Diese Arbeit wurde von DC013339 R01, R03 DC011373 und Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014 unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde mit dem Monell Chemosensorische Receptor Signaling Core unterstützt wird, die zum Teil durch Mittel aus dem NIH-NIDCD Kern Zuschuss P30 DC011735. Die Autoren danken C. Sezille für die Hilfe bei der Datenerhebung.

1. Hana3A Kultur der Zellen <ol><li> Vorbereitung M10 Medium durch Hinzu Minimum Essential Medium (MEM) mit 10% (v / v) FBS. </li><li> Kultur Wartung <ol><li> Pflegen Zellen in M10-Medien. HINWEIS: Die Expressionsvektoren für RTP1L, RTP2, REEP1 und G αolf verleihen Puromycinresistenz zu Hana3A Zellen, aber die Aufrechterhaltung der Zellen mit diesem Antibiotikum nicht wesentlich beeinflusst Testergebnisse. </li><li> Subkultur in einem Verhältnis von 1:8 in 10 cm Schalen alle 2-3 Tage. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Plating Zellen für Transfektion <ol><li> Saugen Sie Medien aus einer 100% konfluente 10 cm Schüssel mit Hana3A Zellen. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml PBS, wirbeln die Schüssel und Absaugen des PBS. </li><li> 3 ml 0,05% Trypsin / EDTA und warten Zellen zu dissoziieren (ca. 1 min). </li><li> Trypsin inaktivieren durch Zugabe von 5 ml M10 und brechen Zellklumpen durch Verreiben etwa 10x &amp;# 160, mit einer 10 ml Pipette. Pipette vorsichtig, damit die Einführung von Luftblasen in den Medien. </li><li> Für jede Platte mit 96 Vertiefungen, 1 ml der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge bei 200 × g für 5 Minuten und Aspiration des Überstands ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 6 ml M10 pro 1 ml Zellen in Schritt 2.5 überführt. </li><li> Je 50 ul der Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen beimpft und über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 3. Transfektion von Geruchsrezeptoren <ol><li> Herstellung von Plasmid-DNA <ol><li> Bereiten Plasmid-DNA über eine Endotoxin-freies Protokoll. HINWEIS: Verwenden Sie Plasmid-DNA-Präparation Kits als &quot;Endotoxin-frei&quot;, oder fügen Sie eine Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt an das Plasmid-DNA-Präparation Protokoll. </li><li> Verdünnte DNA auf eine Konzentration von 100 ng / ul in TE-Puffer. </li></ol></li><li> Beachten plattierten Zellen (Schritt 2.7), um eine ordnungsgemäße Konfluenz von Nähe gewährleistenTely 30-50% pro Vertiefung und zum Inkubator. ANMERKUNG: Dies Konfluenz nicht optimal für die Lipid-Transfektionsreagenz, eine Konfluenz von 30-50% in diesem Schritt für die Messung optimale Luciferase-Aktivität 24 Stunden nach der Transfektion. </li><li> Vorbereitung der Transfektion Mix <ol><li> Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc und pSV40-RL Plasmide in MEM-Medium pro den in Tabelle 1 aufgeführt, um die Plasmid-Mix machen Volumen (Volumen sind pro 96-Well-Platte). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> Plasmid-Mix </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> pro Well </td><td> pro 96-Well-Platte </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 ul </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-pCI </td><td> 2,5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> pCRE-luc </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Plasmid-Mix-Komponenten. Per gut und pro 96-Well-Platte Mengen RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc und pSV40-RL und MEM. </li><li> Für jede 96-Well-Platte, verdünnte 18 ul Lipid-Transfektionsreagenz in 450 ul MEM-Medium. </li><li> Pipette Plasmid-Mix (aus Schritt 3.3.1), Rhodopsin-markierten Geruchsrezeptor in den PCI-Plasmid (Rho-oder-PCI) und Lipid Transfektionsmischung (aus Schritt 3.3.2) die Komplexe in detaillierte, um <sTrong&gt; Tabelle 2. Mischen Sie die Lösung durch Verreiben und bei Raumtemperatur für 15 min. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von M10 nach Tabelle 2. HINWEIS: Diese Reaktion ist zeitempfindlich und sollte nicht erlaubt werden, für mehr als 30 Minuten fortsetzen. Die gut + 10% Berechnung ist wichtig, eine ausreichende Lautstärke für nachfolgende Schritte zu gewährleisten. