 ng / ml in tampone TE. </li></ol></li><li> Osservare le cellule placcato (Passo 2.7) per garantire una corretta confluenza di ravvicinamentotamente 30-50% per bene e tornare a incubatore. NOTA: Mentre questa confluenza non è ottimale per il reagente di transfezione lipidi, una confluenza del 30-50% in questa fase è ottimale per misurare l&#39;attività della luciferasi 24 ore dopo la trasfezione. </li><li> Preparazione di Transfezione Mix <ol><li> Pipetta RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-luc, e pSV40-RL plasmidi in MEM medio per i volumi specificati nella tabella 1 per rendere il plasmide mix (i volumi indicati si intendono piastra a 96 pozzetti). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Mix plasmide </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> per pozzetto </td><td> per piastra a 96 pozzetti </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 microlitri </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> PCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Componenti Tabella 1. Plasmidi mix. Per oltre e per volumi piastra a 96 pozzetti di RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE-luc, e pSV40-RL, e MEM. </li><li> Per ogni piastra a 96 pozzetti, diluire 18 ml di lipidi trasfezione reattivo in 450 microlitri di media MEM. </li><li> Pipetta plasmide mix (dal punto 3.3.1), rodopsina-tagged recettore olfattivo PCI plasmide (Rho-OR-PCI), e la miscela di trasfezione lipidico (dal punto 3.3.2) per rendere il complesso dettagliata <strong&gt; Tabella 2. Mescolare la soluzione da triturazione e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Arrestare la reazione aggiungendo M10 conformemente alla tabella 2. NOTA: questa reazione è il tempo sensibile e non dovrebbe essere permesso di continuare per più di 30 min. Il pozzo + 10% calcolo è importante garantire un volume sufficiente per passi successivi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Complesso </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> per pozzetto </td><td> per pozzetto + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Mix plasmide </td><td> 4.2 microlitri </td><td> 4.58 microlitri </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-O-PCI </td><td> 0.05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Mix di trasfezione Lipid </td><td> 4.2 microlitri </td><td> 4.58 microlitri </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7 ml </td><td> 45,83 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Componenti complessi. Per bene e per oltre + 10% di volumi della miscela di plasmide (Tabella 1), il plasmide recettore olfattivo (Rho-OR-PCI), e mescolare lipidi trasfezione. M10 viene aggiunto per estinguere la seguente reazione a 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Toccare il supporto sulle piastre di cella. </li><li> Pipettare 50 ml di complesso a ciascun pozzetto e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> 4. Odore stimolazione <ol><li> Osservare le cellule trasfettate per garantire una corretta confluenza del 50-80% per bene e tornare a incubatore. NOTA: Se le cellule sono meno di 50Letture% confluenti, lucciola luciferasi e Renilla luciferasi può essere troppo basso per la misurazione di attivazione del recettore. Si consideri scartando la piastra. </li><li> Preparare 1 M soluzioni madre di ogni odore in DMSO. </li><li> Preparare le soluzioni di stimolazione odore di CD293 medio. <ol><li> Per gli esperimenti di screening, diluire soluzione stock di odore a 100 micron. Anche preparare un controllo senza odore (CD293 solo) per controllare per OR attivazione sfondo. NOTA: Per gli esperimenti di screening, ogni coppia O / odore è stato testato soltanto una volta per ogni esperimento. Poiché alcuni diffusione odore di tutti i pozzetti è possibile, si raccomanda di stimolare con un odorizzante per ciascuna piastra. </li><li> Per gli esperimenti dose-risposta, preparare sette diluizioni seriali di 10 volte di soluzione odore magazzino in triplice copia a partire da 1 mm per ciascun recettore. Anche preparare le stesse diluizioni odore in triplicato per cellule transfettate vettore vuoto al fine di controllare l&#39;attivazione odore sfondo. NOTA: Per gli esperimenti dose-risposta, ogni odor trattamento concentrazione dovrebbe essere condotto in