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> Komplex </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> pro Well </td><td> pro Well + 10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Plasmid-Mix </td><td> 4.2 ul </td><td> 4,58 ul </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OR-pCI </td><td> 0,05 ng </td><td> 0,06 ng </td></tr><trheight = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> Lipid Transfektionsmischung </td><td> 4.2 ul </td><td> 4,58 ul </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41,7 ul </td><td> 45.83 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Komplexe Bauteile. Per gut und pro Well + 10% Volumen von Plasmid-Mix (Tabelle 1), Geruchs-Rezeptor-Plasmid (Rho-oder-PCI) und Lipid-Transfektion Mix. M10 wird zugegeben, um die Reaktion nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur abzuschrecken. </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Tippen Sie die Medien auf den Zellplatten. </li><li> Je 50 ul komplexer in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 4. Geruchsstimulation <ol><li> Beachten Sie die transfizierten Zellen, um eine ordnungsgemäße Konfluenz von 50-80% pro Vertiefung zu gewährleisten und zum Inkubator. HINWEIS: Wenn Zellen sind weniger als 50% Konfluent, Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase-Messungen können zur Messung der Rezeptoraktivierung zu niedrig sein. Betrachten Sie das Verwerfen der Platte. </li><li> Bereiten 1 M Stammlösungen der einzelnen Geruch in DMSO. </li><li> Bereiten Duftstimulation Lösungen in CD293 Medium. <ol><li> Für Screening-Experimenten, verdünnte Stammlösung von Geruch bis 100 um. Auch (nur CD293), um sich für oder Hintergrund Aktivierung steuern bereiten eine no-Geruchskontrolle. HINWEIS: Für die Screening-Experimenten, die jeweils OR / Geruch Paar wird nur einmal pro Experiment getestet. Da einige Geruch Diffusion über Brunnen möglich ist, empfiehlt es sich, mit einem Geruchsstoff für jede Platte zu stimulieren. </li><li> Für Dosis-Wirkungs-Experimente, bereiten sieben 10-fach serielle Verdünnungen der Geruch Stammlösung in dreifacher Ausfertigung ab 1 mM für jeden Rezeptor. Auch bereiten die gleichen Geruch Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung für Leervektor-transfizierten Zellen, um für die Geruchs Hintergrund Aktivierung steuern. HINWEIS: Für die Dosis-Wirkungs-Experimenten, die jeweils odor Konzentration Behandlung sollte in dreifacher Ausführung durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Tippen Sie die Medien auf den Zellplatten. </li><li> Je 25 ul der Geruchsstimulationslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 4 Stunden. </li></ol> 5. Messen oder Aktivität über Luciferase Assay <ol><li> Resuspendieren Glühwürmchen-Luciferase Substrat pro Anweisungen des Herstellers und bei -80 ° C </li><li> Tauwetter 1 ml Luciferase Substrat pro 96-Well-Platte. </li><li> Bereiten Sie frischen Glühwürmchen-Luciferase-Reaktion Quencher und Renilla Luciferase-Substrat-Reagenz (5 ul Luciferase Löscher / Renilla Luciferase Substrat pro 1 ml Puffer). Anmerkung: Etwa 1 ml Reagenz pro Platte mit 96 Vertiefungen benötigt. </li><li> Bereiten Sie die lumineszierenden Mikroplatten-Reader. Öffnen Sie den Mikroplatten-Reader-Software. Innerhalb des Systems Symbol: <ol><li> Unter der &quot;Pre-Heizung&quot; Tab, markieren Sie das Kästchen für &quot;ON&quot; und stellen Sie die Temperatur der Maschine bis 25 °, C. </li><li> Unter dem Reiter &quot;Spender&quot;, Prime jeder Spender mit 1000 ul von 70% Ethanol, gefolgt von 1.000 ul destilliertem Wasser. HINWEIS: Verwenden Sie separate Teilmengen von Alkohol und Wasser für jeden Spender. Ethanol wird verwendet, um die Spender zu desinfizieren und Wasser entfernt das restliche Ethanol. </li><li> Prime jeder Spender mit 1500 ul von Luft (Entfernen von Flüssigkeit Spender). HINWEIS: Grundierung mit Luft sorgt dafür, dass Luciferase-Substrate nicht mit Restwasser verdünnt. </li><li> Prime Spender 1 mit 1080 ul von Firefly Luziferase-Substrat (aus Schritt 5.2). Prime Spender 2 mit Renilla-Luciferase-Substrat (aus Schritt 5.3). HINWEIS: Achten Sie darauf, Quer verunreinigen die Luciferase-Substraten. Grundierung mit Luciferase-Substrate füllt den toten Raum in den Reagenz-Spender. </li></ol></li><li> Das folgende Protokoll eingestellt, um sowohl Glühwürmchen-und Renilla-Luciferase Lumineszenz lesen. Innerhalb der mit dem Mikroplatten-Reader, un zugehörige SoftwareDer das Menü &quot;Datei&quot;, klicken Sie auf &quot;Neue Aufgabe&quot;. Markieren Sie &quot;Protokolle&quot; und klicken Sie auf &quot;Create New&quot;. Im nächsten Fenster, sollte der Kreis neben &quot;Standard Protocol&quot; ausgewählt werden. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Klicken Sie doppelt auf &quot;Vorgehensweise&quot; auf der linken Seite des Bildschirms. <ol><li> Dispense 10 ul von Firefly Luziferase-Substrat in alle Vertiefungen mit Spender 1. Unter dem Menü &quot;Aktionen&quot; auf &quot;Dispense&quot;. Im Fenster &quot;Dispense Step&quot;, ein: &quot;Spender&quot;, um ein &quot;Priming&quot;, um keine &quot;Dispense Volume&quot; auf 10 ul und &quot;Rate&quot; zu 225 ul / Sek. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden. Unter dem Menü &quot;Aktionen&quot; auf &quot;Shake&quot;. Im Fenster &quot;Shake-Step&quot;, stellen Sie &quot;Intensity&quot; auf Mittel-und &quot;Dauer&quot;, um 00.30 Uhr MM: SS. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Lesen Sie die Lumineszenz von allen Wells für 0,5 Sekunden pro Vertiefung. Unter dem Menüpunkt &quot;Aktionen&quot;, klicken Sie auf &quot;Lesen&quot;;. Im Fenster &quot;Lesen Step&quot;, ein: &quot;Erkennungsmethode&quot;, um Lumineszenz &quot;Lesen Type&quot; Endpoint &quot;Integrationszeit&quot; bis 00.00.50 MM: SS: ss &quot;Filter Sets&quot; auf 1 &quot;Emission&quot; Hole, &quot;Optik-Position&quot; zwischen oben, &quot;Gain&quot; auf 135, und &quot;Read Höhe&quot; zu 1,00 mm. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Dispense 10 ul Renilla Luciferase Substrat in alle Vertiefungen mit 2 Spender. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.1, außer set &quot;Spender&quot; bis 2. </li><li> Schütteln Sie Platte für 30 Sekunden. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.2. </li><li> Lesen Lumineszenz von allen Wells 0,5 Sekunden pro Vertiefung. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.3. </li></ol></li><li> Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in der Mikroplatten-Reader. Starten Sie das Programm in Schritt 5.5 festgelegt, um die Platte Lumineszenz lesen. </li><li> Reinigen Sie die Reagenzspender Pumpen. Von der System-Symbol unter der Registerkarte &quot;Spender&quot;: <ol><li> Purge 1000 ul firefly Luciferase Substrat aus der Firefly Luziferase Spender in eine Sammelröhre. HINWEIS: Firefly Luziferase kann bei -80 ° C gelagert und wiederverwendet werden. </li><li> Prime jedes Spenders mit 1000 &amp;mgr; l destilliertes Wasser und anschließend mit 1000 &amp;mgr; l 70% Ethanol, und schließlich 1,500 ul Luft (Entfernen von Flüssigkeitsabgabevorrichtungen). HINWEIS: Wasser entfernt Luciferase-Substrate aus der Reagenzienpumpen, Ethanol desinfiziert und Luft trocknet restliche Ethanol. </li></ol></li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Data Export <ol><li> In der Mikroplatten-Reader-Software, klicken Sie doppelt auf &quot;Report / Export Builders&quot; auf der linken Seite des Bildschirms. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Neue Export to Excel&quot; und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Markieren Export1 und klicken Sie auf &quot;Bearbeiten&quot;. <ol><li> Unter &quot;Inhalt&quot; check &quot;Systembeschreibung&quot;, &quot;Verfahren&quot;, &quot;Platten-Beschreibung&quot; und &quot;Plate Layout-Matrix&quot;. Include &quot;Rohdaten&quot; einnd &quot;Berechnete Daten&quot;. </li><li> Unter &quot;Workflow&quot;, aktivieren Sie &quot;Automatisch ausführen nach Abschluss des Verfahrens&quot;. Unter Exportmodus, aktivieren Sie &quot;Alle Platten in der gleichen Arbeitsmappe&quot; und &quot;Wie ein neues Arbeitsblatt&quot;. </li><li> Unter &quot;Datei&quot; wählen Sie den Dateinamen Format und Speicherort der Datei, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Schließen Sie das Fenster &quot;Report / Export Builders&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Um normalisierte Luciferase-Werte zu erhalten, teilen Sie die Glühwürmchen-Luciferase Lumineszenz Lektüre für jeden gut (Schritt 5.6.3) durch die Renilla-Lumineszenz-Lektüre für jeden gut (Schritt 5.6.6). </li></ol>