triplice copia. </li></ol></li><li> Toccare il supporto sulle piastre di cella. </li><li> Pipettare 25 ml di soluzione di stimolazione odore ad ogni pozzetto e incubare per 4 ore. </li></ol> 5. Misura o attività via Luciferase Assay <ol><li> Risospendere substrato di luciferasi di lucciola secondo le istruzioni del produttore e conservare a -80 ° C. </li><li> Scongelare 1 ml di substrato della luciferasi di lucciola per piastra a 96 pozzetti. </li><li> Preparare fresco reazione luciferasi di lucciola dissetante e Renilla luciferasi reagente substrato (5 microlitri luciferasi quencher / Renilla luciferasi substrato per 1 ml di tampone). NOTA: circa 1 ml di reagente è necessario per piastra a 96 pozzetti. </li><li> Preparare il lettore luminescenti micropiastre. Aprire il software lettore di micropiastre. All&#39;interno l&#39;icona di sistema: <ol><li> Sotto il &quot;Pre-riscaldamento&quot; Tab, selezionare la casella &quot;ON&quot; e impostare la temperatura della macchina a 25 °; C. </li><li> Nella scheda &quot;Dispenser&quot;, prime ciascun erogatore con 1.000 ml di etanolo al 70% seguita da 1.000 ml di acqua distillata. NOTA: Utilizzare aliquote separate di alcool e acqua per ogni erogatore. Etanolo è utilizzato per disinfettare i dispenser, e acqua rimuove l&#39;etanolo residuo. </li><li> Prime ciascun erogatore con 1.500 ml di aria (rimuovi dispenser da liquido). NOTA: adescamento di aria assicura che i substrati luciferasi non sono diluiti con acqua residua. </li><li> Dispenser Prime 1 con 1.080 ml di substrato luciferasi di lucciola (dal punto 5.2). Dispenser Prime 2 con Renilla substrato luciferasi (dal punto 5.3). NOTA: Fare attenzione a non contaminare i substrati luciferasi. Adescamento con i substrati luciferasi riempie lo spazio morto nei dispensatori di reagenti. </li></ol></li><li> Impostare il seguente protocollo di leggere sia lucciola e Renilla luciferasi luminescenza. All&#39;interno del software associato al lettore di micropiastre, ONUder menu &quot;File&quot;, cliccare su &quot;Nuova attività&quot;. Evidenziare &quot;Protocolli&quot; e cliccare su &quot;Crea nuovo&quot;. Nella finestra successiva, il cerchio accanto a &quot;protocollo standard&quot; dovrebbe essere selezionata. Fare clic su &quot;OK&quot;. Fare doppio clic su &quot;Procedura&quot; sul lato sinistro dello schermo. <ol><li> Dispensare 10 ml di substrato luciferasi di lucciola a tutti i pozzetti con dispenser 1. Sotto il menu &quot;Azioni&quot;, fai clic su &quot;Dispense&quot;. Nella finestra &quot;Dispensare Step&quot;, impostare &quot;Dispenser&quot; a 1 &quot;Adescamento&quot; a nessuno, &quot;Dispense Volume&quot; a 10 microlitri e &quot;Rate&quot; a 225 ml / sec. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Agitare la piastra per 30 sec. Sotto il menu &quot;Azioni&quot;, fai clic su &quot;Shake&quot;. Nella finestra &quot;Shake Step&quot;, impostare &quot;Intensity&quot; per Medio e &quot;Durata&quot; alle 0:30 MM: SS. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Leggi la luminescenza di tutti i pozzi per 0,5 sec per bene. Sotto il menu &quot;Azioni&quot;, fare clic su &quot;Leggi&quot;;. Nella finestra &quot;Leggi Step&quot;, impostare &quot;Metodo di rilevazione&quot; a luminescenza, &quot;Leggi Type&quot; per Endpoint, &quot;Integrazione Time&quot; a 00:00:50 MM: SS: ss, &quot;Filter Sets&quot; a 1 &quot;Emissione&quot; Hole, &quot;Ottica Position&quot; a Top, &quot;Gain&quot; per 135, e &quot;Leggi altezza&quot; a 1.00 mm. Fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Dispensare 10 ml di Renilla substrato luciferasi a tutti i pozzetti con dispenser 2. Impostare le condizioni della Fase 5.6.1, salvo set &quot;Dispenser&quot; a 2. </li><li> Agitare piastra per 30 sec. Impostare le condizioni nel passaggio 5.6.2. </li><li> Leggi luminescenza di tutti i pozzetti per 0,5 sec per bene. Impostare le condizioni nel passaggio 5.6.3. </li></ol></li><li> Rimuovere il coperchio dalla piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra nel lettore di micropiastre. Avviare il programma esposto al punto 5.5 per leggere piastra luminescenza. </li><li> Pulire le pompe dispenser reagenti. Dall&#39;icona sistema sotto la scheda &quot;Dispenser&quot;: <ol><li> Purge 1.000 ml di fsubstrato di luciferasi irefly dal dispenser luciferasi lucciola in un tubo di recupero. NOTA: luciferasi della lucciola può essere conservato a -80 ° C e riutilizzato. </li><li> Prime ciascun erogatore con 1000 ml di acqua distillata, seguiti da 1.000 ml di etanolo al 70%, e infine 1.500 microlitri di aria (rimuovi dispenser da liquido). NOTA: L&#39;acqua elimina substrati luciferasi dalle pompe reagenti, disinfetta etanolo, e l&#39;aria asciuga ogni residuo di etanolo. </li></ol></li></ol> 6. Analisi dei dati <ol><li> Data Export <ol><li> Nel software lettore di micropiastre, fare doppio clic su &quot;Segnala / Export Costruttori&quot; sul lato sinistro dello schermo. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Nuovo Esporta in Excel&quot; e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Evidenziare Esport1 e fare clic su &quot;Modifica&quot;. <ol><li> In &quot;Contenuti&quot; check &quot;Descrizione del sistema&quot;, &quot;Procedura&quot;, &quot;Descrizione Piatto&quot; e &quot;Piatto layout Matrix&quot;. Include &quot;dati grezzi&quot;, unnd &quot;Calcolato dati&quot;. </li><li> In &quot;Workflow&quot;, selezionare &quot;Esecuzione automatica al termine della procedura&quot;. In modalità di esportazione, controllare &quot;Tutti i piatti nella stessa cartella di lavoro&quot; e &quot;come un nuovo foglio di lavoro&quot;. </li><li> Sotto &quot;File&quot;, scegliere il formato del nome file e il percorso del file e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Chiudere la finestra &quot;Segnala / Export Costruttori&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Per ottenere i valori normalizzati luciferasi, dividere la luciferasi di lucciola lettura luminescenza per ogni bene (Step 5.6.3), dalla lettura luminescenza Renilla per ogni pozzetto (fase 5.6.6). </li></ol>

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K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metric+for+odorant+comparison.">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li><li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors:+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances.">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li><li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system.">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li><li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb:+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli.">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li><li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li><li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons.">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li><li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors.">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li><li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+&amp;#34;grassy&amp;#34;+smelling+odor,+cis-3-hexen-1-ol.">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &amp;#34;grassy&amp;#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li><li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors.">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li><li>Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates.">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li><li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor.">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li><li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants.">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li><li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+ROC+analysis.">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li><li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors.">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li><li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells.">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Identità odorizzante è codificato da olfattivi pattern di attivazione del recettore, ma pattern di attivazione del recettore, tra cui i recettori che vengono attivati ​​e in che misura, sono noti da meno di 6% dei recettori olfattivi umani 1-11. Gli sforzi per caratterizzare i recettori olfattivi sono stati limitati dai loro metodi o applicabilità alta intensità di lavoro solo a un sottoinsieme della olfattivo 17,23,24,33,34 famiglia di recettori. Il sistema di espressione eterologo Hana3A ...