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S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates.">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li><li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor.">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li><li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants.">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li><li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+ROC+analysis.">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li><li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors.">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li><li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells.">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Riechstoffidentität wird von Geruchsrezeptoraktivierungsmuster codiert, sondern Rezeptoraktivierungsmuster, einschließlich der Rezeptoren aktiviert werden und zu welchem ​​Grad, für weniger als 6% der menschlichen Geruchsrezeptoren 1-11 bekannt. Anstrengungen zur Geruchsrezeptoren charakterisiert durch ihre arbeitsintensive Verfahren und Anwendbarkeit auf nur eine Teilmenge des olfaktorischen Rezeptorfamilie 17,23,24,33,34 beschränkt. Die Hana3A heterologe Expressionssystem unterstützt die...

Die Säugetierriechsystem hat die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Geruchsreize zu reagieren, so dass für den Nachweis und die Unterscheidung von Tausenden von Geruchsstoffen. Olfaktorischen Rezeptoren (OR) sind die molekularen Sensoren von den Riechzellen im Riechepithel 12 ausgedrückt. Säugetiergeruchserkennung erfolgt durch unterschiedliche Aktivierung von OR durch Geruchsstoffe, und die ODER-Gen-Familie ist umfangreich, mit rund 1.000 murinen und menschlichen Rezeptoren 400 12-16. Zurück funktionelle Analysen von OR in olfaktorischen Neuronen und in heterologen Zellen haben gezeigt, dass unterschiedliche Geruchsstoffe werden durch eindeutige erkannt, aber überlappenden Ensembles von OR 10,17-20. Passende Liganden an OPs ist entscheidend für das Verständnis der olfaktorischen Code und wesentlich für den Aufbau lebensfähige Modelle des Geruchssinns. Aufgrund von Schwierigkeiten exprimieren ORs in heterologen Systemen sowie die große Zahl der beiden Duftstoffe und ORs hat diese Daten von der f weitgehend gefehltield; ja, weniger als 6% der menschlichen OPs haben einen Liganden 1-11 veröffentlicht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Luciferase-Assays zur Geruchs / oder Wechselwirkungen charakterisieren. Dieser Test ermöglicht die Hochdurchsatz-Charakterisierung von OPs, eine Aufgabe, die für das Verständnis Geruchs / ODER Wechselwirkungen sowie die Entwicklung eines Modells der Duftkodierung ist. Hochdurchsatz-Untersuchungen der OPs stehen vor drei großen Herausforderungen. Zunächst wurden ORs in heterologen Zellen exprimiert im ER zurückgehalten und anschließend in das Proteasom abgebaut 21,22, verhindert die RUP Interaktion mit Geruchsstoffen in dem Testsystem 23-25. Dieses Problem wurde durch die Entdeckung der Hilfsproteine, die stabile Zelloberflächenexpression von einer breiten Palette von OR 19,26,27 erleichtern gerichtet. Rezeptor-Transporter-Proteine ​​1 und 2 (RTP1 und 2) fördern oder Zelloberflächenexpression und Aktivierung in Reaktion auf Geruchsstimulation 19. Basierend auf dieser Arbeit wurden HEK293T-Zellenmodifiziert, um stabil exprimieren RTP1 lang (RTP1L) und RTP2, Rezeptor Expression verstärkenden Protein 1 und G αolf, was in der Hana3A Zellinie 19,27. Darüber hinaus ist die Art 3 muskarinischen Acetylcholinrezeptors (M3-R) wirkt mit ORs an der Zelloberfläche und fördert die Aktivierung in Reaktion auf Riechstoffe 26. Co-Transfektion eines OR mit RTP1S und M3-R in Hana3A Zellen führt die robuste, konsistente und funktionelle Expression von einer breiten Palette von OPs an der Zelloberfläche 27. Zweitens Säugetier ODER Repertoires sind recht groß. Bei Menschen, zum Beispiel, ist die OR-Repertoire um eine Größenordnung zahlreicher als die Geschmacksrezeptorrepertoire und 2 Größenordnungen zahlreicher als die visuellen Rezeptor Repertoire. Obwohl das Klonen einer einzigen OR ist eine relativ einfache