Il sistema olfattivo dei mammiferi ha la capacità di rispondere ad un vasto numero di stimoli odorosi, consentendo la rilevazione e la discriminazione di migliaia di odoranti. Recettori olfattivi (OR) sono i sensori molecolari espressi dai neuroni sensoriali olfattivi nell&#39;epitelio olfattivo 12. Riconoscimento odore dei mammiferi avviene attraverso l&#39;attivazione differenziale delle RUP di odoranti, e l&#39;OR famiglia di geni è ampia, con circa 1.000 murino e 400 recettori umani 12-16. Analisi funzionali precedenti di RUP nei neuroni olfattivi e nelle cellule eterologhe hanno dimostrato che diversi odoranti sono riconosciuti da unico, ma insiemi di RUP 10,17-20 sovrapposizione. Corrispondenza ligandi di RUP è fondamentale per comprendere il codice olfattivo ed essenziale per la costruzione di modelli sostenibili di olfatto. A causa delle difficoltà che esprimono RUP in sistemi eterologhi nonché il gran numero di entrambi odoranti e RUP, questi dati è stato praticamente assente dal field; anzi, meno del 6% delle RUP umani hanno un ligando pubblicato 1-11. Questo protocollo descrive l&#39;uso di un saggio di luciferasi per caratterizzare odoranti / o interazioni. Questo test consente la caratterizzazione high-throughput di RUP, un compito che è essenziale per comprendere odorizzante / o interazioni, nonché lo sviluppo di un modello di codifica odore. Gli studi High-throughput di RUP devono affrontare tre grandi sfide. In primo luogo, OR espressi in cellule eterologhe sono stati mantenuti al pronto soccorso e successivamente degradata nel proteasoma 21,22, impedendo ai RUP di interagire con odoranti nel sistema di dosaggio 23-25. Questo problema è stato affrontato dalla scoperta di proteine ​​accessorie che facilitano l&#39;espressione sulla superficie cellulare stabile di una vasta gamma di RUP 19,26,27. Receptor-trasportatore-proteine ​​1 e 2 (RTP1 e 2) promuovere o espressione sulla superficie cellulare e l&#39;attivazione in risposta alla stimolazione odorizzante 19. Sulla base di questo lavoro, HEK293T cellule eranomodificata per esprimere stabilmente RTP1 lungo (RTP1L) e RTP2, recettore espressione di miglioramento proteina 1, e G αolf, risultante nella linea cellulare Hana3A 19,27. Inoltre, il tipo 3 recettori muscarinici (M3-R) interagisce con RUP sulla superficie cellulare e migliora l&#39;attivazione in risposta a odoranti 26. Co-trasfezione di un OR con RTP1S e M3-R in Hana3A cellule risultati nella robusta, coerente e funzionale espressione di una vasta gamma di RUP sulla superficie cellulare 27. In secondo luogo, mammifero o repertori sono abbastanza grandi. Negli esseri umani, per esempio, il repertorio OR è un ordine di grandezza più numerose di repertorio recettore gustativo, e 2 ordini di grandezza più numerose di repertorio recettore visivo. Sebbene clonazione di una singola O è un protocollo relativamente semplice, è necessaria notevole sforzo up-front per generare una libreria completa. In terzo luogo, anche se sappiamo che nella visione, di lunghezza d&#39;onda si traduce in colori ein frequenza audizione si traduce in campo, l&#39;organizzazione degli odori è poco conosciuta, rendendo difficile per i ricercatori di interpolare da un campione rappresentativo di odoranti. Anche se sono stati compiuti alcuni progressi su questo fronte 10,28, la mappa del paesaggio olfattivo rimane incompleto. Screening decine di migliaia di molecole contro centinaia di RUP è un compito arduo; schermi high-throughput in questo settore richiedono campagne accuratamente definiti. Le grandi sfide rimanenti sono quelli della logistica e dei costi, piuttosto che problemi inerenti alla tecnica. Sebbene lo screening eterologo non è stato ampiamente utilizzato per identificare ligandi da gruppi accademici, una società privata ha utilizzato la stessa tecnica per identificare ligandi per 100 RUP umani 29. Purtroppo, questi dati rimangono di proprietà. La luciferasi saggio ad alta prestazione qui descritto ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi utilizzati per valutare O attivazione. Anche se la responsabilitàses dei neuroni sensoriali olfattivi nativi sono stati misurati utilizzando elettrofisiologia e di imaging di calcio, queste tecniche hanno difficoltà a prendere in giro oltre che O porta alla risposta di un neurone causa della sovrapposizione