Protokoll wird bedeutende Vorleistungen Aufwand erforderlich, um eine umfassende Bibliothek zu erzeugen. Drittens, obwohl wir wissen, dass in der Sicht, übersetzt Wellenlänge in Farbe undVorsingen in Frequenz übersetzt in Tonhöhe, die Organisation von Gerüchen schlecht verstanden, dass es schwierig für Forscher aus einer repräsentativen Stichprobe von Geruchsstoffen zu interpolieren. Obwohl einige Fortschritte an dieser Front 10,28 erzielt wurden, bleibt die Karte des olfaktorischen Landschaft unvollständig. Screening Zehntausende von Molekülen gegen Hunderte von OPs ist eine gewaltige Aufgabe; Hochdurchsatz-Bildschirme in diesem Bereich erfordern sorgfältig definierten Kampagnen. Die wichtigsten sind die verbleibenden Herausforderungen der Logistik und Kosten und nicht als Probleme, die auf die Technik. Obwohl heterologen Screening wurde nicht häufig verwendet, um Liganden von akademischen Gruppen zu identifizieren, hat ein privates Unternehmen die gleiche Technik verwendet, um Liganden für 100 menschlichen OR 29 zu identifizieren. Leider bleiben diese Daten geschützt. Die Hochdurchsatz-Luciferase-Assay skizzierten hat mehrere Vorteile gegenüber verwendet werden, um zu beurteilen oder Aktivierung alternativer Methoden. Obwohl die Verantwortungses von nativen Riechzellen gemessen worden mit Elektrophysiologie und Kalzium-Imaging, haben diese Techniken Schwierigkeiten auseinander, die Hänseleien ODER Antwort eines Neurons aufgrund der Überlappung in Reaktion Eigenschaften für olfaktorischen Neuronen führt. Obwohl Klopfen in einem GFP-markierten Rezeptor Typ 30,31 und liefert spezifische Rezeptoren über Adenovirus olfaktorischen Neuronen murinen 32,33 oder die Durchführung der RT-PCR nach Aufnahmen 17,24,33 können Aufnahmen zu einzelnen Rezeptortypen zu verknüpfen, sind diese Methoden Niedrigdurchsatz und nicht für große Bildschirme geeignet. Heterologe Screening-Systeme sind skalierbar und zwei Hauptformen sind in der Literatur gefunden: cAMP-Weg Reportern und Inositol-Triphosphat (IP3)-Weg Reportern. Bei Geruchsstimulation, OPs aktivieren einen G αolf Übertragungssignalkaskade, die in der Produktion von zyklischem AMP (cAMP) 12 führt. Durch Co-Transfektion einer Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des NetzAMP-Response-Element (CRE), kann Luciferase-Produktion als Funktion der Geruchsreaktion gemessen werden, so dass für die Quantifizierung oder Aktivierung. Oder Aktivierung kann auch auf die IP3 Weges durch Coexpression G-Proteine, wie G α15/16 oder G α15-OLF-Chimäre 24,25,34 verbunden werden. Wir haben den Test hier dargestellt anhand von drei Faktoren ausgewählt: (1) die Co-Expression von RTP1 mit Rho-markierten Geruchsrezeptoren verbessert die Expression der olfaktorischen Rezeptoren an der Zelloberfläche 19,27; (2) Verwendung eines cAMP-responsive Reporter-Gen ermöglicht die Messung von OR-Aktivierung durch die kanonischen zweiten Messenger-Pfad; und (3) der Test ist gut geeignet, um Hochdurchsatz-Screens. Dieser hohe Durchsatz Luciferase Assay auf eine Vielzahl von Studien wertvoll Bereich des Geruchssinns. Erstens kann eine große Anzahl von OR gegen einen einzelnen Geruchsstoff um die Rezeptoraktivierung Muster für ein sp bestimmen gescreent werdenecific Riechstoff. Diese Art der Studie identifizierten OR7D4 als OR für die Reaktion auf die Steroid-Geruchsstoff Androstenon 8 verantwortlich. Umgekehrt können eine oder können gegen eine Reihe von Geruchsstoffen, um die Rezeptorantwort Profil 10 zu bestimmen, untersucht werden. Wenn Kandidaten olfaktorische Geruchs / oder Paaren über diesen Fenstern identifiziert, kann die Interaktion durch die Durchführung einer Dosis-Wirkungs-Experiment der Prüfung der Antwort des ODER steigenden Konzentrationen von Geruchs bestätigt werden. Dosis-Wirkungs-Kurven können auch beurteilen, wie genetische Variation in einem oder in vitro Geruchs Antwort 8,9,11,35 beeinflusst, und diese Untersuchungen kann zu inter ODER Variante erweitert werden, so dass für die Prüfung der Rezeptor Evolution über Arten und kausale Mutationen in der Evolution 36,37 schließlich Dieser Assay kann verwendet werden, um Geruchs Antagonisten, die in der Lage, zu antagonisieren oder die Reaktion auf einen bestimmten Duftstoff für eine bekannte Geruchs / Rezeptor-Paar 38,39 sind zu screenen. Zusammenfassend, diese hohenDurch Luciferase-Assay ist für eine Reihe von Studien, die helfen, zu charakterisieren oder Aktivierungsmuster und ein besseres Verständnis der Duftkodierung im olfaktorischen System.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="685">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Hana3A cells</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">RTP1S-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">M3-R-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pCRE-luc</td>