di proprietà di risposta per i neuroni olfattivi. Anche se bussare in una GFP-etichettata tipo di recettore 30,31, offrendo recettori specifici tramite adenovirus murino neuroni olfattivi 32,33, o l&#39;esecuzione di RT-PCR dopo le registrazioni 17,24,33 può collegarsi registrazioni tipi di recettori singoli, questi metodi sono a bassa velocità e non adatto per schermi di grandi dimensioni. Sistemi di screening eterologhi sono più scalabili, e due forme principali si trovano in letteratura: i giornalisti di via cAMP e inositolo trifosfato (IP3) giornalisti di via. Dopo stimolazione odore, RUP attivano una cascata di segnali G αolf trasduzione che provoca la produzione di AMP ciclico (cAMP) 12. Mediante co-trasfezione una lucciola gene reporter luciferasi sotto il controllo di acAMP risposta elemento (CRE), produzione luciferasi può essere misurata in funzione della risposta odore, permettendo la quantificazione di OR attivazione. O attivazione può anche essere collegata al percorso IP3 mediante co-esprimono proteine ​​G come G α15/16 o un G α15-OLF chimera 24,25,34. Abbiamo scelto il saggio qui presentato sulla base di tre fattori: (1) la co-espressione di RTP1 con i recettori olfattivi Rho-contrassegnate migliora l&#39;espressione di recettori olfattivi sulla superficie cellulare 19,27; (2) l&#39;uso di un gene reporter cAMP-reattivo consente la misurazione di OR attivazione attraverso il percorso del secondo messaggero canonica; e (3) il saggio è adatto agli schermi high-throughput. Questo saggio luciferasi ad alta produttività è applicabile ad una varietà di pregevoli studi al campo dell&#39;olfatto. In primo luogo, un gran numero di RUP può essere proiettato contro un singolo odorante per determinare lo schema di attivazione recettore di un spodorizzante ecific. Questo tipo di studio ha identificato OR7D4 come OR responsabile per rispondere alla steroide androstenone odorizzante 8. Viceversa, uno o potrà essere schermato contro un pannello di odoranti per determinare il profilo di risposta recettore 10. Quando candidato olfattivo odorizzante / O coppie sono identificati tramite questi schermi, interazione può essere confermata effettuando un esperimento dose risposta esaminando la risposta del OR a concentrazioni crescenti di odorizzante. Curve dose-risposta possono anche valutare come variazione genetica in un OR colpisce in vitro risposta odorizzante 8,9,11,35, e questi studi possono essere esteso a interspecifica o variazione, consentendo l&#39;esame dell&#39;evoluzione del recettore attraverso le specie e le mutazioni causali nell&#39;evoluzione 36,37, infine, questo saggio può essere utilizzato per lo screening di antagonisti odori che sono in grado di antagonizzare o la risposta ad una particolare odorizzante per una coppia odorizzante / ricevitore conosciuto 38,39. In sintesi, questo alto-Capacità saggio luciferasi è applicabile ad una serie di studi che aiuteranno caratterizzano o pattern di attivazione e fornire una migliore comprensione della codifica odore nel sistema olfattivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="685">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Hana3A cells</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">RTP1S-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">M3-R-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pCRE-luc</td>
			<td style="width:135px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">219076</td>
			<td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pSV40-RL</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2231</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Media, Eagle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4655</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp;region=US">MEM</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td><a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">Trypsin</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">CD293</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11913-019</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">96 well PDL white/clear plate</td>
			<td style="width:135px;">BD BioCoat</td>