			<td style="width:135px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">219076</td>
			<td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pSV40-RL</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2231</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Media, Eagle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4655</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp;region=US">MEM</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td><a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">Trypsin</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">CD293</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11913-019</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">96 well PDL white/clear plate</td>
			<td style="width:135px;">BD BioCoat</td>
			<td style="width:119px;">356693</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2980</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&amp;__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&amp;__utmx=-&amp;__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy S2&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SLAD</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Gen5</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIOSTACK</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">BIOSTACK2WR</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Multiflo</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">MFP</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4414</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips ViaFlo96</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips 384 XYZ</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6403</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384ViaFlo</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td>6030</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740797.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp;region=US">DMSO</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-CN100-0010</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity

Geruchsstoffe schaffen einzigartige und überlappenden Mustern von olfaktorischen Rezeptoraktivierung, so dass eine Familie von rund 1.000 Mäuse-und 400 menschliche Rezeptoren, um Tausende von Geruchsstoffen zu erkennen. Riechstoffliganden für weniger als 6% der menschlichen Rezeptoren 1-11 erschienen. Dieser Mangel an Daten zum Teil auf Schwierigkeiten funktionell exprimieren diese Rezeptoren in heterologen Systemen. Hier beschreiben wir eine Methode für die Mehrheit der olfaktorischen Rezeptorfamilie in Hana3A Zellen, gefolgt von Hochdurchsatz-Beurteilung der olfaktorischen Rezeptoraktivierung mit Hilfe eines Luciferase-Reporter-Assay zum Ausdruck. Dieser Test kann (1) Bildschirm-Panels von Geruchsstoffen gegen Platten von olfaktorischen Rezeptoren verwendet werden; (2) bestätigen Geruchs / Rezeptor-Interaktion über Dosis-Wirkungs-Kurven; und (3) Vergleich der Rezeptoraktivierung Niveaus unter Rezeptorvarianten. In unserem Beispieldaten wurden 328 Geruchsrezeptoren gegen 26 Geruchsstoffe untersucht. Riechstoff / Rezeptor-Paare mit unterschiedlichen Antwort-Werte waren AuswahlTed und in Dosis-Wirkungs-getestet. Diese Daten zeigen, dass ein Bildschirm ist eine wirksame Methode, um Geruchs / Rezeptor-Paare, die eine Dosis-Wirkungs-Experiment passieren wird, dh Rezeptoren, die einen echten Reaktion auf einen Duftstoff haben zu bereichern. Daher ist dieses Hochdurch Luciferase-Assay eine effektive Methode zur Geruchsrezeptoren, einen wesentlichen Schritt in Richtung eines Modells der Duftkodierung im Säugetierriechsystem charakterisieren.