			<td style="width:119px;">356693</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2980</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&amp;__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&amp;__utmx=-&amp;__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy S2&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SLAD</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Gen5</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIOSTACK</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">BIOSTACK2WR</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Multiflo</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">MFP</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4414</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips ViaFlo96</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips 384 XYZ</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6403</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384ViaFlo</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td>6030</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740797.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp;region=US">DMSO</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-CN100-0010</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity

Odoranti di creare modelli unici e sovrapposte di attivazione del recettore olfattivo, permettendo una famiglia di circa 1.000 murino e 400 recettori umani di riconoscere migliaia di odoranti. Ligandi odoranti sono stati pubblicati da meno di 6% di recettori umani 1-11. Questa mancanza di dati è dovuta in parte alle difficoltà funzionalmente esprimono questi recettori in sistemi eterologhi. Qui, descriviamo un metodo per esprimere la maggior parte della famiglia dei recettori olfattiva in cellule Hana3A, seguita da valutazione ad alta velocità di attivazione del recettore olfattivo utilizzando un saggio reporter di luciferasi. Questo test può essere utilizzato per (1) pannelli schermo di odoranti contro pannelli di recettori olfattivi; (2) confermare l&#39;interazione odorizzante / recettore tramite curve dose-risposta; e (3) confrontare i livelli di attivazione del recettore tra le varianti del recettore. Nei nostri dati di esempio, 328 recettori olfattivi sono stati proiettati contro 26 odoranti. Coppie di odorizzante / recettori con diversi punteggi di risposta erano selezioneted e testato in dose-risposta. Questi dati indicano che uno schermo è un metodo efficace per arricchire per coppie odorizzante / recettore che passeranno un esperimento dose-risposta, cioè recettori che hanno una risposta bona fide a un odorizzante. Pertanto, questa high throughput saggio luciferasi è un metodo efficace per caratterizzare olfattiva recettori-un passo essenziale verso un modello di codifica odore nel sistema olfattivo dei mammiferi.

Uno schermo primario testato 328 RUP contro 26 odori ad una concentrazione di 100 mM. Questa concentrazione di odore è stato dimostrato per attivare efficacemente una grande proporzione di RUP con ligandi noti 10. In primo luogo, l&#39;attività della luciferasi normalizzata è stata calcolata dividendo la lettura luciferasi lucciola dalla lettura Renilla luciferasi. Successivamente, i valori baselined sono stati calcolati sottraendo le letture luciferasi normalizzati per il controllo senza odore da...

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High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Olfattive pattern di attivazione del recettore codificano identità odore, ma la mancanza di dati pubblicati identificativi ligandi odoranti per i recettori olfattivi dei mammiferi ostacola lo sviluppo di un modello completo di codifica odore. Questo protocollo descrive un metodo per facilitare l&#39;identificazione ad alta produttività di ligandi dei recettori olfattivi e quantificazione di attivazione del recettore.

High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

high-throughput-analysis-mammalian-olfactory-receptors-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K Views.  Monell Chemical Senses Center.  Olfattive pattern di attivazione del recettore codificano identità odore, ma la mancanza di dati pubblicati identificativi ligandi odoranti per i recettori olfattivi dei mammiferi ostacola lo sviluppo di un modello completo di codifica odore. Questo protocollo descrive un metodo per facilitare l'identificazione ad alta produttività di ligandi dei recettori olfattivi e quantificazione di attivazione del recettore. 