Eine primäre Bildschirm getestet OR 328 gegen 26 Gerüche in einer Konzentration von 100 uM. Diese Geruchskonzentration wurde gezeigt, dass ein großer Teil der ORs mit bekannten Liganden 10 effektiv aktivieren. Zunächst wurde normalisierte Luciferase-Aktivität durch Division der Glühwürmchen-Luciferase Lesung des Renilla-Luciferase Lesen berechnet. Als nächstes wurden als Baseline-Werte durch Subtrahieren der normalisierten Messwerte für die Luciferase keine Geruchskontrolle aus den normalisi...

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High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Riechrezeptoraktivierungsmuster kodieren Geruch Identität, sondern der Mangel an veröffentlichten Daten zur Identifizierung Geruchsliganden für Säugetiergeruchsrezeptoren behindert die Entwicklung eines umfassenden Modells der Duftkodierung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Identifizierung Geruchsrezeptorliganden und Quantifizierung der Rezeptoraktivierung zu erleichtern.

Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K Aufrufe.  Monell Chemical Senses Center.  Riechrezeptoraktivierungsmuster kodieren Geruch Identität, sondern der Mangel an veröffentlichten Daten zur Identifizierung Geruchsliganden für Säugetiergeruchsrezeptoren behindert die Entwicklung eines umfassenden Modells der Duftkodierung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Identifizierung Geruchsrezeptorliganden und Quantifizierung der Rezeptoraktivierung zu erleichtern. 

Serie: High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Slice-Vorbereitung, Organotypische Gewebekulturen und Luciferase Aufzeichnung von Clock Gen-Aktivität in den Nucleus suprachiasmaticus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatisierte Hochdurchsatz-Analysen in Behavioral Zebrafischlarven

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Imaging und FIMtrack: Zwei neuer Instrumente, die Hochdurchsatz und Kosteneffektiv Locomotion Analyse

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to perform receptor autoradiographic mapping.
Tissue specimens are harvested and stored at -80 &#176;C. A cryostat is used to coronally section the tissue (brain) and thaw-mount the sections onto charged slides. The slide-mounted tissue sections are incubated in 125I-SI-Ang II to radiolabel Ang II receptors. Adjacent slides are separated into two sets: &#39;non-specific binding&#39; (NSP) in the presence of a receptor saturating concentration of non-radiolabeled Ang II, or an AT1 Ang II receptor subtype (AT1R) selective Ang II receptor antagonist, and &#39;total binding&#39; with no AT1R antagonist. A saturating concentration of AT2 Ang II receptor subtype (AT2R) antagonist (PD123319, 10 &#181;M) is also present in the incubation buffer to limit 125I-SI-Ang II binding to the AT1R subtype. During a 30 min pre-incubation at ~22 &#176;C, NSP slides are exposed to 10 &#181;M PD123319 and losartan, while &#39;total binding&#39; slides are exposed to 10 &#181;M PD123319. Slides are then incubated with 125I-SI-Ang II in the presence of PD123319 for &#39;total binding&#39;, and PD123319 and losartan for NSP in assay buffer, followed by several &#39;washes&#39; in buffer, and water to remove salt and non-specifically bound radioligand. The slides are dried using blow-dryers, then exposed to autoradiography film using a specialized film and cassette. The film is developed and the images are scanned into a computer for visual and quantitative densitometry using a proprietary imaging system and a spreadsheet. An additional set of slides are thionin-stained for histological comparisons.
The advantage of using receptor autoradiography is the ability to visualize Ang II receptors in situ, within a section of a tissue specimen, and anatomically identify the region of the tissue by comparing it to an adjacent histological reference section.

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Rezeptor-Autoradiographie-Protokoll für die Lokalisierte Visualisierung von Angiotensin II-Rezeptoren

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...